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Neuroscience

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzungen (TBI) in Drosophila zuzufügen. Dieses Verfahren stellt ein Tor zu den zellulären und molekularen Mechanismen, die TBI Pathologien mit der Vielzahl von experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen verfügbar zugrunde zu untersuchen.

Abstract

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) betrifft Millionen von Menschen jedes Jahr, was zu Beeinträchtigungen der physischen, kognitiven und Verhaltensfunktionen und Tod. Studien unter Verwendung von Drosophila haben wichtige Durchbrüche im Verständnis neurologischer Prozesse beigetragen. So mit dem Ziel, das Verständnis der zellulären und molekularen Grundlagen der TBI Pathologien bei Menschen, die High Impact Trauma (HIT) Gerät an geschlossenen Kopf TBI in Fliegen verursachen, haben wir. Fliegen auf die HIT Gerätedisplay Phänotypen mit der Menschen TBI wie vorübergehende Handlungsunfähigkeit und progressive Neurodegeneration unterzogen. Das HIT-Gerät verwendet eine federbasierten Mechanismus, um Fliegen gegen die Wand eines Fläschchens treiben, wodurch eine mechanische Beschädigung des Fliegengehirns. Die Vorrichtung ist preiswert und leicht zu konstruieren, die Arbeitsweise ist einfach und schnell, und sie erzeugt reproduzierbare Ergebnisse. Folglich kann die HIT-Gerät mit vorhandenen experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen oder zur Adresse Grund kombiniert werdenFragen zu TBI, die zur Entwicklung von Diagnostika und Behandlungen für TBI führen kann. Insbesondere kann die HIT-Gerät verwendet werden, um großflächige genetischen Screens durchzuführen, um die genetische Basis von TBI Pathologien zu verstehen.

Introduction

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) als Verletzung des Gehirns von einer externen mechanischen Kraft definiert. Am häufigsten TBI Ergebnisse geschlossenen Kopf Kräfte wie stumpfe Kräfte und Trägheits Beschleunigungs- und Verzögerungskräfte, die das Gehirn, um das Innere des Schädels schlagen verursachen. In den Vereinigten Staaten, wird geschätzt, dass 50.000 Menschen sterben jedes Jahr an TBI und von 2,5 bis 6.500.000 Personen sind mit den Folgen der TBI leben, einschließlich schwächenden physischen, kognitiven und Verhaltensproblemen 1,2. Die Folgen der TBI sind nicht nur durch primäre mechanische Verletzungen des Gehirns, sondern auch sekundäre zelluläre und molekulare Verletzungen des Gehirns sowie anderen Geweben, die über die Zeit 3-5 auftreten. Die Entwicklung von Methoden zur Diagnose und Behandlung TBI hat sich als schwierig erwiesen, weil TBI ist eine komplexe Krankheit Prozess. Die variable Natur des Primärverletzungen, die menschliche Physiologie und Umweltfaktoren führt zu heterogenen Sekundär injuries und Pathologien. Zugrunde liegende variable Faktoren umfassen die Schwere der primären Verletzung, die Zeit zwischen den sich wiederholenden Primärverletzungen, und das Alter und den Genotyp des Individuums. Zu verstehen, wie jede Variable Faktor trägt zu den Folgen der TBI wird wahrscheinlich in der Entwicklung von Methoden zur Diagnose und Behandlung TBI 6,7 zu unterstützen.

