En metode til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade i Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Rebeccah J. Katzenberger¹, Carin A. Loewen², R. Tayler Bockstruck¹, Mikal A. Woods³, Barry Ganetzky², David A. Wassarman¹

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade (TBI) i Drosophila. Denne metode giver en gateway til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for TBI patologier hjælp det enorme opbud af eksperimentelle værktøjer og teknikker til rådighed for fluer.

Abstract

Traumatisk hjerneskade (TBI) påvirker millioner af mennesker hvert år, der forårsager nedsat fysisk, kognitiv og adfærdsmæssige funktioner og død. Undersøgelser under anvendelse af Drosophila har bidraget vigtigste gennembrud i forståelsen neurologiske processer. Således med det mål at forstå den cellulære og molekylære grundlag for TBI patologier hos mennesker, vi udviklede High Impact Trauma (HIT) enhed til at påføre lukket hoved TBI i fluer. Fluer udsættes for HIT enhedens skærm fænotyper i overensstemmelse med human TBI såsom midlertidig uarbejdsdygtighed og progressiv neurodegeneration. HIT enhed anvender et fjederbelastet mekanisme til at drive fluer mod væggen i et hætteglas, der forårsager mekanisk skade på flue hjernen. Indretningen er billig og nem at konstruere, dens drift er enkel og hurtig, og det producerer reproducerbare resultater. Derfor kan HIT enhed kombineres med eksisterende eksperimentelle værktøjer og teknikker til fluer til at løse fundamentalespørgsmål om TBI, der kan føre til udvikling af diagnostik og behandlinger for TBI. Navnlig kan den HIT anordning anvendes til at udføre genetiske skærme omfattende at forstå den genetiske basis for TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) defineres som skade på hjernen fra en ekstern mekanisk kraft. Mest almindeligt, TBI resultater fra lukkede hoved kræfter, såsom stumpe kræfter og inertial acceleration og decelerationskræfter, der forårsager hjernen at ramme indersiden af ​​kraniet. I USA, anslås det, at 50.000 personer dør hvert år af TBI og 2,5-6.500.000 individer lever med konsekvenserne af TBI, herunder invaliderende fysiske, kognitive og adfærdsmæssige problemer ^1,2. Konsekvenserne af TBI er ikke kun på grund af de primære mekaniske skader på hjernen, men også til sekundære cellulære og molekylære skader på hjernen samt andre væv, der opstår over tid ^3-5. Udvikling af de metoder til at diagnosticere og behandle TBI har vist sig at være vanskeligt, fordi TBI er en kompleks sygdom proces. Den variable karakter af primære skader, human fysiologi og miljømæssige faktorer resulterer i heterogene sekundær injuries og patologier. Underliggende variable faktorer indbefatter sværhedsgraden af ​​primær læsion, tiden mellem gentagne primære skader, og alderen og genotype af individet. Forstå, hvordan hver variabel faktor bidrager til konsekvenserne af TBI vil sandsynligvis støtte i udviklingen af metoder til at diagnosticere og behandle TBI ^6,7.

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at påføre lukket hoved TBI i Drosophila melanogaster (bananfluer), der kan anvendes til at afgrænse bidrag variable faktorer til konsekvenserne af TBI. Metoden er baseret på en indledende bemærkning om, at intenst ramme den side af en flue kultur hætteglas mod håndfladen af ​​en hånd forårsagede vildtype fluer at blive midlertidigt uarbejdsdygtig, en sandsynlig konsekvens af TBI. Således har vi bygget High-Impact Trauma (HIT) enhed til at rekapitulere de acceleration og deceleration kræfter fra hånden hårdtslående action. En high-speed film viser, at en enkelt skud fraHIT-enhed forårsager fluer at kontakte hætteglasset væggen flere gange med deres hoved og krop ^8. Til en vis grad, vil sandsynligvis medføre fluen hjernen til Ricochet og deformere mod hovedet kapsel, svarer til, hvad der sker med mennesker i fald og bilulykker ⁹ alle kontakter. Derfor fluer behandles med HIT enhedens skærm fænotyper i overensstemmelse med hjerneskade, herunder midlertidig uarbejdsdygtighed efterfulgt af ataksi, gradvis genopretning af mobilitet, genekspression ændringer i hovedet, og progressiv neurodegeneration i hjernen ^10. Således HIT enhed gør det muligt at undersøge TBI hjælp af enorme arsenal af eksperimentelle værktøjer og teknikker for fluer.

