Abstract
विकासशील भ्रूण की ग्रसनी mesoderm सिर और दिल मांसलता के व्यापक क्षेत्रों के लिए योगदान देता है। हम (भी गिल मेहराब के रूप में जाना जाता है) ग्रसनी मेहराब के साथ सिर और दिल के पूर्वज सेल विकास पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास तरीका विकसित किया है। इस विधि का उपयोग करना, हम हाल ही में दूसरी ग्रसनी मेहराब स्वयं renewing दिल पूर्वज होता है और माउस दिल के विकास के दौरान progenitors के विस्तार के लिए एक microenvironment के रूप में कार्य करता है कि वर्णन किया है। मूल कोशिकाओं कट्टर के अंदर समान और प्रशस्त रहते हैं, लेकिन जल्दी से वे कट्टर से बाहर की ओर पलायन के रूप में कार्य cardiomyocytes हो जाते हैं। हम भी पहले ग्रसनी चाप चाप छोड़ने के बाद myotubes को जन्म दे रही मांसपेशी पूर्वज जिसमें सूचना दी। यहाँ, हम विच्छेदन और माउस भ्रूण विकसित करने से पहले और दूसरे ग्रसनी मेहराब के पूर्व vivo संस्कृति के लिए प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है। विधि सिर और दिल के पूर्वज / मांसपेशियों देव अध्ययन करने के लिए एक सक्षम बनाता हैcardiomyocyte और विस्तार पूर्व vivo में myotube गठन सहित elopment,।
Introduction
ग्रसनी mesoderm कोशिकाओं दिल के कुछ हिस्सों और ग्रसनी की मांसपेशियों को जन्म दे। भ्रूण के विकास के दौरान, दूसरा दिल क्षेत्र से multipotent हृदय पूर्वज कोशिकाओं ग्रसनी मेसोडर्म से विस्थापित और हृदय बहिर्वाह पथ और सही वेंट्रिकल आबाद है, और उनके असामान्य विकास बारीकी से जन्म दोष और जन्म defect- की जन्मजात हृदय रोग के प्रमुख कारण के साथ जुड़ा हुआ है मनुष्य 1-3 में संबंधित मौतों। हाल के अध्ययनों से ग्रसनी mesoderm mesoderm कार्डियो-craniofacial विकास 4 का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, जिससे दिल के अलावा, मांसपेशियों सिर करने के लिए योगदान देता है कि प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, प्रेरण, प्रसार, और ग्रसनी mesoderm में सिर और दिल के progenitors के भेदभाव सहित विकास की प्रक्रिया में सक्रिय जांच 5-7 के तहत कर रहे हैं।
अभी हाल तक, यह हृदय की मूल कोशिकाओं विस्तार witho गुजरना चाहे अनजान बनेउनके सेलुलर पर्यावरण के बारे में जानकारी की कमी के कारण आंशिक रूप से केन्द्र शासित प्रदेशों के भेदभाव,। हमारे हाल के एक अध्ययन ग्रसनी मेहराब हृदय और मांसपेशियों progenitors के नवीकरण के लिए एक microenvironment के रूप में सेवा और कई हफ्तों से 8 विवो पूर्व संवर्धित किया जा सकता है कि पता चलता है। इस explant विधि कार्डियो-craniofacial पूर्वज पूर्व vivo के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास और अद्वितीय अवसर प्रदान करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी चूहों जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय में जानवरों की सुविधा -accredited प्रयोगशाला पशु की देखभाल के प्रत्यायन के लिए एक अमेरिकन एसोसिएशन (AAALAC) पर बनाए रखा और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित प्रक्रियाओं के अनुसार रखे थे। संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी।
1. प्रायोगिक तैयारी
- 60 मिनट के लिए बफर फॉस्फेट समाधान में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) (पीबीएस) के साथ कोट 12 अच्छी तरह से थाली।
- कोटिंग समाधान निकालें और सीरम मुक्त मीडिया (SFM) के 200 μl जोड़ें। मीडिया की एक फिल्म पूरी सतह क्षेत्र को शामिल किया गया है कि सुनिश्चित करने के लिए थाली घुमाव।
2. सर्जिकल प्रक्रियाओं
- पूरा इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद संस्था के जानवरों की देखभाल समिति को मंजूरी दी प्रोटोकॉल का उपयोग गर्भवती चूहों euthanize।
