Introduction
Behandelingsopties voor infectieziekten zijn gecompliceerd door de snelle toename van multiresistente bacteriën die immuun zijn voor een breed scala van antibiotica 1 zijn. Met een hoge morbiditeit en mortaliteit van resistente bacteriën veroorzaakte infecties, bestaat er behoefte aan de ontwikkeling van geneesmiddelen processen escaleren en / of zoeken naar betere anti-bacteriële alternatieven voor therapeutische opties te verbeteren. De laatste tijd is de anti-virulentie benadering wint belang gezien de mogelijkheden in het voorkomen van virulentie via niet-bacteriedodende methoden, vandaar het verminderen van de risico's van resistentie mechanismen 2.
Quorum-sensing is een 'hoofdschakelaar' in bacteriële virulentie en verstoring van deze signalering fenomeen is een veelbelovende anti-virulentie methode tegen pathogenese 3. Het begin van virulentie vereist de accumulatie van quorum moleculen in de extracellulaire omgeving na een kritische bacteriepopulatie dichtheid wordt bereikt. Zoals quorum diffunderen terug in de intracellulaire matrix binden aan hun verwante receptors leidt tot de activering van virulentiefactoren en genen geassocieerd met resistentie tegen antibiotica en biofilmvorming 4. In het algemeen, quorum-sensing verstoring gaat remmen quorum molecuul en receptor interactie zonder dat primaire metabole routes. Daarom heeft het geen directe implicaties voor cellulaire groei. Omdat geschiktheid niet wordt aangetast, er minimale selectiedruk bacteriën evolueren en weerstand tegen dergelijke behandelingen 5 krijgen. Bovendien kunnen quorum-sensing verstoring verstoren inherent bacteriële beschermingsmechanismen zoals bij biofilmvorming, die bescherming tegen antibacteriële middelen verschaft en gastheer immuunreacties.
Geschat wordt dat 99% van de microben op aarde bestaat in complexe biofilm-achtige matrices, verleent cruciaal overleving voordelen voor de micro-organismen die binnen these structuren 6. Belangrijker vorming van deze sessiele domeinen is de oorzaak van de meeste hardnekkige en chronische ziekenhuisinfecties 7. Acinetobacter baumannii is een van de belangrijkste menselijke pathogenen die verband houden met globale ziekenhuisinfecties en de virulentie is grotendeels toegeschreven aan quorum-sensing gemedieerde biofilmvorming 8. Quorum-quenching enzymen zijn met succes gebruikt bij het verstoren van quorum-gemedieerde signaaltransductie door zich te richten een groep van verbindingen bekend als N-acyl homoserine lactonen (AHL's) die worden gevormd door Gram-negatieve bacteriën 9. Verschillende studies hebben ook uitgebreid op het gebruik van deze enzymen om bacteriële pathogenese te blokkeren door de vermindering van virulentiefactor expressie en celaantallen in biofilms 10,11. Helaas blijft er een gebrek aan tastbare demonstratie van het effectieve gebruik van quorum quenching enzymen tegen biofilmvorming door bacteriële pathogenen. Dere pogingen om quorum remmers (AHL-analoga), in plaats van quorum-quenching enzymen, A. verstoren geweest baumannii biofilmvorming 12. Hoewel deze methode van het gebruik van kleine moleculen remmers is een geldig aanpak, het behoud van de biologische beschikbaarheid in translationeel toepassingen kan een uitdaging zijn. Daarentegen kan het gebruik van katalytische-quorum quenching enzymen de biobeschikbaarheid probleem omzeilen enzymen ontvankelijker richting immobilisatie op oppervlakken van biomedische inrichtingen voor therapeutische effecten.
Hier beschrijven we een beoordeling van de effecten van gemanipuleerde-quorum blussen lactonases van Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 op bacteriële biofilmvorming, met behulp van kristalviolet kleuring en confocale laser scanning microscopie (CLSM). Deze studie is de eerste succesvolle demonstratie van biofilm verstoring in een klinisch relevante A. baumannii S1 stam met behulp van quorum-blussen enzymen. De werkwijzen beschrevenin deze studie zijn bruikbaar voor het beoordelen van de werkzaamheid van andere quorum quenching enzymen in latere therapeutische ontwikkelingsinspanningen tegen pathogene Gram-negatieve bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crystal Violet kwantificering van Biofilm Formation in A. baumannii S1
- Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 lysogenie bouillon (LB) (trypton 10 g / l, gistextract 5 g / l) bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur.
- Pas de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD 600 van 0,8. Met behulp van een 96-wells plaat, beënt de bacteriecultuur (1: 100 verdunning) in vers LB dat 10 ui gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 100 pl.
- Bereid een controle cultuur als goed; Deze ontvangt geen enzymen bevatten. Herhaal vergelijkbare omstandigheden om het gewenste aantal herhalingen opleveren.
- Bedek de plaat met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L kunststoffles. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media.
- Voeg nog 100 ul vers LB-medium tot het putje en incubeer de plaat gedurende 21 uur bij 30 ° C. Na de tweede periode van incubatie, verwijder voorzichtig alle media. Was de planktonische bacteriën cel met 200 pi steriel water. Zorg ervoor dat er slechts een minimale verstoring van de cellen tijdens het wassen.