Protocol

1. Konstruktion af HIT Device

1. Fastgør fjederen til bestyrelsen ved hjælp af to klemmer og fire skruer (Figur 1A). Centrer klemmerne i forhold til bredden af ​​bestyrelsen og støde dem op mod hinanden med den ydre klemme flugter med kanten af ​​brættet. Før fastgørelse klemmer, bøje dem ved hjælp af en tang til at passe stramt over foråret.
   BEMÆRK: Se tabel 1 for beskrivelse af de nødvendige for at konstruere HIT-enheden materialer. Den fastspændt ende af fjederen skal være 1/8 tomme (3,2 mm) fra kanten af ​​brættet, og den frie ende skal strække sig over hele linjen med 3/4 tomme (19 mm). Juster fjederen, så den ligger parallelt med længden af ​​bestyrelsen.
2. Wrap den frie ende af fjederen en gang rundt med den klæbende strimmel velcro sløjfer. Den ydre kant af Velcro skal flugte med enden af ​​fjederen. Velcro er vigtig, fordi den bruges til at fastgøre hætteglasset til fjederen ved creating en stram kompressionsbeslag. Velcro tillader også nem tilslutning og fjernelse af hætteglas, så mange hætteglas, der skal behandles i et kort tidsrum.
3. Placer isspand dækslet på hovedet, centreret, tæt mod den træplade. Orientere hævede region i ice bucket låget, således at den lange kant er parallel til bredden af ​​brættet. Bemærk, at den hævede område af ice bucket er 1/2 tommer (13 mm) højere end den træplade, således at når et hætteglas er fastgjort til fjederen fjederen vil ikke ligge fladt på bordet.
4. Skub hele enheden mod en fast genstand, såsom en væg, så ice bucket låget klemt inde mellem bestyrelsen og objektet og bevæger sig ikke.
5. Tape papiret vinkelmåler til bunden af ​​en pap flyve hætteglas bakke og holde det på kanten mod længden af ​​brættet, således at 90 ° mærket flugter med fjederen, når den trækkes tilbage til en perfekt lodret stilling.

2.Drift af HIT Device

1. Sted mellem 1 og 60 _CO2 -anesthetized flyver i et tomt hætteglas og tilproppes hætteglasset ved hjælp af en tætsiddende vat.
2. Begrænse fluerne til bunden 1 inch (2,5 cm) i hætteglasset ved at trykke vat ind i hætteglasset, indtil det er 1 tomme (2,5 cm) fra bunden. Det er nyttigt at trække en linje på hætteglasset på 1 tomme (2,5 cm) mærke. Bemærk at begrænse fluer til større eller mindre områder af hætteglasset kan påvirke sværhedsgraden af ​​fænotyper.
3. Vent 5 min for fluerne at genvinde mobiliteten fra CO _2. Bemærk at det ikke vides, om 5 min er tilstrækkelig til fuldstændigt at fjerne virkningerne af _CO2.
4. Sæt enden af fjederen i hætteglasset, indtil den indvendige kant af Velcro flugter med toppen af hætteglasset (figur 1B). Når fjederen ligger fladt, bør 1 inch (2,5 cm) af hætteglasset overlappe den hævede område af ice bucket låget. Hætteglas kan genbruges meventuelle gange.
5. Mens du sidder, holde hætteglasset på velcro-regionen ved hjælp af tommel- og pegefinger på din venstre hånd. Hold bord tæt til benchtop hjælp af din højre hånd. Alternativt kan du bruge C-klemmer til at holde bestyrelsen tæt til benchtop.
6. Træk fjederen helt lige tilbage til den ønskede vinkel. Slip foråret. Lad foråret for at komme til et komplet stop.
7. Fjern hætteglasset fra foråret og lade fluerne at komme sig i ≥5 min. Underkaste fluerne til en anden strejke eller overføre fluerne til et hætteglas med flue mad.
   BEMÆRK: En række assays kan anvendes til at vurdere de fænotypiske virkninger af strejker fra HIT enhed. For eksempel, kan virkninger på levetiden bestemmes ved at analysere procent af fluer, der overlever på tidspunkter efter skade, kan virkninger på hjernen morfologi bestemmes ved histologisk analyse af hovedet, og virkninger på genekspression kan bestemmes ved kvantitativ analyse af mRNA-niveauer ^10.
8. Determine virkninger af den procedure, der ikke er på grund af strejker ved identisk behandling kontrol fluer, der ikke er udsat for strejker. Bær høreværn, fordi virkningen af ​​hætteglasset mod ice bucket låget producerer en kraftig støj.