Hier beschreiben wir eine Methode zur zuzufügen geschlossenen Kopf TBI in Drosophila melanogaster (Fruchtfliege), die verwendet werden können, um den Beitrag der variablen Faktoren auf die Folgen der TBI abzugrenzen. Die Methode basiert auf einer anfänglichen Beobachtung, dass intensiv Schlagen der Seite eines fly Kulturfläschchen gegen die Handfläche verursacht Wildtyp-basierte fliegt zu werden vorübergehend außer Gefecht gesetzt, eine wahrscheinliche Folge TBI. So bauten wir die High-Impact Trauma (HIT) Gerät, um die Beschleunigungs- und Verzögerungskräfte aus der Hand schlagen Aktion zu wiederholen. Ein High-Speed-Film zeigt, dass ein einzelner Angriff überHIT Gerät verursacht fliegt in das Fläschchen Wand mit ihren Kopf und Körper 8 kontaktieren mehrmals. Zu einem gewissen Grad sind alle Kontakte geeignet sind, die Fliegenhirn dazu führen, abprallen und verformen gegen die Kopfkapsel, ähnlich dem, was passiert mit den Menschen in Stürze und Autounfälle 9. Dementsprechend fliegt mit dem HIT Gerätedisplay Phänotypen, die mit Hirnverletzung, einschließlich der vorübergehenden Arbeitsunfähigkeit, gefolgt von Ataxie, allmähliche Erholung der Mobilität, Veränderungen der Genexpression in den Kopf, und progressive Neurodegeneration im Gehirn 10 behandelt. Somit ermöglicht die HIT-Gerät kann TBI mit der riesigen Arsenal von experimentellen Werkzeuge und Techniken für Fliegen entwickelt studieren.

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Protocol

1. Aufbau der HIT Geräte

  1. Befestigen Sie den Frühling in den Vorstand mit zwei Klemmen und vier Schrauben (1A). Zentrieren Sie die Klammern in Bezug auf die Breite der Platte und stoßen Sie sie gegeneinander mit der Außenklemme bündig mit der Kante der Platine. Vor dem Anbringen der Klemmen, biegen sie mit einer Zange zu dicht über der Feder passen.
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für eine Beschreibung der für den Bau des HIT-Gerät benötigten Materialien. Die eingespannt Ende der Feder sollte 1/8 Zoll (3,2 mm) von der Kante der Platte zu sein, und das freie Ende sollte über das Brett von 3/4 Zoll (19 mm) zu verlängern. Stellen Sie die Feder, so dass sie parallel zu der Länge der Platte liegt.
  2. Wickeln Sie das freie Ende des Feder einmal um mit dem Klebestreifen Klettschlaufen. Der äußere Rand des Velcro sollte bündig mit dem Ende der Feder sein. Der Klettverschluss ist wichtig, denn es wird verwendet, um das Fläschchen mit dem Feder von cre sicherntriebs einen dichten Klemmfitting. Der Klettverschluss ermöglicht auch eine einfache Verbindung und Entfernung des Vials, so viele Ampullen in einer kurzen Zeit verarbeitet werden.
  3. Legen Sie das Eis Eimer Deckel auf den Kopf, zentriert ist, fest gegen die Holzbrett. Richten Sie die erhöhten Bereich der Eiskübel Abdeckung, so dass die lange Kante parallel zur Breite der Platte ist. Beachten Sie, dass der erhöhte Bereich der Eiskübel ist 1/2 Zoll (13 mm) über dem Holzbrett, so dass, wenn ein Fläschchen ist mit der Feder befestigt ist die Feder nicht flach auf dem Brett.
  4. Schieben Sie das ganze Gerät gegen einen festen Gegenstand wie einer Wand, so dass das Eis Eimer Deckel zwischen der Karte und dem Objekt eingeklemmt und bewegt sich nicht.
  5. Kleben Sie die Papierwinkelmesser, um den Boden eines Kartons fliegen Probenteller und stand es am Rand an der Länge der Platte, so dass die 90 ° Marke mit der Feder ausgerichtet ist, wenn es auf eine vollkommen vertikale Position gezogen wird.

