Een methode om Closed Head Traumatic Brain Injury Inflict in Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Rebeccah J. Katzenberger¹, Carin A. Loewen², R. Tayler Bockstruck¹, Mikal A. Woods³, Barry Ganetzky², David A. Wassarman¹

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, ³Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

Summary

Hier wordt een methode beschrijven we gesloten hoofd traumatisch hersenletsel (TBI) toebrengen in Drosophila. Deze methode biedt een toegangspoort tot de cellulaire en moleculaire mechanismen die TBI pathologieën met behulp van de enorme serie van experimentele instrumenten en technieken beschikbaar voor het vliegen ten grondslag liggen te onderzoeken.

Abstract

Traumatisch hersenletsel (TBI) treft miljoenen mensen per jaar, waardoor aantasting van de lichamelijke, cognitieve en gedragsmatige functies en dood. Studies met behulp van Drosophila hebben belangrijke doorbraken bijgedragen in het begrijpen van de neurologische processen. Dus, met het doel het begrip van de cellulaire en moleculaire basis van TBI pathologieën bij mensen, de High Impact Trauma (HIT) -apparaat gesloten hoofd TBI toebrengen in vliegen ontwikkelden we. Vliegen onderworpen aan het HIT apparaat scherm fenotypes in overeenstemming met de menselijke TBI zoals tijdelijke arbeidsongeschiktheid en progressieve neurodegeneratie. Het apparaat gebruikt een HIT-veer gebaseerde mechanisme vliegen stuwen tegen de wand van een flesje, waardoor mechanische beschadiging van de vlieg hersenen. De inrichting is goedkoop en eenvoudig te bouwen, de werking is eenvoudig en snel en reproduceerbare resultaten produceert. Bijgevolg kan de HIT-apparaat worden gecombineerd met bestaande experimentele tools en technieken voor het vliegen te pakken fundamentelevragen TBI die kunnen leiden tot de ontwikkeling van diagnostica en behandelingen voor TBI. In het bijzonder kan de HIT apparaat worden gebruikt voor grootschalige genetische screens uitvoeren om de genetische basis van TBI pathologieën begrijpen.

Introduction

Traumatisch hersenletsel (TBI) wordt gedefinieerd als schade aan de hersenen van een externe mechanische kracht. Meestal TBI resultaten uit gesloten kop krachten zoals bot krachten en inertiële versnelling en vertraging krachten die ervoor zorgen dat de hersenen naar de binnenzijde van de schedel te slaan. In de Verenigde Staten, wordt geschat dat 50.000 mensen sterven elk jaar van TBI en 2,5-6.500.000 mensen leven met de gevolgen van TBI, waaronder slopende fysieke, cognitieve en gedragsmatige ^1,2 problemen. De gevolgen van TBI niet alleen veroorzaakt door een primaire mechanische verwonding van de hersenen, maar ook secundaire cellulaire en moleculaire letsel aan de hersenen en andere weefsels tijd optredende ^3-5. De ontwikkeling van methoden voor de diagnose en behandeling van TBI heeft bewezen moeilijk te zijn, omdat TBI is een complexe ziekte proces. De variabele aard van primaire verwondingen, menselijke fysiologie, en omgevingsfactoren resulteert in heterogene secundaire injuries en pathologieën. Onderliggende variabele factoren omvatten de ernst van de primaire verwonding, de tijd tussen herhaalde primaire letsels en de leeftijd en het genotype van het individu. Begrijpen hoe elke variabele factor bijdraagt ​​aan de gevolgen van TBI wil helpen bij de ontwikkeling van methoden voor de diagnose en behandeling van TBI ^6,7.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het toebrengen gesloten hoofd TBI in Drosophila melanogaster (fruitvlieg), die kan worden gebruikt om de bijdrage van variabele factoren om de gevolgen van TBI bakenen. De methode is gebaseerd op een eerste observatie dat intens raken van de kant van een vlieg cultuur flesje tegen de palm van een hand veroorzaakt wild-type vliegt naar raken tijdelijk arbeidsongeschikt, een waarschijnlijke gevolg van TBI. Zo hebben we de High-Impact Trauma (HIT) apparaat om de versnelling en vertraging krachten recapituleren van de hand raken actie aangelegd. Een high-speed film laat zien dat een enkele aanval opHIT apparaat veroorzaakt vliegt contact op met de flacon muur meerdere malen met hun hoofd en lichaam ^8. Tot op zekere hoogte, alle contacten zijn waarschijnlijk de vlieg hersenen veroorzaken aan ricochet en vervormen tegen het hoofd capsule, vergelijkbaar met wat er gebeurt met mensen in valpartijen en auto-ongevallen ^9. Dienovereenkomstig, vliegen behandeld met HIT inrichting beeldscherm fenotypes overeenstemming met hersenletsel, waaronder tijdelijke invaliditeit gevolgd door ataxie, geleidelijk herstel van mobiliteit, genexpressie veranderingen in het hoofd, en progressieve neurodegeneratie in de hersenen ^10. Aldus HIT apparaat maakt het mogelijk om TBI bestuderen vanuit het enorme arsenaal aan experimentele instrumenten en technieken ontwikkeld voor vliegen.

