Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kapalı Başkanı Travmatik Beyin yaralayabilecek Bir Yöntem Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52905
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Natural Sciences, University of Puerto Rico-Aguadilla

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada Drosophila kapalı kafa travmatik beyin hasarı (TBI) indirebilmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, sinekler için deneysel araçları ve teknikleri geniş bir dizi kullanarak TBI patolojiler altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için bir ağ geçidi sağlar.

Abstract

Travmatik beyin hasarı (TBH), fiziksel, bilişsel, davranışsal ve fonksiyonları ve ölüm bozukluğu neden her yıl milyonlarca insanı etkilemektedir. Drosophila kullanılarak yapılan çalışmalar nörolojik süreçlerin anlaşılmasında önemli atılımlar katkıda bulunmuştur. Böylece, insanlarda TBI patolojilerin hücresel ve moleküler temelini anlamak amacıyla, biz sinek kapalı kafa TBI indirebilmek için High Impact Travma (HIT) cihazı geliştirdi. Sinekler gibi geçici ehliyetini kaybetmesi ve ilerici nörodejenerasyona gibi insan TBI ile uyumlu HIT cihaz ekran fenotipleri tabi. HIT cihaz sinek beyinde mekanik hasara neden bir şişenin duvara sinekleri itmek için bir yay-tabanlı mekanizması kullanır. Cihaz operasyon basit ve hızlı olan, yapımı pahalı olmayan, kolayca ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Sonuç olarak, HIT cihazı mevcut deneysel araçları ve sinekler temel adrese teknikleri ile kombine edilebilirTBI için teşhis ve tedavilerin gelişmesine yol açabilir TBI ilgili sorular. Özellikle, HIT cihazı TBI patolojilerin genetik temelini anlamak için geniş çaplı genetik ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Introduction

Travmatik beyin hasarı (TBI), harici bir mekanik kuvvet ile ilgili beyin yaralanması olarak tanımlanmaktadır. En yaygın tür künt kuvvetler ve atalet hızlanma ve beyin kafatasının içini grev neden yavaşlama güçleri olarak kapalı kafa kuvvetlerinden TBI sonuçlar. Amerika Birleşik Devletleri'nde, 50.000 kişi TBI her yıl ölmektedir ve 2,5-6.500.000 bireyler, TBI sonuçları ile yaşayan fiziksel, bilişsel zayıflatıcı dahil ve 1,2 davranış sorunları olduğu tahmin edilmektedir. TBI sonuçları beyne primer mekanik yaralanma için değil, aynı zamanda zaman 3-5 içinde meydana beyin sekonder hücresel ve moleküler yaralanmalar gibi diğer dokularda değil sadece bulunmaktadır. teşhis ve TBI tedavi yaklaşımların geliştirilmesi TBI karmaşık bir hastalık süreci olduğu için zor olduğu kanıtlanmıştır. Birincil yaralanmalar, insan fizyolojisi ve çevresel faktörlerin değişken doğası heterojen ikincil i sonuçlanırnjuries ve patolojileri. Altta yatan değişken faktörler bireyin temel yaralanmanın şiddetini, tekrarlayan primer yaralanma arasındaki süreyi ve yaş ve genotipi içermektedir. Her bir değişken faktör TBI sonuçları nasıl katkıda anlama teşhis ve TBI 6,7 tedavisinde yaklaşımlar geliştirilmesine yardımcı olmak için muhtemeldir.