2.Betrieb der Vorrichtung HIT

  1. Platz zwischen 1 und 60 CO 2 -anesthetized in einem leeren Fläschchen fliegt und Stopfen des Fläschchens mit einem eng anliegenden Wattebausch.
  2. Beschränken die Fliegen auf den Boden 1 Zoll (2,5 cm) des Fläschchens, indem Sie den Wattebausch in die Flasche, bis sie 1 Zoll (2,5 cm) aus dem Boden. Es ist hilfreich, um eine Linie auf dem Fläschchen an der 1 Zoll (2,5 cm) Marke zu ziehen. Man beachte, dass Begrenzungslinie um größere oder kleinere Bereiche der Phiole kann die Schwere von Phänotypen beeinflussen.
  3. Warten Sie 5 Minuten für die Fliegen, die Mobilität aus dem CO 2 zu erholen. Man beachte, dass es nicht bekannt ist, ob 5 Minuten ist ausreichend, um die Auswirkungen von CO 2 vollständig zu entfernen.
  4. Führen Sie das Ende der Feder in das Fläschchen, bis die Innenkante des Velcro ist bündig mit der Oberseite des Fläschchens (1B). Wenn die Feder flach liegt, sollte 1 Zoll (2,5 cm) des Fläschchens den erhöhten Bereich der Eiskübel Abdeckung überlappen. Fläschchen wieder verwendet werden mjederzeit.
  5. Sitzend, halten Sie die Durchstechflasche an der Region Velcro mit dem Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Halten Sie die Karte fest in die Tisch mit der rechten Hand. Alternativ können Sie C-Klemmen, um das Brett fest an der Tisch halten.
  6. Ziehen Sie die Feder vollkommen gerade wieder in den gewünschten Winkel. Lösen Sie die Feder. Lassen Sie den Frühling bis zum Stillstand kommen.
  7. Küvette aus der Feder und damit die Fliegen für ≥5 min erholen. Betreff die Fliegen auf einen anderen Streik oder übertragen die Fliegen in ein Fläschchen mit Fliegen Essen.
    ANMERKUNG: Eine Vielzahl von Assays kann verwendet werden, um die phänotypischen Auswirkungen der Schläge vom HIT Vorrichtung auszuwerten. Beispielsweise können Wirkungen auf Langlebigkeit durch Analysieren der Prozent der Fliegen, die manchmal nach der Verletzung überleben bestimmt wird, können Wirkungen auf Gehirn Morphologie durch histologische Analyse des Kopfes bestimmt werden, und die Auswirkungen auf die Genexpression kann durch quantitative Analyse der mRNA-Konzentrationen bestimmt werden 10.
  8. Findunge Wirkungen des Verfahrens, die nicht aufgrund von Streiks identisch Behandlung Kontrollfliegen, die nicht an Streiks ausgesetzt sind. Gehörschutz tragen, weil die Auswirkungen der Ampulle gegen den Eiskübel Abdeckung erzeugt ein lautes Geräusch.

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Representative Results

Wir interessieren uns für das Verständnis, warum sterben Fliegen kurz nach Primärverletzung. Um den Tod zu quantifizieren, bestimmten wir die Sterblichkeit Index bei 24 Stunden (MI 24), das der Anteil der Fliegen, die innerhalb 24 Stunden des Primärverletzung gestorben ist. Flies zu Streiks von der HIT-Gerät unterzogen wurden bei 25 ° C in einem Fläschchen mit Fliegen Essen inkubiert und die Anzahl der toten Fliegen wurde nach 24 Stunden gezählt. Wir haben diesen Ansatz auf Faktoren, die den MI 24 beeinflussen zu identifizieren und festgestellt, daß der MI 24 wird nicht durch die Anzahl der Fliegen in einem Glasfläschchen (10 bis 60 entfernt wurde getestet) betroffen sind, die Zeit zwischen den sich wiederholenden Schläge (1 bis 60 min, wurde getestet ) oder das Geschlecht des Fliegen 10. Im Gegensatz dazu haben wir festgestellt, dass das Alter zum Zeitpunkt des primären Verletzungen und Genotyp haben Einfluss auf die MI 24. Ältere Fliegen hatte einen höheren MI 24 als jüngere Fliegen und Fliegen verschiedener Genotypen signifikant verschieden MI 24 s.