Protocol

1. De bouw van de HIT Device

1. Bevestig de veer aan de raad met twee klemmen en vier schroeven (Figuur 1A). Centreer de klemmen ten opzichte van de breedte van de raad van bestuur en stoten ze tegen elkaar met de buitenste klem gelijk met de rand van het bord. Voorafgaand aan het bevestigen van de klemmen, buigen ze met behulp van een tang te strak over de lente.
   OPMERKING: Zie tabel 1 voor een beschrijving van de voor de bouw van de HIT-apparaat materialen. De geklemd einde van de veer moet 1/8 inch (3,2 mm) vanaf de rand van het bord, en het vrije uiteinde moet zich uitstrekken over de raad van bestuur van 3/4 inch (19 mm). Stel de veer zodat het parallel met de lengte van de plaat ligt.
2. Wikkel het vrije einde van de veer eenmaal rond de zelfklevende strook klittenband lussen. De buitenrand van de Velcro moet gelijk zijn met het uiteinde van de veer zijn. De Velcro is belangrijk omdat het wordt gebruikt om de flacon bevestigen aan de bron door creAting een strakke compressie fitting. Het klittenband maakt ook eenvoudige aansluiting en verwijdering flacons, waardoor vele flacons in een korte tijd te verwerken.
3. Plaats het ijs emmer deksel ondersteboven, gecentreerd, strak tegen de houten plank. Oriënteer het verhoogde gebied van het ijs emmer deksel zodanig dat de lange kant is parallel aan de breedte van het bord. Merk op dat het verhoogde gebied van het ijsemmer is 1/2 inch (13 mm) boven de houten plank, zodat wanneer een flesje voor de veer is bevestigd zal de veer niet vlak op de plaat liggen.
4. Schuif het hele apparaat tegen een vast object, zoals een muur, zodat het ijs emmer deksel is ingeklemd tussen de raad en het object en beweegt niet.
5. Tape het papier gradenboog naar de bodem van een kartonnen vliegen flesje en onderkast is aan de rand tegen de lengte van de plaat, zodat de 90 ° merkteken tegenover de veer wanneer deze wordt teruggetrokken om een ​​perfect verticale positie.

2.Werking van de HIT Device

1. Plaats tussen 1 en 60 CO ₂ -anesthetized vliegt in een leeg flesje en sluit de flacon met een nauwsluitende katoenen bal.
2. Beperk de vliegen naar beneden 1 inch (2,5 cm) van de flacon door de katoenen bal in het flesje tot het 1 inch (2,5 cm) vanaf de onderzijde. Het is nuttig om een ​​lijn te trekken op de flacon op de 1 inch (2,5 cm) merk. Let beperken vliegen om grotere of kleinere delen van de flacon de ernst fenotypes beïnvloeden.
3. Wacht 5 min voor de vliegen om de mobiliteit van de CO ₂ terug te krijgen. Merk op dat het niet bekend is of 5 min is voldoende om de effecten van CO ₂ volledig te verwijderen.
4. Het uiteinde van de veer in het flesje tot de binnenrand van het Velcro gelijk ligt met de bovenkant van de flacon (Figuur 1B). Wanneer de veer plat ligt, moet 1 inch (2,5 cm) van de flacon het verhoogde gebied van het ijs emmer deksel overlappen. Flacons kan worden hergebruikt maltijd.
5. Zittend, houd de flacon op het gebied klittenband met behulp van de duim en wijsvinger van je linkerhand. Houd de raad van bestuur vast aan de stationaire met uw rechterhand. Als alternatief gebruik C-klemmen aan de raad strak aan de werkbank vast te houden.
6. Trek het voorjaar perfect direct terug naar de gewenste hoek. Laat de lente. Laat de lente volledig tot stilstand te komen.
7. Verwijder de flacon van de bron en laat de vliegen om te herstellen voor ≥5 min. Onderwerp de vliegen naar een andere staking of overdracht van de vliegen naar een flesje met vlieg voedsel.
   OPMERKING: Verschillende assays kunnen worden gebruikt voor de fenotypische effecten van aanvallen van de HIT apparaat evalueren. Zo kunnen de effecten op levensduur worden bepaald via analyse van het percentage vliegen die overleven tijdstippen na letsel, kan gevolgen hersenmorfologie bepaald door histologisch onderzoek van de kop en effecten op genexpressie kan worden vastgesteld door kwantitatieve analyse van mRNA-niveaus ^10.
8. Determine gevolgen van de procedure die niet te wijten aan stakingen van identieke behandeling controle vliegen die niet onderworpen zijn aan stakingen zijn. Draag gehoorbescherming omdat de impact van de flacon tegen het ijs emmer deksel produceert een hard geluid.

