Abstract
개발 배아의 인두 중배엽은 머리와 심장 근육의 넓은 지역에 기여한다. 우리는 (또한 아가미 아치로 알려진) 인두 아치와 머리와 심장 전구 세포 개발 생체를 연구하는 새로운 방법을 개발했다. 이 방법을 사용하여, 우리는 최근 두 번째 인두 아치 자기 갱신 심장 전구 세포를 포함하고 마우스 심장 개발하는 동안 조상의 확장을위한 미세 역할을한다는 설명했다. 전구 세포는 아치 내부 분화와 광대 남아 있지만 신속하게 아치에서 마이그레이션 할 기능 심근된다. 우리는 또한 첫 번째 인두 아치는 아치를 떠난 후 myotubes에 상승을주는 근육 전구 세포를 포함보고했다. 여기, 우리는 해부와 마우스 배아 개발에서 제 1 및 제 2 인두 아치의 체외 배양 과정을 보여줍니다. 이 방법은 머리와 심장 전구 / 근육 dev에 공부를 할 수 있습니다심근 및 세부 생체에 myotube 형성을 포함 elopment.
Introduction
인두 중배엽 세포는 심장의 부분과 인두 근육 일으킨다. 배아 개발하는 동안, 두 번째 심장 분야에서 다 능성 심장 전구 세포는 인두 중배엽에서 마이그레이션 및 심장 유출 관과 우심실을 채우고, 그 이상 개발은 밀접하게 출생 결함과 출생 defect-의 선천성 심장 질환의 주요 원인과 관련된 인간 1-3 관련 사망. 최근의 연구는 인두 중배엽은 중배엽 심장 - 두개 안면 개발 4의 중요한 부분 만들기, 마음뿐만 아니라, 근육을 머리에 기여하고 있음을 증명하고있다. 따라서, 유도, 증식 및 인두 중배엽에서 머리와 심장 전구 세포의 분화를 포함하여 개발 프로세스가 활성화 조사 5-7 받고있다.
최근까지, 심장 전구 세포가 팽창 witho를 받아야하는지 여부 알려지지그들의 셀룰러 환경에 대한 정보의 부족으로 인해 부분적 UT 분화. 우리의 최근의 연구는 인두 아치가 심장과 근육 조상의 갱신을위한 미세 역할을하고 몇 주에 걸쳐 8 생체 전 배양 될 수 있음을 시사한다. 이 이식편 방법은 심장 - 두개 안면 전구 세포 생체의 개발을 연구하는 새롭고 독특한 기회를 제공합니다.
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Protocol
모든 마우스는 존스 홉킨스 대학의 동물 시설을 -accredited 실험 동물 관리의 인증을위한 미국 협회 (AAALAC) 유지 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설명 된 절차에 따라 수용했다. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 모든 실험 프로토콜을 승인했다.
1. 실험 준비
- 60 분 동안 인산염 완충 용액에 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (PBS)와 코트 12 웰 플레이트.
- 코팅 용액을 제거하고 혈청이없는 미디어 (SFM)의 200 μl를 추가합니다. 미디어 막이 전체 표면 영역을 커버하는지 확인 접시 돌리기.
2. 외과 적 치료
- 완전한 안락사을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음에 기관의 동물 관리위원회 승인 프로토콜을 사용하여 임신 쥐를 안락사.
- 스프레이 70 %와 마우스의 배꼽 지역을 청소에탄올. 오염을 방지하기 위해 엄격한 무균 기술을 유지한다.
- 사용 집게와 가위는 배꼽 부위에 0.5 cm (2) 절개를합니다.
- / 핀치 절개 위 아래 피부를 잡아 부드럽게 반대 방향 (머리와 꼬리)에서 피부를 당겨 손가락을 사용합니다.
- 배꼽 부위에 막에서 초기 절개를 집게와 가위를 사용합니다. 부드럽게하여 자궁을 드러내는, 각면 (2 × 1.5 cm 2)에 난소에 배꼽에서 V 자형의 막을 잘라.
- 따라서 난소에서 자궁을 확보, 난소 측의 난관을 끼지 난소와 가위로 자궁을 연결하는 난관이 끼지 집게를 사용합니다.
- 부드럽게 집게로 난관에 의한 자궁을 당겨 가위로 방광 지역에서 무료로 자궁을 잘라.
- 집게로 난관에 의해 추가로 최대 자궁를 당기고하여 M에서 자궁을 해제, 다른 측면에서 가위로 난관을 잘라여러개.
- 50 ML 튜브에 자궁을 전송하고 칼슘과 마그네슘 2+와 살균 차가운 PBS의 20 ㎖를 추가합니다. PBS는 배아 해부하는 동안 칼슘과 마그네슘을 2 + 포함해야합니다.
- 조심스럽게 피를 자궁을 씻어 10 초 동안 튜브를 흔들.