In Abbildung 2Testeten wir, ob die Schwere des primären Verletzung beeinflusst das MI 24. Um die Schwere der primären Verletzung verändern, abgelenkt wir die Feder in verschiedenen Winkeln. Für jeden Winkel, wurden Fläschchen von entweder 0-7 oder 20-27 Tage alten w 1118 Fliegen (ein Standard-Laborstamm) zu vier Streiks mit 5 min zwischen Streiks unterzogen. Drei Durchstechflaschen mit 60 Fliegen wurden für jeden Winkel untersucht. Fliegen wurden zu Phiolen mit Melasse Nahrungs übertragen, bei 25 ° C inkubiert, und die Anzahl der toten Fliegen wurde nach 24 Stunden gezählt. Die durchschnittliche MI 24 und Standardfehler des Mittelwertes für jeden Winkel berechnet. Diese Daten zeigen, dass größere Winkel der Ablenkung, dh., Schwerer Primärverletzungen, in einer höheren MI 24 führen als kleinere Ablenkwinkel, dh., Weniger schwere Verletzungen. Dies wurde sowohl für 0-7 und 20-27 Tage alten Fliegen beobachtet. Darüber hinaus im Einklang mit Katzenberger et al. 10, 20-27 Tage alten fler Jahren hatten eine signifikant höhere MI 24 als 0-7 Tage alten Fliegen in Winkeln ≥50 °. Somit zeigen diese Daten, dass bei mehreren Alter der MI 24 korreliert mit der Schwere der primären Verletzung.

Abbildung 1
Abb. 1: Schema der HIT-Gerät (A) Illustration der Draufsicht auf die HIT-Gerät in der Ruheposition. (B) Illustration der Seitenansicht des HIT-Gerät. Die Feder ist in der Ruhestellung (dunkelrot) angezeigt und umgelenkt wird auf 90 ° (hellrot).

Figur 2
Abb. 2: Primäre Verletzungsschwere korreliert mit dem MI 24 Wir bestimmten die MI 24 für 0-7 Tage alten w 1118 entfernt (hellgraue Balken) und 20 bis 27 Tage alten w 1118 Fliegen (dunkelgraue Balken), die zu vier Streiks von der HIT-Gerät mit der Feder unterzogen wurden abgelenkt, um den angegebenen Winkel in Grad. Die 0-Grad-Daten für Fliegen nicht auf die HIT-Gerät unterzogen. Dargestellt sind die Durchschnitts MI 24 und der Standardfehler des Mittelwerts. Das MI 24 von 0-7 und 20-27 Tage alten Fliegen war signifikant unterschiedlich für 50 ° (P <0,05, einem tailed t-Test) und Winkel> 50 ° (P <0,001, einem tailed t-Test), aber nicht für die Winkel < (P> 0,1, einem tailed t-Test). 50 °

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Discussion

Die HIT-Gerät Methode wird von anderen Methoden, die traumatischen Verletzungen verursachen, bei Fliegen durch die Tatsache, dass es bewirkt, dass geschlossene Kopf nicht durchdringen TBI 11 aus. Darüber hinaus nimmt das HIT Gerät Verfahren weniger Zeit, Mühe und Geschick, um TBI in viele Fliegen verursachen, so dass die Methode ist besser geeignet als andere Methoden, um groß angelegte genetische Screens. Schließlich zeigt die Tatsache, dass die primäre Verletzungen durch das HIT Vorrichtung zugefügt werden nicht auf das Gehirn beschränkt ist sowohl eine Einschränkung und ein Vorteil. Es ist eine Einschränkung, weil zusätzliche Untersuchungen erforderlich, um zu beurteilen, ob Phänotypen aufgrund traumatischer Verletzung des Gehirns oder anderen Körperteilen sind. Auf der anderen Seite, Polytrauma (traumatische Verletzung, mehrere Körperteile) oft begleitet TBI und ist gedacht, um TBI Phänotypen zu modulieren, so dass die Vorrichtung HIT Verfahren verwendet, um den Beitrag von Polytrauma TBI Phänotypen zu untersuchen. Die Fliege TBI Modell hat auch Vorteile gegenüber Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten TBI Modelle in vivo-Bildgebung etc.

