Abstract
Глотки мезодерма развивающихся эмбрионов способствует широких областей головы и сердца мускулатуры. Мы разработали новый метод изучения голова и сердце предшественников развития клеток с глотки арок (также известный как жаберных дуг) Экс Vivo. Используя этот метод, мы недавно рассказал, что второй глоточной дуги содержит самообновлению сердце предшественники и служит микросреды для расширения предшественников во время развития мыши сердца. Клетки-предшественники остаются недифференцированными и экспансивной внутри арки, но быстро становятся функциональные кардиомиоциты, поскольку они мигрируют из арки. Мы также сообщали, что сначала глотки арки содержит мышечные клетки-предшественники, порождающих мышечные трубки после выхода из арки. Здесь мы демонстрируем порядок вскрытия и экс естественных условиях культуры первой и второй глотки арок из развивающихся эмбрионов мыши. Метод позволяет изучать голова и сердце предшественников / Dev мышцelopment, в том числе кардиомиоцитов и myotube образования в деталях экс естественных условиях.
Introduction
Глоточные мезодермы клетки дают начало части сердца и глотки мышц. Во время эмбрионального развития, мультипотентные сердечные клетки-предшественники из второго поля сердца мигрировать из глотки мезодермы и заполнить сердца тракт оттока и правый желудочек, и их аномальное развитие тесно связано с заболеванием-врожденных сердце ведущей причиной врожденных дефектов и рождении defect- смертей у людей. 1-3 Последние исследования показали, что мезодерма глотки способствует возглавить мышцы, в дополнение к сердцу, что делает мезодерма важной частью сердечно-лицевых развития 4. Таким образом, процессы развития, включая индукционные, пролиферации и дифференцировки головных и сердечных клеток-предшественников в глотки мезодермы находятся под активным следствием 5-7.
До недавнего времени оставалось неизвестным ли клетки сердечной предшественники подвергаются расширения withoут дифференциация, частично из-за отсутствия информации об их клеточной среде. Наше недавнее исследование показывает, что глоточные арки служат микросреды для возобновления сердечных и мышечных клеток-предшественников и может быть культурным экс естественных условиях в течение нескольких недель 8. Этот метод эксплантов предлагает новый и уникальную возможность для изучения развития сердечно-черепно-лицевой предшественников бывших естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были сохранены на Американской ассоциации по аккредитации лабораторных животных (AAALAC) -accredited вивария при Университете Джонса Хопкинса и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных. Институциональная Уход и использование комитета животных (IACUC) одобрил все экспериментальные протоколы.
1. Экспериментальная Подготовка
- Шерсть 12-луночный планшет с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 60 мин.
- Удалить раствор для покрытия и добавить 200 мкл сыворотки среде (SFM). Twirl пластину, чтобы убедиться, что фильм СМИ охватывает всю поверхность.
2. Хирургические процедуры
- Эвтаназии беременных мышей, используя протокол комитета утвержден уход за животными в учреждения с последующим смещением шейных позвонков, чтобы обеспечить полное эвтаназию.
- Спрей и очистить регион живота мыши с 70%этанола. Поддерживать строгие стерильные методы, чтобы избежать загрязнения.
- Используйте щипцы и ножницы, чтобы сделать 0,5 см 2 разреза в области пупка.
- Используйте пальцы, чтобы ущипнуть / захватить кожу выше и ниже разреза и осторожно потяните кожу в противоположных направлениях (голова и хвост).
- Используйте пинцет и ножницы, чтобы сделать начальный разрез в мембране в области пупка. Аккуратно разрезать мембрану в V-формы от пупка до яичников на каждой стороне (2 х 1,5 см 2), тем самым открывая матку.
- Используйте пинцет, чтобы зажать яйцевод, соединяющий матку с яичником и ножницами, чтобы зажать яйцевод на стороне яичника, тем самым освобождая матку из яичника.
- Осторожно потяните вверх матку по маточной трубе с пинцетом и вырезать матку, свободной от региона мочевого пузыря с помощью ножниц.
- Потяните матку дальше по маточной трубе с пинцетом и сократить яйцевод с ножницами на другой стороне, тем самым освобождая матку от мУз.
- Перевести матку 50 мл пробирку и добавить 20 мл холодной стерильной PBS с Са 2+ и Mg 2+. PBS, должны содержать Ca 2+ и Mg 2+ во эмбриона рассечение.
- Слегка встряхните пробирку в течение 10 сек, чтобы вымыть матку крови.