- 집게와 튜브에서 자궁을 전송하고 10 ml의 접시에 배치하고, 자궁의 상단에 차가운 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다.
- 실체 현미경 하에서 자궁과 접시를 놓습니다.
참고 : 2.13-2.19는 실체 현미경을 필요로 단계. - 조심스럽게 하나 하나 자궁에서 태아와 양수 주머니를 자궁을 열고 밖으로 해부 포셉 두 쌍을 사용합니다.
- 조심스럽게 배아를 둘러싸고있는 양막을 열 포셉 두 쌍을 사용하여 하나의 집게로 주머니를 꼬집어 부드럽게 배아에서 분리, 절단 및 배아에서 양막 낭을 해제하기 위해 다른 집게를 사용합니다. 특정 유전자형이 필요한 경우, 유전자형에 대한 양막 낭을 유지.
- 측면에있는 배아를 놓고 아치와 인두 주머니 (그림 1A '') 사이에 마음에 후방 아치 차 1 차 및 2를 잘라 집게를 사용합니다.
- 조심스럽게 다른 측면으로 배아를 뒤집어 뒤쪽 아치와 인두 주머니 사이의 심장에 1, 2 아치를 잘라 집게를 사용합니다.
- 아직 1 차 및 배아에 2 차 인두 아치를 연결하는 심장 유출 관을 잘라 집게를 사용합니다. 여전히 배아에서 나비 (그림 1B)의 형태로 함께 부착 된 아치를 제거합니다.
- 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관 및 foregut 내배엽에서 1 차 인두 아치를 해제 (그림 1B ''* 점선으로 표시하고).
- 핀치 집게를 사용하고 나머지 심장 유출 관에서 2 차 인두 아치를 해제및 foregut의 내배엽 (그림 1B ''점선과 **로 표시).
- 별도로 집게를 사용하여 아치의 각 쌍을 전송하고 잘 지정의 중간에 두 아치를 배치합니다. 별도의 우물에 플레이트 1 차와 2 차의 인두 아치. 아치 단계 1.2에 추가 된 미디어의 필름과 접촉에 있는지 확인하십시오. 그것은 그들이이 기간 동안 부착을위한 우물의 표면과 접촉을해야으로 아치가 매체에 의해 포함되지 않는 것이 중요합니다.
3. 보육 및 이미지
- 아치 웰 표면적에 첨부 2 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 12 웰 플레이트에 도금 아치를 부화.
- 부드럽게 잘 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가합니다. 아치가 부착 된 상태를 유지하는지 확인하고 / N을 O를 품어.
- 다음 날, 시각적으로 인두 아치가 연결 부드럽게의 측면 아래로 37 ° C SFM 200 μl를 추가하고 있는지 확인잘. 아치가 부착되지 않은 부동 남아있는 경우, 부드럽게 전용 미디어의 필름이 남아 때까지 아치를 제거하지 않고 피펫 용지를 제거합니다. 잘 단계를 반복 3.1의 중앙에 아치를 배치 피펫 팁을 사용합니다.
- 매일 모니터; 어떤 미디어를 증발 대체하기 위해 모든 2 일 미디어 ~ 100 ~ 200 μl를 추가합니다.
참고 : 셀을 마이그레이션 한 후 24 ~ 48 시간이 아치 주위에 표시하고 증식하고 다음 5-8일을 통해 아치에서 마이그레이션합니다. 구타 심근의 36-72 시간의 형성은 2 차 인두 아치 (그림 2B)에서 관찰 할 수 후. Myotube 형성은 첨부 파일 (그림 2A) 후 1 차 인두 아치 3~7일에서 관찰 할 수있다.
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Representative Results
그들은 증식과 머리와 심장 근육, 각각 (그림 1A, '과'을 ')되고, 1 차와 2 차의 인두 아치에서 마이그레이션으로 개발하는 동안, 얼굴 근육과 심장 전구 세포는 추적 할 수 있습니다. 인두 아치를 배양하는 세부 생체 심장과 근육 발달을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다. 해부 및 인두 아치의 부착 후, 부착 아치에서 마이그레이션 세포 배양의 24 ~ 48 시간 내에 관찰 할 수있다. 문화 myotube 형성 3 일 이내에 1 차 인두 아치와 2 차의 인두 아치에서 심근 형성 (그림 2A와 2B)에서 관찰 할 수있다. 심근 형성이 시각적으로 자발적 이주 세포 및 / 또는 특정 심근 마커 분석의 클러스터를 신축시켜 확인할 수있다 (예를 들어, 심장 트로포 닌 T). Myotu/ 얼굴 근육 형성을 육안으로 긴 자발적 연축 세포 및 / 또는 특정 근육 마커 (예 오게 닌)의 분석 (길이는 500㎛까지) 신장에 의해 관찰 될 수있다. 마우스에서 LOX-CRE 시스템을 사용하여, 중배엽 자손은 체외 배양 (도 2A '및 2b') 중에 CRE-식에 의해 형광 리포터 추적 될 수있다. 마찬가지로,이 방법으로는 관심의 특정 유전자가 조건부로 기절 또는 우리가 이전에 8 설명 된대로, 그렇지 않으면 초기 배아 치사 초래하는 과발현되는 것을 특징으로하는 자손의 운명을 연구하는 것이 가능하다.
