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Neuroscience

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

Aqui nós descrevemos um método para infligir a cabeça fechado traumatismo crânio-encefálico (TCE) em Drosophila. Este método oferece um portal para investigar os mecanismos celulares e moleculares que estão na base patologias TCE, utilizando a vasta gama de ferramentas experimentais e técnicas disponíveis para as moscas.

Abstract

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) afeta milhões de pessoas a cada ano, causando comprometimento da saúde física, cognitiva e funções comportamentais e morte. Estudos utilizando Drosophila têm contribuído importantes avanços na compreensão de processos neurológicos. Assim, com o objetivo de compreender a base celular e molecular de patologias TCE em humanos, foi desenvolvido o dispositivo de Trauma de Alto Impacto (HIT) para infligir cabeça fechada TBI em moscas. Moscas submetidos aos fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com TBI humano, tais como incapacidade temporária e neurodegeneração progressiva. O dispositivo HIT usa um mecanismo baseado em mola para impulsionar moscas contra a parede de um tubo de ensaio, provocando danos mecânicos ao cérebro mosca. O dispositivo é barato e fácil de construir, a sua operação é simples e rápida, e que produz resultados reprodutíveis. Por conseguinte, o dispositivo de HIT pode ser combinada com as ferramentas experimentais existentes e técnicas de moscas para tratar fundamentaisdúvidas sobre TCE que podem levar ao desenvolvimento de diagnósticos e tratamentos para o TCE. Em particular, o dispositivo HIT pode ser usado para realizar telas genéticos em grande escala para compreender a base genética de patologias TBI.

Introduction

Traumatismo crânio-encefálico (TCE) é definida como lesão no cérebro de uma força mecânica externa. Mais vulgarmente, a partir de resultados de TCE forças de cabeça fechada, como forças rombas e aceleração inércia e forças de desaceleração que causam o cérebro para atingir o interior do crânio. Nos Estados Unidos, estima-se que 50.000 pessoas morrem a cada ano de TBI e 2,5-6.500.000 indivíduos estão a viver com as consequências do TCE, incluindo debilitante físico, cognitivo e problemas de comportamento 1,2. As conseqüências do TCE não são apenas devido a lesões mecânicas primárias para o cérebro, mas também a lesões celulares e moleculares secundários para o cérebro, bem como outros tecidos que ocorrem ao longo do tempo 3-5. O desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar o TCE tem provado ser difícil porque o TCE é um processo de doença complexa. A natureza variável de lesões primárias, fisiologia humana e fatores ambientais resulta em i secundário heterogêneonjuries e patologias. Factores variáveis ​​subjacentes incluem a gravidade da lesão primária, o tempo entre as lesões primárias repetitivas, e da idade e do genótipo do indivíduo. A compreensão de como cada fator variável contribui para as conseqüências de TBI é susceptível de ajudar no desenvolvimento de abordagens para diagnosticar e tratar TBI 6,7.

Aqui nós descrevemos um método para infligir TBI cabeça fechada em Drosophila melanogaster (mosca da fruta) que pode ser usado para delinear a contribuição de fatores variáveis ​​para as consequências do TCE. O método baseia-se na observação inicial de que intensamente que bate no lado de um frasco de cultura mosca contra a palma de uma mão causada moscas do tipo selvagem para ficar temporariamente incapacitada, uma consequência provável da TBI. Assim, construímos o dispositivo High-Impact Trauma (HIT) recapitular as forças de aceleração e desaceleração a partir da ação de bater a mão. Um filme de alta velocidade mostra que um único golpe doHIT dispositivo faz com que voa para entrar em contato com a parede do frasco várias vezes com a cabeça eo corpo 8. Em certa medida, todos os contatos são susceptíveis de fazer com que o cérebro da mosca a ricochetear e deformar contra a cápsula cabeça, semelhante ao que acontece com os seres humanos em quedas e acidentes de carro 9. Assim, moscas tratados com os fenótipos visor do dispositivo HIT consistentes com lesão cerebral, incluindo a incapacidade temporária seguido por ataxia, a recuperação gradual da mobilidade, alterações de expressão gênica na cabeça, e neurodegeneração progressiva no cérebro 10. Assim, o dispositivo de HIT torna possível estudar TBI utilizando o enorme arsenal de ferramentas e técnicas desenvolvidas para moscas experimentais.