- Передача матку из трубки с пинцетом и поместить его в 10 мл чашку и добавляют 5 мл холодной PBS в верхней части матки.
- Поместите блюдо с матки под стереомикроскопа.
Примечание: Шаги 2.13-2.19 требуется стереомикроскопа. - Используйте две пары щипцов, чтобы аккуратно открыть матку и анализировать из амниотической мешочки с эмбрионами из матки по одному.
- Используйте две пары щипцов осторожно откройте амниотической мешок, который окружает эмбрион, щепотка мешочек с одним пинцетом и аккуратно извлеките ее из эмбриона, используйте другие щипцы для резки и отпустите амниотической мешка из эмбриона. Если конкретный генотип необходимости держать амниотической мешка для генотипирования.
- Поместите эмбрион в сторону и использовать пинцет, чтобы сократить 1-й и 2-й выгибая сзади к сердцу между аркой и глотки мешок (рис 1А '').
- Аккуратно перевернуть эмбриона другой стороны и использовать пинцет, чтобы сократить 1-й и 2-й арки сзади к сердцу между аркой и глотки мешок.
- Используйте пинцет, чтобы сократить сердечный отток тракта, что до сих пор, соединяющий 1-й и 2-й глотки арки в зародыше. Удалить арки, которые по-прежнему соединены вместе в форме бабочки (рис 1B), из эмбриона.
- Используйте пинцет, чтобы зажать и отпустить 1-й глотки арки из оставшегося сердечной выносящего тракта и энтодермы передней кишки (рис 1B '' указано пунктирной линией и *).
- Используйте пинцет, чтобы зажать и отпустить 2-й глотки арки из оставшегося сердечной оттокаи энтодермы передней кишки (рис 1B '' указано пунктирной линией и **).
- Перевести каждую пару арок отдельно, используя пинцет и поместите обе арки в середине обозначенного хорошо. Пластинчатые 1-й и 2-й глотки арки в отдельных скважинах. Убедитесь, что арки находятся в контакте с пленкой носителя добавляют на стадии 1.2. Очень важно, что арки не покрываются среды, так как они должны вступить в контакт с поверхностью скважины для крепления в течение этого периода.
3. Инкубация и изображений
- Инкубируйте арки помещают в пластины 12-луночного в 37 ° C / 5% CO 2 в течение 2 часов для арки приложить к поверхности скважины.
- Осторожно добавьте 200 мкл 37 ° C SFM вниз в сторону скважины. Убедитесь, что арки остаются прикрепленными и инкубировать O / N.
- На следующий день, визуально проверить, что глоточные арки крепятся и осторожно добавить 200 мкл 37 ° C SFM вниз сторонахорошо. Если арки остаются привязан и плавающий, аккуратно удалить носитель с помощью пипетки без удаления не только арки до фильм СМИ осталось. Использование пипетки поместить арки в середине шага скважины и повторного 3.1.
- Монитор в день; добавить ~ 100-200 мкл СМИ каждый 2-ой день, чтобы заменить любой выпаривали СМИ.
Примечание: 24-48 ч после миграции клеток появляются вокруг арки и размножаться и мигрировать из арки в течение ближайших 5-8 дней. После 36-72 ч формирование избиения кардиомиоцитов можно наблюдать со 2-го глотки арки (рис 2B). Формирование Myotube можно наблюдать с 1-го глотки арки 3-7 дней после приложения (рис 2А).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время разработки, лица и мышц сердца предшественники можно проследить, как они размножаются и мигрируют из 1-й и 2-й глотки арки, чтобы стать голова и сердце мускулатуру, соответственно (рис 1А, A 'и A' '). Культивирование глотки арки предлагает уникальный способ изучения сердца и мышц развития подробно экс естественных условиях. После вскрытия и крепления глотки арок, мигрирующие клетки прикрепленными арок можно наблюдать в 24-48 ч культуры. В течение 3 дней формирования культуры myotube можно наблюдать с 1-го глотки арок и формирования кардиомиоцитов из 2-го глотки арок (рис 2А и 2В). Формирование кардиомиоцитов может быть визуально подтверждено спонтанно заражения кластеры мигрирующих клеток и / или анализа конкретных кардиомиоцитов маркеров (например, сердечного тропонина Т). Myotuбыть / формирование лица мышцы можно проверить визуально длительным удлиненные (до 500 мкм в длину) спонтанно дергающихся клеток и / или анализа специфических маркеров мышц (например, миогенин). С помощью системы CRE-LOX у мышей, мезодерма потомство может быть прослежено люминесцентных журналистами на CRE-выражения во время экс естественных условиях культуры (рис 2А "и 2В»). Кроме того, с помощью этого метода можно изучать судьбу потомства в котором конкретный интерес ген условно выбиты или избыточно экспрессируется, которые в противном случае привести к ранней эмбриональной летальности как описано ранее 8.