그림 1 : 마우스 배아 (Mesp1의 CRE, Ai9) 9.5 일 포스트 수정 (E.9.5 >). () 배아의 측면을 떠났다. (PA : 인두 아치, OT : 유출 경로, LV :.. 좌심실 (A ') Mesp1의 계보 추적, RFP가 Mesp1 + 세포와 그 자손을 표시 화살표가 표시 RFP + 구약과 연속 PA2에 Mesp1-자손. ( '') 점선 심장 PA1과 PA2 후방을 잘라 위치를 표시 배아에서 절개 후 (B) 나비처럼 좌우 PA1과 PA2를 FE를 :.. Foregut 내배엽을 (나. ') RFP 표시가 자손을 Mesp1 . PA1과 PA2에 (B '') * 및 ** 어디 잘라 구약과 FE 스케일 바에서 PA1과 PA2를 해제 할 것을 나타냅니다 점선과 함께 :.. 500 μm의 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.
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그림 2 :. 교양 인두 아치 (A) 교양 PA1 (문화 3 일). (A ') RFP가 PA1에 Mesp1 자손을 표시합니다. 화살표와 * 초기 myotube 형성을 나타냅니다. ( '') PA1에서 RFP 발현의 오버레이. (B) 배양 PA2 (문화의 팔일). (B ') RFP 마크 PA2에 자손을 Mesp1. 화살표와 **는 (Shenje 등. 8에서 수정) 심근의 영역을 치고 나타냅니다. (B ') PA2에 RFP 발현의 오버레이. 스케일 바 :. 250 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 비디오에서는, 우리는 분리하고 9.5 일 이전 마우스 배아의 첫 번째 문화와 두 번째 인두 아치하는 방법을 보여줍니다. 인두 아치, 첫 번째 아치 8에서 두 번째 아치와 머리 근육 전구 세포 -in 배아 10, 11시에 마음을 만들기 위해 멀티 강력한 심장 전구 세포 - 빌딩 블록을 포함하는 개발 배아 (9)의 craniolateral 측면에 표시 부푼를 과도 분할된다 .
인두 아치 해부 고급 마우스 배아 해부 기술이 필요합니다. 아치가 성공적으로 단계적 프로토콜을 사용하여 해부하고 사전 코팅 우물을 전송 한 후에는 아치 하단 영역에 부착하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 10 % FBS와 우리 코트 웰 그러나 다른 코팅 재료 (리겔, 젤라틴, 피브로넥틴 등)뿐만 아니라 혈청 접점을 사용할 수 있고, 부착과 아치의> 75 %의 성장을 초래 SFM 배양 하였다ining 미디어.
인두 아치 개발 중 구조의 다수에 대한 primordia 역할을한다. 인두 아치의 초기 형성 (8 일 생쥐의 수정을 게시) 한 후, 클릭당 비용 (CPC)는 PA2에 확장가되어 마음을 유지하는 데 필요한 세포를 공급하는 클릭당 비용 (CPC)의 신 재생 소스로 제공, 심장 세포로 분화 경우 심장 유출 관으로 이동 성장. 인두 아치가 시간적 발달 구조 (E8-11.5) 및 유출 관으로 클릭당 비용 (CPC)의 이동 약 E8-E10에서 발생에게)됨에 따라이 기술에 특정 제한을 제공합니다. 클릭당 비용 (CPC) 연구를 위해, 우리는, E9-10 사이 해부 인두 아치를 사용하는 것이 좋습니다이 단계에서 각 PA2은 약 5-800 RFP + 세포 (Mesp1 계보 추적)가 포함되어 있습니다.
형광 라벨로,이 체외 배양 심근 세포 또는 myotubes 나는 구타로 발전 전구 세포 및 분화를 모니터링 할 수있게 해준다N 실시간. 또한,이 체외 배양 시스템은 기존 Cre 호텔 /에 loxP 라인을 사용하여 심장 / 근육 전구 세포 증식, 이동 및 분화에 영향을 미치는 세포 자율 미세 환경 인자의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이와 같이,이 시스템은 심장 / 근육 형성 및 질병의 이해로 이어질 수 심장 / 근육 전구 - 틈새 연구를 용이하게 할 것으로 예상된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10 cm Petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100x Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100x Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 |
References
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