Representative Results

Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen waarom vliegen sterven kort na de primaire letsel. Om dodelijke kwantificeren hebben we de sterfte Index van 24 uur ₍₂₄ MI), het percentage van vliegen die stierven binnen 24 uur van het primaire letsel. Vliegen onderworpen aan aanvallen van HIT apparaat werden geïncubeerd bij 25 ° C in een flesje met vlieg voedsel, en het aantal dode vliegen werd geteld na 24 uur. We gebruikten deze benadering op factoren die invloed hebben op de MI ₂₄ identificeren en vond dat de storingsindicator ₂₄ niet wordt beïnvloed door het aantal vliegen in een flacon (10-60 vliegen getest), de tijd tussen herhaalde aanvallen (1-60 min werd getest ) of het geslacht van de vlieg ^10. Daarentegen vonden we dat leeftijd ten tijde van de primaire schade en genotype invloed had de ₂₄ MI. Oudere vliegen hadden een hogere MI ₂₄ dan jongere vliegen en vliegen van verschillende genotypen hadden significant verschillend MI ₂₄ s.

In figuur 2, Testten we of de ernst van de primaire schade beïnvloedt de MI _24. Om de ernst van de primaire verwonding wijzigen we afgebogen de veer onder verschillende hoeken. Voor elke hoek, werden flesjes van ofwel 0-7 of 20-27 dagen oud w ¹¹¹⁸ vliegt (een standaard laboratorium stam) onderworpen aan vier stakingen met 5 min tussen de stakingen. Drie flesjes van 60 vliegen werden onderzocht voor elke hoek. Vliegen werden overgebracht in flesjes met melasse voedsel, geïncubeerd bij 25 ° C en het aantal dode vliegen werd geteld na 24 uur. De gemiddelde MI ₂₄ en standaardafwijking van het gemiddelde werd berekend voor elke hoek. Deze gegevens laten zien dat grotere hoeken van de afbuiging, dwz., Meer ernstige primaire verwondingen, resulteren in een hogere MI ₂₄ dan kleinere hoek van afbuiging, dwz., Minder ernstige verwondingen. Dit werd waargenomen voor zowel de 0-7 en 20-27 dagen oud vliegen. Bovendien, in overeenstemming met Katzenberger et al. ^10, 20-27 dagen oude flies hadden een significant hogere MI ₂₄ dan 0-7 dag oude vliegen bij hoeken ≥50 °. Aldus geven deze gegevens aan dat op verschillende leeftijden het MI ₂₄ correleert met de ernst van de primaire schade.

Figuur 1:. Diagram van de HIT-inrichting (A) Illustratie van het bovenaanzicht van het HIT inrichting in de ruststand. (B) Afbeelding van het zijaanzicht van de inrichting HIT. De veer is in de ruststand (donkerrood) en afgebogen tot 90 ° (licht rood).

Figuur 2:. Primaire letselernst correleert met de MI ₂₄ We bepaalden de MI ₂₄ voor 0-7 dagen oude w 1118 vliegt (licht grijze balken) en 20-27 dagen oude w ¹¹¹⁸ vliegt (donker grijze balken) die werden onderworpen aan vier stakingen van de HIT-apparaat met het voorjaar afgebogen naar de aangegeven hoeken in graden. De gegevens 0 graden zijn voor vliegt niet onderworpen aan de HIT-apparaat. Getoond worden de gemiddelde MI ₂₄ en de standaardafwijking van het gemiddelde. De MI ₂₄ van 0-7 en 20-27 dagen oude vliegen significant verschillend voor 50 ° (P <0,05, met een eenzijdig t test) en hoeken> 50 ° (P <0,001, met een eenzijdig t test), maar niet te hoeken < 50 ° (P> 0.1, één tailed t-test).