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Protocol

1. Construção do Dispositivo HIT

  1. Fixe a mola para a placa utilizando dois grampos e quatro parafusos (Figura 1A). Centralize os grampos em relação à largura da placa e Butt-los uns contra os outros com o flush braçadeira exterior com a borda da placa. Antes de fixar os grampos, dobre-os usando um alicate para caber firmemente sobre a primavera.
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter descrições dos materiais necessários para a construção do dispositivo de HIT. A extremidade apertada da mola deve ser de 1/8 de polegada (3,2 mm) a partir da borda da placa, ea extremidade livre deve estender-se sobre a placa por 3/4 de polegada (19 mm). Ajustar a mola de modo que ela se encontra em paralelo com o comprimento do bordo.
  2. Enrole a extremidade livre da mola em torno de uma vez com a fita adesiva de loops de velcro. A borda externa do velcro deve estar nivelada com a extremidade da mola. O Velcro é importante porque é usado para proteger o frasco para a mola por CREAting um encaixe de compressão apertado. O velcro permite também uma fácil ligação e remoção de tubos de ensaio, permitindo que muitos frascos a serem processados ​​num curto período de tempo.
  3. Coloque a tampa do balde de gelo de cabeça para baixo, centrado, apertado contra a placa de madeira. Orientar a região elevada da tampa balde de gelo de modo a que a borda é paralelo ao longo da largura do tabuleiro. Note-se que a região elevada do balde de gelo é de 1/2 polegada (13 mm) maior do que a placa de madeira, de modo que quando um frasco é ligado à mola a mola não vou mentir plana no tabuleiro.
  4. Deslize todo o dispositivo contra um objeto fixo, como uma parede, de modo que a tampa balde de gelo está encravado entre o conselho eo objeto e não se move.
  5. Tape o transferidor de papel para o fundo de um cartão voar bandeja frasco e coloque na borda contra a extensão do tabuleiro de modo que a marca de 90 ° está alinhado com a primavera, quando ele é puxado de volta para uma posição perfeitamente vertical.

2.O funcionamento do dispositivo HIT

  1. Lugar entre 1 e 60 CO 2 -anesthetized voa em um frasco vazio e tapar o frasco usando uma bola de algodão apertada.
  2. Confinar as moscas para a parte inferior de 1 polegada (2,5 cm) do frasco, empurrando a bola de algodão para dentro do frasco até que seja de 1 polegada (2,5 cm) a partir do fundo. É útil para desenhar uma linha no frasco na marca de 1 polegada (2,5 cm). Note-se que as moscas para confinar regiões maiores ou menores do frasco pode afectar a gravidade dos fenótipos.
  3. Esperar 5 min para as moscas para recuperar a mobilidade do CO 2. Note-se que não se sabe se 5 min é suficiente para eliminar completamente os efeitos de CO 2.
  4. Inserir a extremidade da mola para dentro do frasco até que a extremidade interior do Velcro é nivelada com o topo do frasco (Figura 1B). Quando a primavera está deitado, de 1 polegada (2,5 cm) do frasco para injectáveis ​​deve sobrepor-se a região elevada da tampa do balde de gelo. Os frascos podem ser reutilizados mqualquer hora.
  5. Ao sentar-se, mantenha o frasco a região de Velcro usando o polegar eo dedo indicador de sua mão esquerda. Segure a placa firmemente à bancada usando sua mão direita. Como alternativa, use C-braçadeiras para segurar a placa apertada para a bancada.
  6. Puxe a mola perfeitamente em linha reta de volta para o ângulo desejado. Solte a primavera. Permitir que a primavera chegar a uma paragem completa.
  7. Retire o recipiente da primavera e permitir que as moscas se recuperar para ≥5 min. Apresentar as moscas para outra greve ou transferir as moscas para um frasco com alimentos mosca.
    NOTA: Uma variedade de ensaios pode ser utilizada para avaliar os efeitos fenotípicos de ataques do dispositivo HIT. Por exemplo, os efeitos sobre a longevidade pode ser determinada através da análise da percentagem de moscas que sobrevivem às vezes após a lesão, os efeitos na morfologia do cérebro pode ser determinada por análise histológica da cabeça, e os efeitos sobre a expressão do gene pode ser determinada por análise quantitativa dos níveis de ARNm 10.
  8. Determine efeitos do procedimento que não são devido a greves, tratando de forma idêntica moscas de controle que não são sujeitos a ataques. Usar protecção auricular, porque o impacto do frasco contra a cobertura balde de gelo produz um ruído alto.