- Voeg 100 ul van 1% kristalviolet oplossing in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kristalvioletoplossing door het behandelde goed met 200 ul steriel water. Herhaal het wassen voor nog twee keer.
- Voeg 100 ui 33% azijnzuur aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden; Dit zal de kleurstof oplossen.
- Kwantificeren van de hoeveelheid biofilm gevormd door de absorptie van kristalviolet bij 600 nm. De hoeveelheid kristalviolet evenredig met de hoeveelheid biofilm gevormd.
2. confocale laser scanning microscopie van A. baumannii S1 Biofilm
- Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 in LB bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur.
- Advertentiealleen de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD 600 van 0,8. Met behulp van een 35 mm glazen bodem μ-schotel, te enten van de bacteriën cultuur (1: 100 verdunning) in de frisse LB met 30 ul van gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 1 ml.
- Bedek de μ-schotel met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L plastic container. Incubeer de μ-schotel bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media. Voeg 30 ul van gezuiverd GKL enzym en vers medium, waardoor deze tot een totaal volume van 1 ml. Incubeer nog eens 21 uur bij 30 ° C.
- Herhaal stap 2,3 en incubeer de μ-schotel nog eens 24 uur bij 30 ° C. Verwijder vervolgens de media voorzichtig.
- Voeg 500 ul van 5 ug / ml Alex Fluor 488-geconjugeerd tarwekiem agglutinine (WGA) opgelost in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) aan de μ-schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; Dit zal het gevormde biofilm vlek. Verwijder de kleuroplossing en wassen thij u-schotel met 2 ml HBSS. Herhaal de wasstap nog een keer.
- Voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde opgelost in HBSS en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; dit zal de biofilm op de μ-Dish lossen. Was de μ-schotel eenmaal met 2 ml HBSS en volledig verwijder de oplossing. De μ-schotel met biofilm vastgesteld kan worden bewaard in het donker bij 4 ° C voorafgaand aan CLSM beeldvorming.
- Voor CLSM beeldvorming en analyse gebruikt 63 keer vergroot tot 97 stapels per beeld te genereren met een interval van 0,21 micrometer per stapel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het kristal violet kwantificering experiment werden twee quorum-blussen enzymen die worden gebruikt om de haalbaarheid aan te tonen in het verstoren van biofilmvorming: wild-type GKL en een verbeterde GKL dubbele mutant (E101G / R230C). Beide enzymen bleken lactonase-activiteit vertonen tegen 3-hydroxy-decanoyl-L-homoserinelacton (3-OH-C 10 -HSL), grote quorum molecuul gebruikt door A. baumannii S1 14. Voor geldige beoordeling van de biofilm verstoring, werden hun respectieve katalytisch inactieve enzymen (voorheen aangetoond dat het niet sequester AHL liganden) ook als onmiddellijke controles (GKL D266N mutant en GKL E101G / R230C / D266N mutant). Naast het gebruik van wild-type A. baumannii S1, de biofilm vorming vermogen van een mutant Δ abai stam (AHL-synthase-deficiënte) werd ook getest. Zowel quorum-blussen enzymen, wild-type GKL en GKL E101G / R230C mutant konden biofilmvorming aanzienlijk te verminderen in de prebehandelde A. baumannii S1 kweken (n = 10; p-waarde ≤ 0,0001) (Figuur 1). Toch is de omvang van biofilm verstoring van beide enzymen is evenredig met de werkzaamheid tegen 3-OH-C 10 -HSL. De omloopsnelheid (k cat) van de GKL E101G / R230C mutant is zes keer sneller dan wild-type GKL tegen 3-OH-C 10 -HSL 14. Het verschil in de mate van biofilm verstoring tussen de enzymen slechts tweeledig.
Figuur 1. A. baumannii biofilm verstoring assay. Biofilmvorming werd gemeten door kristalviolet kleuring. Rode kolommen geven de hoeveelheid biofilm gevormd door wild type A. baumannii en Δ Abai mutant, zonder de toevoeging van quorum-blussen lactonases. Blauwe kolommen vertegenwoordigen de amount van biofilm gevormd door wild-type A. baumannii in aanwezigheid van vier verschillende GKL enzymen: inactief GKL D266N mutant, wild-type GKL, inactief GKL E101G / R230C / D266N mutant en GKL E101G / R230C mutant. ****, P- waarde van ≤ 0,0001. Overgenomen met toestemming van Antimicrobial Agents en Chemotherapie 58, 1802-1805 (2014). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Confocale beeldvorming van A. baumannii S1 biofilmvorming werd gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve maat van quorum-quenching effect op de structurele morfologie van deze sessiele-domeinen. De verbeterde GKL E101G / R230C mutant en katalytisch inactieve enzymen werden gebruikt ter vergelijking. Het verschilbeeld contrast beeld (DIC) toonden aan dat behandeling met de verbeterde GKL E101G / R230C mutant resulteerde in een afname van de biofilm maat (Figure 2). Analyse van de fluorescentiebeelden bleek ook dat er areaalinkrimping, biomassa en gemiddelde dikte van de biofilm worden behandeld met de verbeterde GKL E101G / R230C mutant (Tabel 1).