Burada TBI sonuçları değişken faktör katkı tanımlamak için kullanılabileceğini Drosophila melanogaster (meyve sineği) 'de kapalı baş TBI kasten için bir yöntem tarif eder. yöntem yoğun bir elin avuç içi karşı bir sinek kültür flakon yan isabet vahşi tip neden bir ilk gözlem dayanmaktadır geçici TBI olası bir sonucu sakat hale uçar. Böylece, el vurma eylem hızlanma ve yavaşlama kuvvetleri özetlemek için Yüksek Etki Travma (HIT) aygıtı inşa. Yüksek hızlı film gösterir tek bir grevCihaz neden HIT onların baş ve gövdesinin 8 flakon duvarı birkaç kez temas uçar. Bir dereceye kadar, tüm kişiler sekerek ve düşme ve araba kazası 9 insanlara ne benzer kafa kapsül, karşı deforme olmasına sinek beyin neden muhtemeldir. Buna göre, beyinde 10 ataksi ardından geçici ehliyetini kaybetmesi, hareketlilik kademeli bir toparlanma, baş gen ifade değişiklikleri ve ilerleyici sinir dejenerasyonuna dahil beyin hasarı, tutarlı HIT cihaz ekran fenotipleri ile tedavi sinekler. Böylece, HIT cihazı mümkün deneysel araçları ve sinekler için geliştirilen tekniklerin büyük cephanelik kullanarak TBI çalışma yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HIT Cihazın 1. İnşaat

  1. İki kelepçeler ve dört vidayı (Şekil 1A) kullanarak kuruluna yayı takın. Yönetim kurulu genişliğine göre kelepçeleri ortalamak ve yönetim kurulu kenarı ile dış kelepçe floş ile birbirlerine karşı onları popo. Önce kelepçeler takılarak için, yay üzerinde sıkıca uyacak şekilde pense ile bükün.
    NOT: HIT cihazı oluşturmak için gerekli malzemelerin açıklamaları için Tablo 1'e bakınız. Baharın kenetlenmiş uç kurulu kenarından 1/8 inç (3.2 mm) olmalıdır ve serbest ucu 3/4 inç (19 mm) ile tahta üzerinde uzanmalıdır. Bu yönetim kurulu uzunluğu ile paralel yatıyor böylece yayı ayarlayın.
  2. Velcro döngüler yapışkan bant kez etrafında bahar serbest ucunu sarın. Velcro dış kenarı bahar sonu ile aynı hizada olmalıdır. O CRE tarafından bahar flakon güvenliğini sağlamak için kullanılan, çünkü Velcro önemlidirSıkı bir sıkıştırma uydurma ating. Velcro, aynı zamanda pek çok küçük şişeler kısa bir süre içinde işlenecek sağlayan, kolay bağlantı ve şişeler çıkarılmasını mümkün kılar.
  3. Sıkı tahta karşı merkezli baş aşağı buz kovası kapağı yerleştirin. Uzun kenarı kurulu genişliğine paralel olacak şekilde buz kovası kapağının kaldırılmış bölgesini yönlendirmek. Bir şişe yayı bağlıyken bahar tahtada düz yalan olmayacak şekilde buz kovası yükseltilmiş bölge, tahta daha 1/2 inç (13 mm) yüksek olduğunu unutmayın.
  4. Buz kovası kapağı kurulu ve nesne arasında sıkışmış ve hareket etmiyor, böylece, örneğin bir duvar gibi sabit bir nesneye karşı tüm cihaz kaydırın.
  5. Bant, bir karton altına kağıt iletki flakon tepsiyi sinek ve mükemmel dikey konumuna geri çekildiğinde 90 ° işareti yay ile aynı hizada olacak şekilde kurulu uzunluğuna karşı kenarında stand it.