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Representative Results

Estamos interessados ​​em entender por que as moscas morrem logo após a lesão primária. Para quantificar a morte, determinou-se o Índice de mortalidade às 24 horas (MI 24), que é a percentagem de moscas que morreram dentro de 24 horas da lesão primária. Moscas sujeitos a ataques do dispositivo HIT foram incubadas a 25 ° C num frasco com comida mosca, e o número de moscas mortas foi contado após 24 horas. Utilizou-se esta abordagem para identificar os factores que afectam a MI 24 e descobriram que o IA 24 não é afectada pelo número de moscas em um frasco (10 a 60 moscas foi testada), o tempo entre batidas repetitivas (1 a 60 min foi testada ), ou o sexo da mosca 10. Em contrapartida, verificou-se que a idade no momento da lesão primária e genótipo afetou o MI 24. Moscas mais velhos tiveram um MI maior do que 24 moscas mais jovens, e moscas de diferentes genótipos apresentaram significativamente diferentes MI 24 s.

Na Figura 2, Testou-se a gravidade da lesão primária afecta o IA 24. Para alterar a gravidade da lesão primária, que desvia a mola para ângulos diferentes. Para cada ângulo, frascos de ambos os 0-7 ou 20-27 dias de idade w 1118 moscas (uma estirpe padrão de laboratório) foram submetidas a quatro greves com 5 min entre greves. Três frascos de 60 moscas foram examinados para cada ângulo. As moscas foram transferidos para frascos de comida com o melaço, incubou-se a 25 ° C, e o número de moscas mortas foi contado após 24 horas. O erro médio MI 24 e padrão da média foi calculada para cada ângulo. Estes dados revelam que maiores ângulos de deflexão, isto é., Lesões primárias mais graves, resultar em um MI superior 24 de menores ângulos de deflexão, ie., Lesões menos graves. Isso foi observado para ambas as moscas 0-7 e 20-27 dias de idade. Além disso, de acordo com Katzenberger et al. 10, 20-27 dias de idade FLs tinha uma significativamente maior do que 0-7 MI 24 dias de idade moscas em ângulos ≥50 °. Assim, estes dados indicam que pelo idades múltiplas do MI 24 correlaciona-se com a gravidade da lesão primária.

Figura 1
Figura 1:. Diagrama do dispositivo de HIT (A) Ilustração da vista de cima do dispositivo HIT na posição de repouso. (B) A ilustração da vista lateral do dispositivo de HIT. A mola é mostrado na posição de descanso (vermelho escuro) e desvia a 90 ° (vermelho claro).

Figura 2
Figura 2:. A gravidade da lesão primária correlaciona-se com o MI 24 Determinamos a MI 24 para 0-7 dias de idade w 1.118 moscas (barras cinza claro) e 20-27 dias de idade w 1118 moscas (barras cinza escuro) que foram submetidos a quatro greves a partir do dispositivo HIT com a mola desviado para os ângulos indicados em graus. Os 0 graus dados são para moscas não submetido ao dispositivo de HIT. Mostram-se a média MI 24 e o erro padrão da média. O MI 24 de 0-7 e 20-27 dias moscas velhos foi significativamente diferente para 50 ° (P <0,05, um teste t de cauda) e ângulos> 50 ° (P <0,001, um teste t de cauda), mas não para os ângulos < 50 ° (P> 0,1, um teste t de cauda).