Representative Results

Vi er interesseret i at forstå, hvorfor fluer dør kort efter primær skade. For at kvantificere død, bestemte vi dødelighedsindekset ved 24 timer (MI _24), som er den procentdel af fluer, der døde inden for 24 timer af den primære skade. Fluer udsat for strejker fra HIT enheden blev inkuberet ved 25 ° C i et hætteglas med flue fødevarer, og antallet af døde fluer blev talt efter 24 timer. Vi brugte denne metode til at identificere faktorer, der påvirker MI ₂₄ og fandt, at MI ₂₄ ikke påvirkes af antallet af fluer i et hætteglas (10 til 60 fluer blev testet), tiden mellem gentagne strejker (1 til 60 min blev testet ) eller køn fluen ^10. Derimod fandt vi, at alder på tidspunktet for den primære skade og genotype gjorde påvirke MI _24. Ældre fluer havde en højere MI ₂₄ end yngre fluer og fluer af forskellige genotyper havde signifikant forskellige MI ₂₄ s.

I figur 2Testede vi, om alvorligheden af primær læsion påvirker MI _24. At ændre sværhedsgraden af ​​primær læsion, vi afbøjet fjederen til forskellige vinkler. For hver vinkel, blev hætteglas med enten 0-7 eller 20-27 dag gamle w ¹¹¹⁸ fluer (en standard laboratorium stamme) udsat for fire strejker med 5 min mellem strejker. Tre hætteglas med 60 fluer blev undersøgt for hver vinkel. Fluer blev overført til hætteglas med melasse fødevarer, inkuberet ved 25 ° C, og antallet af døde fluer blev talt efter 24 timer. Den gennemsnitlige MI ₂₄ og standardfejlen af middelværdien blev beregnet for hver vinkel. Disse data viser, at større vinkler afbøjning, dvs.., Mere alvorlige primære skader, resultere i en højere MI ₂₄ end mindre vinkler afbøjning, dvs.., Mindre alvorlige skader. Dette blev observeret for både 0-7 og 20-27 dage gamle fluer. Endvidere i overensstemmelse med Katzenberger et al. ^10, 20-27 dage gamle flerne havde en signifikant højere MI ₂₄ end 0-7 dage gamle fluer på vinkler ≥50 °. Således indikerer disse data, at der på flere aldre MI ₂₄ korrelerer med sværhedsgraden af den primære skade.

Figur 1:. Diagram over HIT enhed (A) Illustration af den oven af HIT indretningen i hvilestilling. (B) Illustration af sidebillede af HIT-enheden. Fjederen er vist i hvilestilling (mørkerød) og afbøjes til 90 ° (lys rød).

Figur 2:. Primær skade sværhedsgrad korrelerer med MI ₂₄ Vi bestemt MI ₂₄ for 0-7 dage gamle w 1118 fluer (lysegrå søjler) og 20-27 dage gamle w ¹¹¹⁸ fluer (mørke grå søjler), der blev udsat for fire strejker fra HIT enhed med foråret afbøjet til de angivne vinkler i grader. De 0 graders data for fluer ikke udsat for HIT-enheden. Vist er den gennemsnitlige MI ₂₄ og standardfejlen på middelværdien. MI ₂₄ af 0-7 og 20-27 dage gamle fluer var signifikant forskellige for 50 ° (P <0,05, ensidet t-test) og vinkler> 50 ° (P <0,001, en ​​halet t-test), men ikke for vinkler < 50 ° (P> 0,1, ensidet t-test).