2.HIT Cihazının Operasyonu

  1. Boş bir şişe içinde uçar ve bir dar pamuk kullanarak flakon kapağı kapatılır -anesthetized 1 ile 60 CO 2 arasındaki yeri.
  2. Bu alttan 1 inç (2.5 cm) kadar şişe içine pamuk iterek şişenin taban 1 inç (2.5 cm) sinekler öngörebilir. Bu 1 inç (2.5 cm) işaretine flakon üzerinde bir çizgi çizmek için yararlıdır. Şişenin büyük veya daha küçük bölgelere sinekler hapsetmesi fenotipleri şiddetini etkileyebilir unutmayın.
  3. Sinekler CO 2 hareketlilik kurtarmak için 5 dakika bekleyin. O 5 dk tamamen CO 2 etkilerini ortadan kaldırmak için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir unutmayın.
  4. Velcro iç kenarı flakon (Şekil 1B) üst ile aynı hizaya gelene kadar şişenin içine yayın ucunu. Bahar düz yalan olduğunda, flakonun 1 inç (2.5 cm) buz kovası kapağının kaldırılmış bölgeyi örtüşmelidir. Şişeler m yeniden kullanılabilirher zaman.
  5. Otururken, sol elin baş ve işaret parmağı kullanılarak Velcro bölgede flakon tutun. Sağ elinizi kullanarak Benchtop yönetim kurulu sıkı tutun. Alternatif olarak, masa üstü sıkı yönetim kurulu tutmak için C-kelepçeler kullanın.
  6. Mükemmel düz geri istenen açıya yayı çekin. Bahar bırakın. Bahar tamamen durmasını bekleyin.
  7. Bahar şişe çıkarın ve sinekler ≥5 dk kurtarmak için izin verir. Başka bir greve sinekler Konu veya sinek gıda ile flakon sinekler aktarın.
    Not: birçok analiz HIT cihazından vuruş fenotipik etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Örneğin, uzun ömürlü etkileri yaralanma sonrası zaman hayatta sinekler yüzde analizi ile tespit edilebilir, beyin morfolojisi üzerinde etkisi kafasının histolojik analiz ile tespit edilebilir, ve gen ifadesi üzerindeki etkisi, mRNA seviyelerinin niceliksel analizi ile belirlenebilir 10.
  8. Determinaynı grev tabi değildir kontrol sinekler tedavi ederek grev nedeniyle değil prosedürün e etkileri. Buz kovası kapağı karşı flakon etkisi bir gürültü üretir, çünkü işitme koruması giyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz sinekler birincil yaralanma kısa bir süre sonra ölür neden anlamak ilgilendi. Ölümü ölçmek için, birincil yaralanma 24 saat içinde ölen sineklerin yüzde 24 saatte Ölüm İndeksi (MI 24), tespit. HIT cihazdan saldırılarından Sinekler uçucu gıda ile bir şişe içinde 25 ° C'de inkübe edilmiştir, ve ölü sinek sayısı, 24 saat sonra sayılmıştır. Biz MI 24 etkileyen faktörleri belirlemek için bu yaklaşımı kullanılır ve MI 24 bir şişeye (10 ila 60 sinekler test edildi) sinek sayısına göre etkilenmediğini, tekrarlanan grevler arasındaki süre (1-60 dk test edilmis bulundu ), ya da sinek 10 seks. Buna karşılık, biz birincil yaralanma anda bu yaşı bulundu ve genotip MI 24 etkiler yaptı. Eski sinek genç sinekler daha yüksek MI 24 vardı ve farklı genotip sinekler önemli ölçüde farklı MI 24 s vardı.

Şekil 2'deBiz birincil yaralanma şiddeti MI 24 etkileyip etkilemediğini test ettik. Birincil yaralanmanın şiddetini değiştirmek için, farklı açılardan bahar deflected. Her bir açı için, 1118 sinekler (standart bir laboratuar suşu) w, eski, ya 0-7 ya da 20-27 gün şişeler saldırıları arasında 5 dakika ile dört saldırıları tabi tutulmuştur. 60 sinekler üç tüp, her açı için incelenmiştir. Sinekler 25 ° C'de inkübe edildi, pekmez gıda ile şişelere aktarıldı ve ölü sinek sayısı, 24 saat sonra sayılmıştır. ortalama MI 24, ortalama ve standart hata, her açı için hesaplandı. Bu veriler sapma, daha büyük açılar yani., Daha şiddetli birincil yaralanmalar, sapma küçük açılarda, yani., Daha ağır yaralanmalar daha yüksek MI 24 neden olduğunu ortaya koymaktadır. Bu, her iki 0-7 ve 20-27 günlük sinekler gözlenmiştir. Ayrıca, Katzenberger ark ile uyum içinde. 10, 20-27 gün eski fller açıları ≥50 ° anlamlı olarak daha yüksek MI 24 0-7 daha gün eski sinek vardı. Böylece, bu veriler birden yaşlarda MI 24 ilköğretim yaralanmanın şiddeti ile ilişkili olduğunu göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. Dinlenme pozisyonunda HIT cihazın üst bakış HIT cihazının Şeması (A) 'Çizim. HIT cihazının yan görünüm (B) Çizim. Yay dinlenme pozisyonunda (koyu kırmızı) 'de gösterilmiş ve 90 ° (açık kırmızı) saptırılmaktadır.