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Discussion

O método dispositivo HIT se distingue de outros métodos que infligem lesões traumáticas em moscas pelo fato de que ele faz com que a cabeça fechado, em vez de penetrar TBI 11. Além disso, o método de dispositivo HIT leva menos tempo, esforço e habilidade para infligir TBI em muitas moscas, por isso, o método é mais favorável do que outros métodos para telas genéticos de grande escala. Por fim, o facto de as lesões primárias infligidos pelo dispositivo HIT não estão limitados ao cérebro é ao mesmo tempo uma limitação e uma vantagem. É uma limitação, porque estudos adicionais são necessários para avaliar se os fenótipos são devido a uma lesão traumática do cérebro ou para outras partes do corpo. Por outro lado, politraumatismo (lesão traumática para várias partes do corpo), muitas vezes acompanha TCE e é pensado para modular fenótipos TBI, de modo que o dispositivo de HIT método pode ser utilizado para investigar a contribuição de politrauma para fenótipos de TCE. O modelo mosca TCE também tem vantagens em relação a modelos de roedores e primatas não-TBI humanos in vivo de imagens etc.

Este protocolo descreve a construção e funcionamento do dispositivo de acerto, mas que é concebido para infligir TCE cabeça fechada em moscas. Temos usado o dispositivo HIT em conjunto com o MI 24 </ Sub> ensaio para estudar a morte do organismo após o TCE 7. No entanto, o modelo de TBI mosca pode ser utilizado em muitas outras formas de compreender a morte, bem como outras consequências do TCE. Por exemplo, as consequências físicas da TBI pode ser medida utilizando ensaios para parâmetros tais como a escalada ou fuga, e de TCE consequências comportamentais podem ser medida utilizando ensaios para parâmetros tais como o sono e de aprendizagem e memória 10,12-14. Os efeitos estruturais no cérebro pode ser determinada usando técnicas de imagem, tais como microscopia de imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão. Molecular efeitos sobre o cérebro pode ser determinada utilizando ensaios genómicos, tais como ARN-seq ou ensaios proteomic tais como espectrometria de massa. Efeitos genéticos sobre o cérebro pode ser determinada utilizando abordagens como knockdown gene condicional e sobre-expressão. Os efeitos ambientais sobre as consequências do TCE pode ser determinada por vários parâmetros pré ou pós-lesão, tais como temperatura de incubação e dieta ou parâmetros deo dispositivo HIT, tais como o ângulo de deflexão da mola ou o tempo entre batidas repetitivas. Finalmente, o dispositivo HIT pode ser usado para telas genéticos de grande escala para abordar questões fundamentais, como por que as consequências da TBI são piores em indivíduos mais velhos do que os indivíduos mais jovens, bem como para as telas de drogas em grande escala que podem ser usados ​​para identificar tratamentos para as consequências do TCE.

Quando utilizados de uma forma consistente, verificou-se que o dispositivo de HIT produz fenótipos reprodutíveis entre experiências independentes e os utilizadores. Parâmetros que podem afetar reprodutibilidade são o set-up e operação do dispositivo de HIT. Fenótipos podem ser significativamente afetadas por pequenas mudanças na posição da tampa do balde de gelo em relação à placa, a posição da bola de algodão no frasco mosca, ea posição do frasco em relação à tira de velcro. Além disso, como mostrado na Figura 2, fenótipos pode ser significativamente afectado por pequenas mudanças noângulo de deflexão da mola. Assim, os novos utilizadores do dispositivo HIT deve ser controlado para assegurar que a configuração e funcionamento são idênticos com a de outros utilizadores. Rotineiramente calibrar novos usuários, tendo-lhes determinar a MI 24 de 0-7 dias de idade w 1118 moscas. Por último, o dispositivo HIT não precisa ser idêntico ao descrito no protocolo. Esperamos que a maioria das partes do dispositivo HIT pode ser alterada, mantendo a capacidade de infligir TBI em moscas.

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Disclosures

Não temos conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenção, R01 AG033620 (BG) e por Robert Draper Inovação Tecnológica Financiamento (DAW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

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References

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Tags

Neurociência Edição 100, High-Impact dispositivo Trauma mortalidade lesão cerebral traumática

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

Um Método para infligir Cabeça Fechada Lesão cerebral traumático em<em&gt; Drosophila</em
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Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

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