Figuur 2. Vertegenwoordiger confocale laser scanning microscopie beelden van A. baumannii biofilms. A. baumannii biofilms werden behandeld met inactieve GKL E101G / R230C / D266N mutant (A) en GKL E101G / R230C mutant (B) en gekleurd met Alexa Fluor 488-geconjugeerd WGA. DIC beelden van de biofilms (links) en fluorescentie beelden van de biofilms (rechts) getoond voor representatieve xy (midden), YZ (rechts), en xz (onder) delen. Overgenomen met toestemming van Antimicrobial Agents en Chemotherapie <strong> 58, 1802-1805 (2014). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Waarde ± SD een | |||
| Karakteristiek | Geen behandeling | Behandeling met inactieve mutant | Behandeling met E101G / R230C mutant |
| Biomassa (pm 3 / um 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | 1.37 ** ± 0.20 |
| Gemiddelde dikte (um) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** ± 0.21 |
| Oppervlakte (pm) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| een n = 10 image stacks. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, in vergelijking met de behandeling met inactieve E101G / R230C / D266N mutant. | |||
Tabel 1. A. baumannii biofilm structurele kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In beide reeksen experiment A. baumannii S1 werd gekweekt in LB-medium zonder NaCl als een hoge zoutconcentratie kan de hoeveelheid biofilm gevormd door de bacteriën 15 te verminderen. De aanwezigheid van dergelijke artefact zou de hoeveelheid biofilm gevormd, evenals de effecten van quorum quenching enzymen in verschillende behandelingsomstandigheden onderschat. Het gebruik van een katalytisch inactieve enzym belangrijk als een negatieve controle de mogelijke effecten enzym sekwestratie elimineren. Figuur 1 laat zien dat zelfs als inactieve enzymen sekwestreren quorum moleculen is biofilmvorming niet verstoord.
A. baumannii S1 vormt een delicaat ringachtige biofilmstructuur tussen lucht en vloeistof interface in de well van de 96-well plaat. Daarom is het van cruciaal belang om overmatig bewegen tijdens media verwijderen en wassen stappen om incidentele verwijdering van bacteriële biofilms voorkomen voorkomen. LB medium werd verwijderd na elke incubatieelimineren planktonische cellen. Bovendien werd de 96-wells plaat in een 10 liter kunststof container verstoringen in de luchtstroom te minimaliseren en een micro-anaërobe omgeving die biofilmvorming begunstigt. Biofilm kwantificering in een 96-well plaat is ook afhankelijk van de hoeveelheid crystal violet toegevoegd aan elk putje. Indien overtollige kristalviolet toegevoegd in een put, kan het aantal wasstappen worden verhoogd. Het kristal violet kleuring experiment levert een relatieve vergelijking van quorum-quenching efficiëntie in biofilm verstoring. Hoewel kristalviolet kleuring kwantitatief te meten biofilmvorming is het slechts semi-kwantitatief in termen van de katalytische efficiëntie van quorum-quenching enzymen. Voor nauwkeurige statistische vergelijking voldoende steekproefomvang van belang voor de verschillende behandelingsgroepen. Uitbijters moet worden verwijderd om onjuiste voorstelling van resultaten te voorkomen.
Confocale beeldvorming en analyse van bacteriële biofilm is een USEFul hulpmiddel voor de beoordeling van de kwalitatieve effecten van quorum blussen enzymen. Echter, kan het selecteren biofilm analyse potentieel kanaal voor vertekening als de gebruiker zich bewust is van het type quorum-quenching enzym toegediend (actief of niet actief). Om de mogelijkheid van partijdigheid te vermijden, kan het experiment worden ontworpen om enzym informatie uit te sluiten van de gebruiker of een willekeurige aanpak voor de selectie. Een onbevooroordeelde selectie strategie maakt ook betere kwantitatieve vergelijking van biofilm morfologie door CLSM. Toch is dit de eerste studie die een werkwijze beschrijft voor het evalueren van de resultaten van quorum quenching enzymen van bacteriën biofilms. Kristalviolet kleuring heeft aangetoond dat het nut van-quorum blussen enzymen in biofilm verstoring en onthulde dat enzymen 'modi operandorum niet beperkt zijn tot het verminderen van het aantal cellen en de virulentie factor expressie. Ondertussen kunnen morfologische veranderingen bepaald door CLSM analyse ook inzicht in mogelijke molecular doelstellingen van deze enzymen. Alhoewel het huidige experiment werd ontworpen om de effecten van enzymen voorbehandeling op de bacteriële biofilms te onderzoeken, kan het protocol worden gewijzigd om het effect van de enzymen op vooraf gevormde biofilm beoordelen door toevoeging van het enzym na bacteriële groei of haar competentie onder fysiologische omstandigheden worden onderzocht door het gebruik van serum -achtige voorwaarden voor cultuur. Het protocol voor GKL enzymen te bestuderen kan worden uitgebreid tot andere quorum-quenching enzymen pathogenen en hun relatie biofilm verstoring onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