Discussion

De werkwijze HIT inrichting onderscheidt zich van andere methoden traumatisch letsel toebrengen in vliegen doordat het veroorzaakt gesloten kop plaats indringend TBI ^11. Voorts neemt de HIT inrichting methode minder tijd, inspanning en vaardigheid TBI toebrengen in veel vliegen, zodat de methode vatbaarder dan andere methoden voor grootschalige genetische screens. Ten slotte is het feit dat de primaire letsels veroorzaakt door het HIT inrichting niet beperkt tot de hersenen zowel beperking en een voordeel. Het is een beperking omdat er extra onderzoek ter beoordeling of fenotypes als gevolg van traumatisch letsel aan de hersenen of andere lichaamsdelen. Anderzijds, polytrauma (traumatisch letsel van meerdere lichaamsdelen) vaak gepaard TBI en men denkt dat TBI fenotypes te moduleren, zodat de HIT inrichting methode kan worden gebruikt om de bijdrage van polytrauma TBI phenotypes. De fly TBI model heeft ook voordelen ten opzichte van knaagdieren en niet-menselijke primaten TBI modellen in vivo imaging etc.

Dit protocol beschrijft de constructie en werking van de HIT apparaat, dat is ontworpen om gesloten hoofd TBI toebrengen in vliegen. We hebben het HIT apparaat dat wordt gebruikt in combinatie met de MI _{24 <}/ Sub> assay tot organismale dood na TBI ⁷ bestuderen. Echter, de vlieg TBI model worden gebruikt in vele andere manieren om dood te begrijpen en andere consequenties van TBI. Zo kunnen fysieke gevolgen van TBI worden gemeten met assays voor parameters zoals klimmen of flight en gedragsconsequenties van TBI kan worden gemeten met assays voor parameters zoals slaap en leren en geheugen ^10,12-14. Structurele effecten op de hersenen kan worden bepaald met beeldvormingstechnieken zoals immunofluorescentie microscopie en transmissie elektronenmicroscopie. Moleculaire effecten op de hersenen kan bepaald worden met behulp genomic testen zoals RNA-seq of proteoom testen zoals massaspectrometrie. Genetische effecten op de hersenen kan worden bepaald met methoden zoals conditionele gene knockdown en overexpressie. Omgevingseffecten over de gevolgen van TBI kan worden bepaald door het variëren van pre- of post-verwonding parameters zoals incubatietemperatuur en dieet of parameters vanhet HIT-apparaat, zoals de hoek van de lente afbuiging of de tijd tussen herhaalde stakingen. Tenslotte kan de HIT inrichting worden gebruikt voor grootschalige genetische screens fundamentele vragen als waarom de gevolgen van TBI erger bij ouderen dan jongere individuen en voor grootschalige drug schermen die kunnen worden gebruikt voor behandelingen identificeren aanpakken de gevolgen van TBI.

Wanneer gebruikt op een consistente manier, hebben we gevonden dat de HIT apparaat produceert reproduceerbare fenotypes onder onafhankelijke experimenten en gebruikers. Parameters die van invloed kunnen de reproduceerbaarheid zijn de opzet en werking van het HIT-apparaat. Fenotypes kan aanzienlijk worden beïnvloed door kleine veranderingen in de positie van de ijsemmer deksel ten opzichte van de raad van bestuur, de positie van de katoenen bal in de vlieg flacon en de positie van de flacon ten opzichte van het klittenband. Zoals getoond in figuur 2, fenotypes kan aanzienlijk worden beïnvloed door kleine veranderingen in dehoek van de lente afbuiging. Zo moeten nieuwe gebruikers van het HIT-apparaat worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de opzet en werking zijn identiek aan die van andere gebruikers. We routinematig kalibreren nieuwe gebruikers door ze bepalen de MI ₂₄ van 0-7 dagen oude w ¹¹¹⁸ vliegt. Tenslotte werkt de HIT apparaat niet identiek aan het protocol beschreven worden. We verwachten dat de belangrijkste delen van het HIT inrichting kan worden gewijzigd terwijl het mogelijk blijft TBI toebrengen in vliegen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board			9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 inch (diameter, 25.4 cm)