Discussion

HIT enhed metode adskiller sig fra andre metoder, der påfører traumatisk skade i fluer ved, at det forårsager lukket hoved i stedet gennemtrængende TBI ^11. Endvidere HIT enhedens metode tager mindre tid, kræfter og dygtighed til at påføre TBI i mange fluer, så metoden er mere modtagelig end andre metoder til genetiske skærme store. Endelig er det forhold, at primære tilskadekomne ved HIT enheden ikke er begrænset til hjernen er både en begrænsning og en fordel. Det er en begrænsning, fordi yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, om fænotyper skyldes traumatisk skade på hjernen eller andre kropsdele. På den anden side, polytrauma (traumatisk skade på flere legemsdele) ofte ledsager TBI og menes at modulere TBI fænotyper, så HIT enheden metode kan bruges til at undersøge bidraget fra polytrauma til TBI fænotyper. Fluen TBI modellen har også fordele i forhold gnavere og ikke-humane primater TBI modeller in vivo imaging osv.

Denne protokol beskriver opførelse og drift af HIT-enhed, som er designet til at påføre lukket hoved TBI i fluer. Vi har brugt HIT udstyr i forhold til den MI _{24 <}/ Sub> assay at studere organismal død efter TBI ^7. Imidlertid kan flyve TBI model anvendes på mange andre måder at forstå døden samt andre konsekvenser af TBI. For eksempel kan måles fysiske konsekvenser af TBI bruge analyser til parametre som klatring eller flugt, og adfærdsmæssige konsekvenser af TBI kan måles med analyser til parametre som søvn og indlæring og hukommelse ^10,12-14. Strukturelle virkninger på hjernen kan bestemmes ved anvendelse billeddannende teknikker, såsom immunfluorescens mikroskopi og transmissionselektronmikroskopi. Molekylære virkninger på hjernen kan bestemmes ved anvendelse af genomiske assays, såsom RNA-seq eller proteomiske assays, såsom massespektrometri. Genetiske virkninger på hjernen kan bestemmes ved hjælp af metoder såsom betingede gen knockdown og overekspression. Miljømæssige virkninger på konsekvenserne af TBI kan bestemmes ved varierende præ- eller post-skade parametre såsom inkubationstemperatur og kost eller parametre forHIT enhed såsom vinklen på fjederudslag eller tiden mellem gentagne strejker. Endelig kan HIT-enheden skal bruges til genetiske skærme store til at løse fundamentale spørgsmål som, hvorfor konsekvenserne af TBI er værre i ældre personer end yngre individer såvel som for store narkotika skærme, der kan bruges til at identificere behandlinger for konsekvenserne af TBI.

Når det bruges på en ensartet måde, har vi fundet, at HIT-enheden producerer reproducerbare fænotyper blandt uafhængige forsøg og brugere. Parametre, der kan påvirke reproducerbarheden er opsætning og drift af HIT-enheden. Fænotyper kan blive væsentligt påvirket af små ændringer i placeringen af ​​isspand overdækning i forhold til bestyrelsen, position vat i fluen hætteglasset, og placeringen af ​​hætteglasset i forhold til Velcro strimmel. Som vist i figur 2, fænotyper kan blive væsentligt påvirket af små ændringer ivinkel fjederudslag. Således bør nye brugere af HIT indretningen overvåges for at sikre, at opsætning og drift er identisk med andre brugere. Vi rutinemæssigt kalibrere nye brugere ved at lade dem bestemme MI ₂₄ af 0-7 dages gammel w ¹¹¹⁸ fluer. Endelig har HIT enhed ikke at være identisk med den beskrevet i protokollen. Vi forventer, at de fleste dele af HIT indretningen kan ændres, samtidig med at evnen til at påføre TBI i fluer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)