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und den Betrieb des HIT-Gerät, das dazu bestimmt ist, geschlossenen Kopf TBI in Fliegen zuzufügen. Wir haben die HIT Vorrichtung in Verbindung mit dem MI-24 verwendet </ Sub> Assay organismal Tod folgenden TBI 7 studieren. Allerdings kann die Fliege TBI Modell in vielen anderen Möglichkeiten, um Tod zu verstehen wie auch andere Folgen der TBI verwendet werden. Zum Beispiel können physikalische Folgen TBI Verwendung von Assays für Parameter wie Klettern oder Flucht und Verhaltenskonsequenzen von TBI kann unter Verwendung von Assays für Parameter wie Schlaf und Lern- und Gedächtnis 10,12-14 gemessen werden, gemessen werden. Strukturelle Effekte auf das Gehirn kann durch bildgebende Verfahren, wie Immunfluoreszenzmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie bestimmt werden. Molekular Wirkungen auf das Gehirn unter Verwendung von genomischer Assays wie RNA-seq oder Proteom-Assays wie Massenspektrometrie bestimmt werden. Genetische Auswirkungen auf das Gehirn kann mit Ansätzen wie bedingte knock-down und die Überexpression festgestellt werden. Auswirkungen auf die Umwelt zu den Folgen der TBI kann durch Variation vor oder nach der Verletzung Parameter wie Inkubationstemperatur und Diät oder Parameter bestimmt werdenDie HIT-Vorrichtung, wie der Winkel der Federweg oder die Zeit zwischen zwei Wiederholungsangriffe. Schließlich kann die HIT-Gerät für eine groß angelegte genetische Bildschirme verwendet werden, um grundlegende Fragen wie, warum die Folgen von TBI sind schlimmer bei älteren Menschen als jüngere Einzelpersonen als auch für große Drogen-Bildschirme, die verwendet werden, um Behandlungen für zu identifizieren Adresse die Folgen der TBI.

Wenn sie in einer konsistenten Art und Weise verwendet wird, haben wir festgestellt, dass die HIT Gerät erzeugt reproduzierbare Phänotypen unter unabhängigen Experimente und Benutzern. Parameter, die Reproduzierbarkeit beeinflussen können, sind der Aufbau und der Betrieb des HIT-Gerät. Phänotypen kann durch kleine Änderungen in der Position der Eisbehälter Abdeckung relativ zu der Platte, der Position der Wattebausch in die Fliege Vial gelöst und die Position der Ampulle relativ zu dem Klettband erheblich beeinflusst werden. Wie ferner in 2 gezeigt, Phänotypen signifikant durch kleine Änderungen in der betroffenWinkel Federweg. Somit sollte neue Nutzer der HIT Einrichtung überwacht werden, um sicherzustellen, dass der Aufbau und Betrieb identisch mit dem der anderen sind. Wir neue Benutzer regelmäßig zu kalibrieren, indem er sie das MI 24 von 0-7 Tage alten w 1118 Fliegen zu bestimmen. Schließlich wird das HIT Vorrichtung nicht identisch mit der in dem Protokoll beschrieben sind. Wir erwarten, dass die meisten Teile des HIT-Gerät verändert, während die Fähigkeit, TBI in Fliegen verursachen werden.

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Disclosures

Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss, R01 AG033620 (BG) und von Robert Draper Technology Innovation Funding (DAW) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

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References

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Tags

Neuroscience Ausgabe 100, High-Impact Trauma Gerät Mortalität traumatische Hirnverletzung

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em
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Cite this Article

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

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