Şekil 2,
Şekil 2:. Birincil yaralanma şiddeti MI 24 ile ilişkilidir Biz w eski 0-7 gün MI 24 tespit 1118 sinekler (açık gri çubuklar) ve 20-27 gün eski w 1118 sinekler (koyu gri çubuklar) derece belirtilen açıları deflected. 0 derece verileri içindir HIT cihazına tabi sinekler. Ortalama MI 24 ve ortalamanın standart hatası gösterilmiştir. 0-7 ve 20-27 gün eski sinek MI 24 50 ° (p <0.05, tek kuyruklu t testi) ve açıları> 50 ° anlamlı farklıydı (p <0.001, tek kuyruklu t testi) açılar için değil < 50 ° (P> 0.1, tek yanlı t testi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HIT cihaz yöntemi TBI 11 delici yerine kapalı kafa neden gerçeği ile sinekler travmatik yaralanma indirebilmek diğer yöntemlerden ayrılır. Ayrıca, HIT cihaz yöntemi birçok sinekler TBI indirebilmek için daha az zaman, çaba ve beceri alır, bu yüzden yöntem büyük ölçekli genetik ekranlar diğer yöntemlere göre daha müsait. Son olarak, HIT cihazı tarafından uygulanan birincil yaralanmalar, beyin sınırlı değildir aslında bir sınırlama ve bir avantaj niteliğindedir. Ek çalışmalar fenotipleri beyne ya da diğer vücut parçaları travmatik yaralanma nedeniyle olup olmadığını değerlendirmek için gerekli çünkü bir sınırlama yoktur. Öte yandan, politravma (çoklu vücut parçaları travmatik yaralanma) genellikle TBI eşlik eder ve TBI fenotipleri modüle düşünülmektedir, yani HIT cihaz yöntemi TBI fenotipleri Multitravmalı katkısını araştırmak için kullanılabilir. Uçucu TBI modeli aynı zamanda kemirgen ve insan olmayan primat modeller TBI karşısında avantajlara sahip in vivo görüntüleme vb.

Bu protokol sinekler kapalı kafa TBI indirebilmek için tasarlanmıştır HIT cihazın, inşaat ve çalışmasını açıklar. Biz MI 24 ile birlikte HIT cihazı kullandık </ Sub> tahlil TBI 7 aşağıdaki organizma ölüme incelemek için. Bununla birlikte, uçucu TBI modeli ölümü anlamak için birçok başka şekillerde de TBI diğer sonuçları olarak kullanılabilir. Örneğin, TBI fiziksel sonuçlarının, uyku ve öğrenme ve hafıza 10,12-14 gibi parametreler için deneyler kullanılarak ölçülebilir bu tırmanma veya uçuş ve TBI davranış sonuçları gibi parametreler için deneyler kullanılarak ölçülebilir. Beynin yapısal etkileri, mikroskobik ve transmisyon elektron mikroskobu gibi görüntüleme teknikleri kullanılarak tespit edilebilir. Beyin üzerinde moleküler etkileri, RNA-SEQ ya da kütle spektrometrisi gibi proteomik tahlilleri gibi genomik deneyler kullanılarak belirlenebilir. Beyin üzerinde Genetik etkiler, koşullu gen demonte ve aşırı ekspresyonu gibi yaklaşımlar kullanılarak tespit edilebilir. TBI sonuçları ile ilgili çevresel etkileri gibi inkübasyon sıcaklığı ve diyet veya parametreleri olarak değişen öncesi veya sonrası yaralanma parametreleri ile tespit edilebilirBahar sapma açısı veya tekrarlayan grev arasındaki zaman gibi HIT cihazı. Son olarak, HIT cihazı gibi TBI sonuçları genç bireylere göre daha yaşlı bireylerde kötü neden yanı sıra tedavileri tanımlamak için kullanılabilecek büyük ölçekli ilaç ekranlar için temel soruları yanıtlamak için geniş çaplı genetik ekranlar için de kullanılabilir TBI sonuçları.