Рисунок 1: мышь эмбрион (Mesp1 CRE, Ai9) 9,5 дней после оплодотворения (E.9.5 >). () Левая сторона эмбриона. (ПА: Фарингальный арка, ОТ: Отток тракта, LV:.. Левый желудочек (') Mesp1 построчная оплата-след; ЗП отмечает Mesp1 + клеток и их потомство Стрелка указывает ЗП + Mesp1-потомство в PA2, непрерывная с OT. ('') Пунктирная линия указывают, где резать PA1 и PA2 кзади от сердца (B) Butterfly, как справа и слева PA1 и PA2 после вскрытия из эмбрионов FE:.. энтодермы передней кишки (В.) RFP знаки Mesp1 потомство . в РА1 и РА2 (B '') * и ** вместе с пунктирными линиями указывает, где резать и освободить PA1 и PA2 от OT и ИП Scale бар:.. 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
загрузить / 52876 / 52876fig2.jpg "/>
Рисунок 2:. Искусственный глотки арки () Искусственный PA1 (3 дня культуры). (') RFP отмечает Mesp1 потомство в РА1. Стрелки и * указывают на образование в начале myotube. ('') Наложение RFP выражения в РА1. (B), культивированный ПА2 (8 дней культуры). (В ') RFP знаки Mesp1 потомство в PA2. Стрелки и указывают ** избиение область кардиомиоцитов (модифицированный из Shenje др. 8). (В '') Наложение RFP выражения в PA2. Масштабная линейка:. 250 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео, мы демонстрируем, как изолировать и культура первой и второй глотки арки 9.5 дней эмбрионов мыши. Глоточные арки переходный Географическая выпуклости, которые появляются на craniolateral стороны развивающихся эмбрионов 9, которые содержат несколько мощных сердечной клетки-предшественники-блоки, чтобы сердце во время эмбриогенеза 10,11 -в второй арки и глава мышечных клеток-предшественников в первые арок 8 ,
Вскрытие глотки арок требует передовых эмбриона мыши навыки вскрытия. После того, как арки были успешно вскрывали с помощью этого пошагового протокол и передан для предварительного лунок, важно, что арки приложить к нижней области. В этом протоколе, мы пальто скважин с 10% FBS с последующим культуры в УЛП в результате прикрепления и роста> 75% арок, однако другие материалы покрытия могут быть использованы (Матригель, желатин, фибронектин и т.д.), а также в сыворотке Contàоцен- ками средств массовой информации.
Глоточные арки служит зачатков для множества структур в процессе разработки. После первоначального формирования глоточной арок (8 дней после оплодотворения у мышей), цена за клик расширяться в PA2 и мигрируют в сердечной оттока, где они дифференцируются в клетки сердечной, выступая тем самым в качестве возобновляемого источника цен за клик, которая поставляет клетки, необходимые для поддержания сердца рост. Как глотки арки временной развития структур (E8-11.5) и миграции цены за клик в тракте оттока происходит от примерно E8-E10), это приносит определенные ограничения на технике. Для исследований CPC, мы рекомендуем использовать глоточные арки расчлененные между E9-10, на данном этапе каждый ПА2 содержат примерно 5-800 RFP + клеток (Mesp1 построчная оплата трассировки).
С флуоресцентной маркировки, это экс естественных условиях культуры позволяет нам отслеживать развивающимся предшественники и их дифференциации в кардиомиоциты избиения или мышечных трубочек яп в режиме реального времени. Кроме того, это экс естественных условиях система культура может быть использован для изучения роли клеток автономных и микроокружения факторов, влияющих на распространение сердечной / мышцы предшественников клеток, миграцию и дифференцировку, используя существующие Cre / LoxP линии. Таким образом, эта система, как ожидается, облегчить сердечные / мышечные предшественников-нишу исследований, которые могут привести к лучшему пониманию сердца / формирования и мышечных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
- Kelly, R. G.
- Congenital Heart Defects. , CDC. Available from: http://www.cdc.gov/ncbddd/heartdefects/index.html (2013).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