- स्प्रे और 70% के साथ माउस के पेट क्षेत्र को साफइथेनॉल। संक्रमण से बचने के लिए सख्त बाँझ तकनीक बनाए रखें।
- का प्रयोग करें संदंश और कैंची नाभि क्षेत्र में 0.5 सेमी 2 चीरा बनाने के लिए।
- / चुटकी चीरा के ऊपर और नीचे की त्वचा हड़पने के लिए और धीरे से विपरीत दिशाओं (सिर और पूंछ) में त्वचा को खींचने के लिए उंगलियों का प्रयोग करें।
- नाभि क्षेत्र में झिल्ली में एक प्रारंभिक चीरा बनाने के लिए संदंश और कैंची का प्रयोग करें। धीरे जिससे गर्भाशय खुलासा, प्रत्येक पक्ष (2 एक्स 1.5 सेमी 2) पर अंडाशय को नाभि से वि आकार में झिल्ली में कटौती।
- इस प्रकार अंडाशय से गर्भाशय मुक्त कराने, अंडाशय तरफ डिंबवाहिनी चुटकी अंडाशय और कैंची को गर्भाशय से जोड़ने डिंबवाहिनी चुटकी संदंश का प्रयोग करें।
- धीरे संदंश के साथ डिंबवाहिनी से गर्भाशय तक खींच और कैंची से मूत्राशय क्षेत्र से मुक्त गर्भाशय में कटौती।
- संदंश के साथ डिंबवाहिनी से आगे गर्भाशय खींचो, और इस तरह मीटर से गर्भाशय को रिहा, दूसरे पक्ष पर कैंची से डिंबवाहिनी कटौतीouse।
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब गर्भाशय स्थानांतरण और सीए 2 + और 2 मिलीग्राम + साथ बाँझ ठंड पीबीएस के 20 मिलीलीटर जोड़ें। पीबीएस भ्रूण विच्छेदन के दौरान सीए 2 + और 2 मिलीग्राम + शामिल होना चाहिए।
- धीरे खून के लिए गर्भाशय को धोने के लिए 10 सेकंड के लिए ट्यूब हिला।
- संदंश के साथ ट्यूब से गर्भाशय स्थानांतरण और एक 10 मिलीलीटर डिश में डाल दिया है और गर्भाशय के शीर्ष पर ठंड पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- Stereomicroscope के तहत गर्भाशय के साथ पकवान रखें।
नोट: 2.13-2.19 एक stereomicroscope की आवश्यकता कदम। - धीरे एक एक करके गर्भाशय एक से भ्रूण के साथ एमनियोटिक थैलियों गर्भाशय खोलने के लिए और बाहर काटना संदंश के दो जोड़े का प्रयोग करें।
- ध्यान से, भ्रूण चारों ओर से घेरे है कि एमनियोटिक थैली खोलने के लिए संदंश के दो जोड़े का प्रयोग एक संदंश के साथ थैली चुटकी और धीरे भ्रूण से इसे हटाने, कट और भ्रूण से एमनियोटिक थैली जारी करने के लिए अन्य संदंश का उपयोग करें। एक विशिष्ट जीनोटाइप यदि आवश्यक हो, जीनोटाइपिंग के लिए एमनियोटिक थैली में रहते हैं।
- पक्ष पर भ्रूण प्लेस और कट्टर और ग्रसनी थैली (चित्रा 1 ए '') के बीच दिल के पीछे कट्टर एन डी 1 और 2 में कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- धीरे दूसरे पक्ष के लिए भ्रूण फ्लिप और पीछे कट्टर और ग्रसनी थैली के बीच दिल के लिए 1 और 2 के कट्टर कटौती करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- अभी भी 1 सेंट और भ्रूण के लिए 2 एन डी ग्रसनी मेहराब जोड़ने है कि हृदय बहिर्वाह पथ में कटौती करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। अभी भी भ्रूण से, एक तितली (चित्रा 1 बी) के आकार में एक साथ जुड़े होते हैं जो मेहराब, निकालें।
- चुटकी संदंश का प्रयोग करें और शेष हृदय बहिर्वाह पथ और अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर से 1 सेंट ग्रसनी मेहराब रिलीज (चित्रा 1 बी '' * धराशायी लाइन के साथ संकेत दिया और)।
- चुटकी संदंश का प्रयोग करें और शेष हृदय बहिर्वाह पथ से 2 एन डी ग्रसनी मेहराब जारीऔर अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर (चित्रा 1 बी '' धराशायी लाइन और ** के साथ संकेत दिया)।
- अलग-अलग संदंश का उपयोग मेहराब के प्रत्येक जोड़ी के स्थानांतरण और अच्छी तरह से नामित एक के बीच में दोनों मेहराब जगह है। अलग कुओं में प्लेट 1 सेंट और 2 एन डी ग्रसनी मेहराब। मेहराब 1.2 चरण में जोड़ा मीडिया की फिल्म के साथ संपर्क में हैं सुनिश्चित करें। ऐसा लगता है वे इस अवधि के दौरान कुर्की के लिए अच्छी तरह से की सतह के साथ संपर्क बनाने की जरूरत के रूप में मेहराब, मध्यम द्वारा कवर नहीं कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है।
3. ऊष्मायन और इमेजिंग
- मेहराब अच्छी तरह से सतह क्षेत्र को संलग्न करने के लिए 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में 12 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया मेहराब सेते हैं।
- धीरे अच्छी तरह से नीचे की ओर 37 डिग्री सेल्सियस SFM के 200 μl जोड़ें। मेहराब संलग्न रहते हैं कि सुनिश्चित करें और / एन ओ सेते हैं।
- अगले दिन, नेत्रहीन ग्रसनी मेहराब जुड़ा हुआ है और धीरे नीचे की ओर 37 डिग्री सेल्सियस SFM के 200 μl जोड़ रहे हैं कि जाँचअच्छी तरह से। मेहराब स्वाधीन और अस्थायी रहना है, तो धीरे ही मीडिया की एक फिल्म छोड़ दिया है जब तक मेहराब को हटाने के बिना एक विंदुक के साथ मीडिया को हटा दें। अच्छी तरह से और दोहराने कदम 3.1 के बीच में मेहराब स्थान के लिए विंदुक टिप का उपयोग करें।
- दैनिक मॉनिटर; किसी भी मीडिया सुखाया को बदलने के लिए हर 2 दिन मीडिया के ~ 100-200 μl जोड़ें।
नोट: कोशिकाओं को पलायन के बाद 24-48 घंटा कट्टर चारों ओर दिखाई देते हैं और पैदा करना और अगले 5-8 दिनों से अधिक चाप से विस्थापित करेगा। पिटाई के cardiomyocytes के 36-72 घंटा गठन 2 एन डी ग्रसनी मेहराब (चित्रा 2 बी) से मनाया जा सकता है। Myotube गठन लगाव (2A चित्रा) के बाद 1 सेंट ग्रसनी मेहराब 3-7 दिनों से देखा जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
वे पैदा करना और सिर और दिल मांसलता, क्रमशः (चित्रा 1 ए, ए 'और एक' ') बनने के लिए, 1 सेंट और 2 एन डी ग्रसनी चाप से विस्थापित के रूप में विकास के दौरान, चेहरे की मांसपेशियों और हृदय पूर्वज का पता लगाया जा सकता है। ग्रसनी मेहराब संवर्धन विस्तार पूर्व vivo में दिल और मांसपेशियों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक अनोखा तरीका प्रदान करता है। विच्छेदन और ग्रसनी मेहराब की कुर्की के बाद, संलग्न मेहराब से पलायन कोशिकाओं संस्कृति का 24-48 घंटा के भीतर देखा जा सकता है। संस्कृति myotube गठन के 3 दिन के भीतर 1 सेंट ग्रसनी मेहराब और 2 एन डी ग्रसनी मेहराब से cardiomyocyte गठन (2A चित्रा और 2 बी) से देखा जा सकता है। Cardiomyocyte गठन नेत्रहीन अनायास पलायन कोशिकाओं और / या विशिष्ट cardiomyocyte मार्करों के विश्लेषण के समूहों करार से पुष्टि की जा सकती है (जैसे, कार्डिएक Troponin टी)। Myotu/ चेहरे की मांसपेशियों गठन नेत्रहीन लंबे समय अनायास हिल कोशिकाओं और / या विशिष्ट मांसपेशी मार्कर (जैसे, Myogenin) का विश्लेषण (लंबाई में 500 माइक्रोन तक) लम्बी द्वारा मनाया जा सकता हो। चूहों में रचनात्मक-Lox प्रणाली का उपयोग करके, mesoderm संतान पूर्व vivo संस्कृति (2A चित्रा 'और 2 बी') के दौरान रचनात्मक अभिव्यक्ति पर फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से पता लगाया जा सकता है। इसी तरह, इस विधि के साथ यह ब्याज की एक विशेष जीन सशर्त बाहर खटखटाया या हम पहले से 8 के रूप में वर्णित अन्यथा जल्दी भ्रूण मारक नतीजा होगा, जो overexpressed है जिसमें संतान के भाग्य का अध्ययन करने के लिए संभव है।
चित्रा 1: माउस भ्रूण (Mesp1 रचनात्मक, Ai9) 9.5 दिनों के बाद निषेचन (E.9.5 >)। (ए) के भ्रूण की ओर छोड़ दिया। (पीए: ग्रसनी आर्क, ओटी: बहिर्वाह पथ, एल.वी.:।। बाएं वेंट्रिकल (ए ') Mesp1 वंशावली का पता लगाने; आरएफपी Mesp1 + कोशिकाओं और उनकी संतान के निशान तीर इंगित करता है आरएफपी + ओ.टी. के साथ सतत है कि PA2 में Mesp1-संतान। (ए '') धराशायी लाइन दिल को PA1 और PA2 पीछे कटौती करने के लिए जहां से संकेत मिलता है भ्रूण से विच्छेदन के बाद (बी) तितली की तरह सही है और छोड़ दिया PA1 और PA2 Fe:।। अग्रांत्र अन्तर्जनस्तर (बी। ') आरएफपी के निशान संतान Mesp1 । PA1 और PA2 में (बी '') * और ** जहां कटौती और ओटी और फ़े स्केल बार से PA1 और PA2 जारी करने के लिए इंगित करता धराशायी लाइनों के साथ:।। 500 माइक्रोन कृपया यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा।
/ 52,876 / 52876fig2.jpg "अपलोड />
चित्रा 2:। संवर्धित ग्रसनी मेहराब (ए) संवर्धित PA1 (संस्कृति के 3 दिन)। (ए ') आरएफपी PA1 में Mesp1 संतान के निशान। तीर और * जल्दी myotube गठन का संकेत मिलता है। (ए '') PA1 में आरएफपी अभिव्यक्ति की ओवरले। (बी) संवर्धित PA2 (संस्कृति के 8 दिन)। (बी ') आरएफपी के निशान PA2 में संतान Mesp1। तीर और ** (Shenje एट अल। 8 से संशोधित) cardiomyocytes के क्षेत्र की धड़कन संकेत मिलता है। (बी '') PA2 में आरएफपी अभिव्यक्ति की ओवरले। स्केल बार:। 250 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस वीडियो में, हम अलग करने और 9.5 दिन पुरानी माउस भ्रूण की पहली संस्कृति और दूसरा ग्रसनी मेहराब को कैसे प्रदर्शित करता है। ग्रसनी मेहराब, पहले मेहराब 8 में दूसरे मेहराब और सिर मांसपेशी पूर्वज अलावे embryogenesis 10,11 के दौरान दिल बनाने के लिए बहु-शक्तिशाली हृदय पूर्वज कोशिकाओं के निर्माण ब्लॉकों के होते हैं, जो विकासशील भ्रूण 9, के craniolateral ओर दिखाई देते हैं कि bulges के क्षणिक खंडित होते ।
ग्रसनी मेहराब के विच्छेदन उन्नत माउस भ्रूण विच्छेदन कौशल की आवश्यकता है। मेहराब सफलतापूर्वक इस चरणबद्ध प्रोटोकॉल का उपयोग विच्छेदित और करने के लिए पूर्व में लिपटे कुओं का तबादला कर दिया गया है एक बार, यह मेहराब नीचे क्षेत्र को देते हैं कि महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, 10% FBS के साथ हम कोट कुओं हालांकि अन्य कोटिंग सामग्री (Matrigel, जिलेटिन, फ़ाइब्रोनेक्टिन आदि) के रूप में अच्छी तरह से सीरम conta के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लगाव और मेहराब के> 75% की वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप SFM में संस्कृति द्वारा पीछाining मीडिया।
ग्रसनी मेहराब विकास के दौरान संरचनाओं की एक भीड़ के लिए primordia के रूप में कार्य करता है। ग्रसनी मेहराब की प्रारंभिक गठन (8 दिनों चूहों में निषेचन पोस्ट) के बाद, सीपीसी PA2 में विस्तार और वे इस तरह दिल को बनाए रखने के लिए आवश्यक कोशिकाओं है कि आपूर्ति सीपीसी का एक अक्षय स्रोत के रूप में सेवारत, हृदय कोशिकाओं में अंतर जहां हृदय बहिर्वाह पथ में विस्थापित विकास। ग्रसनी मेहराब अस्थायी विकासात्मक संरचनाओं (E8-11.5) और बहिर्वाह पथ में सीपीसी के प्रवास के लगभग E8-E10 से होता है) के रूप में इस तकनीक के लिए कुछ सीमाएं लाता है। सीपीसी के अध्ययन के लिए, हम E9-10 के बीच विच्छेदित ग्रसनी मेहराब का उपयोग करने की सलाह देते हैं इस स्तर पर प्रत्येक PA2 लगभग 5-800 आरएफपी + कोशिकाओं (Mesp1 वंशावली ट्रेस) होते हैं।
फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ, इस पूर्व vivo संस्कृति cardiomyocytes या myotubes मैं धड़कन के रूप में विकसित हो progenitors और उनकी भिन्नता नजर रखने के लिए हमें की अनुमति देता हैएन वास्तविक समय। इसके अलावा, इस पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली मौजूदा रचनात्मक / loxP लाइनों का उपयोग हृदय / मांसपेशी पूर्वज सेल प्रसार, प्रवास, और भेदभाव को प्रभावित करने सेल स्वायत्त और microenvironmental कारकों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जैसे, इस प्रणाली दिल / मांसपेशियों गठन और रोग का एक बेहतर समझ पैदा हो सकती है, जो हृदय / मांसपेशी पूर्वज-आला पढ़ाई की सुविधा होने की उम्मीद है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