Tutarlı bir şekilde kullanıldığı zaman, HIT cihazı bağımsız deneyler ve kullanıcılar arasında tekrarlanabilir fenotipleri ürettiğini bulduk. Tekrarlanabilirlik etkileyebilecek parametreler HIT cihazın set-up ve işletme bulunmaktadır. Fenotipleri ölçüde küçük tahta, sinek flakon pamuk pozisyonuna buz kovası kapağı göreli konumunda değişiklikler ve Velcro şerit şişe göreceli pozisyonu etkilenebilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, başka, fenotipleri önemli ölçüde küçük değişiklikler etkilenebilirbahar sapma açısı. Böylece, HIT cihazının yeni kullanıcılar set-up ve operasyon diğer kullanıcıların farksız olmasını sağlamak için takip edilmelidir. Biz rutin onları MI 24 1118 sinekler w eski 0-7 gün belirlemek suretiyle yeni kullanıcıları kalibre. Son olarak, cihaz, HIT protokolünde tarif edilene özdeş olması gerekmez. Biz sinekler TBI indirebilmek için yeteneği korurken HIT cihazın en kısımları değiştirilebilir bekliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa herhangi bir çıkar çatışmaları var.

Acknowledgments

Bu çalışma Sağlık hibe, R01 AG033620 (BG) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Robert Draper Teknoloji İnovasyon Finansman (DAW) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zinc plated compression spring The Hillman  Group 540189 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm)
Wooden board 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm)
Clamps Sigma Electrical Manufacturing Corporation 49822 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm)
Polyurethane ice bucket cover Fisher Scientific 02-591-45 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm)
Plastic fly vials Applied Scientific AS-510 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm)
Large cotton balls Fisher Scientific 22-456-883
Paper protractor 10 inch (diameter, 25.4 cm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harrison-Felix, C. L., Whiteneck, G. G., Jha, A., DeVivo, M. J., Hammond, F. M., Hart, D. M. Mortality over four decades after traumatic brain injury rehabilitation: A retrospective cohort study. Arch Phys Med Rehabil. 90, 1506-1513 (2009).
  2. Coronado, V. G., et al. Surveillance for traumatic brain injury-related deaths – United States. MMWR Surveill Summ. 60, 1-32 (1997).
  3. Masel, B., DeWitt, D. S. Traumatic brain injury: A disease process, not an event. J. Neurotrauma. 27, 1529-1540 (2010).
  4. Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76, 886-899 (2012).
  5. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models Mech. 6, 1307-1315 (2013).
  6. Menon, D. K. Unique challenges in clinical trails in traumatic brain injury. Crit Care Med. 37, S129-S135 (2009).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Rev Neurosci. 14, 128-142 (2013).
  8. Balsiger, Z., Leudkte, J., Mawer, S., Willey, M. HIT device high speed analysis. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hkmCXwPacBQ (2014).
  9. Davceva, N., Janevska, V., Illevski, B., Petrushevska, G., Popeska, Z. The occurrence of acute subdural haematoma and diffuse axonal injury as two typical acceleration injuries. J Forensic Leg Med. 19, 480-484 (2012).
  10. Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Wassarman, D. R., Petersen, A. J., Ganetzky, B., Wassarman , D. A. A Drosophila. model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110, E4152-E4159 (2013).
  11. Fang, Y., Bonini, N. M. Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila .models of nerve injury. Annu Rev Cell Biol. 28, 575-597 (2012).
  12. Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J Vis Exp. (84), e51223 (2014).
  13. Tully, T., Preat, T., Boynton, S. C., Vecchio, M. D. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
  14. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila.: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).

Tags

Nörobilim Sayı 100, ölüm travmatik beyin yaralanması

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015. Citeable Link.

An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:

Barry Ganetky

to:

Barry Ganetzky

Kapalı Başkanı Travmatik Beyin yaralayabilecek Bir Yöntem<em&gt; Drosophila</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A.,… More

Katzenberger, R. J., Loewen, C. A., Bockstruck, R. T., Woods, M. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J. Vis. Exp. (100), e52905, doi:10.3791/52905 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter