Introduction
Behandlingsalternativ för infektionssjukdomar har komplicerats av den snabba ökningen av multiresistenta bakterier som är immuna mot ett brett spektrum av antibiotika 1. Med hög sjuklighet och dödlighet från resistenta bakteriemedie infektioner, det finns ett behov av att eskalera läkemedels utvecklingsprocesser och / eller utforska bättre antibakteriella alternativ för att förbättra terapeutiska möjligheter. På senare tid har den anti-virulens strategi ökar intresset med tanke på dess potential att förebygga virulens via icke-bakteriedödande metoder, därmed minska riskerna för resistensmekanismer 2.
Quorum avkänning är en "huvudströmbrytare" i bakteriell virulens och störningar i denna signalering fenomen är en lovande anti-virulens metod mot patogenes 3. Uppkomsten av virulens kräver ansamling av beslutförhet molekyler i den extracellulära omgivningen efter en kritisk bakteriepopulation täthet uppnås. Som quorom molekyler diffunderar tillbaka in i intracellulära matris, bindning med deras besläktade receptorer leder till aktivering av virulensfaktorer samt gener associerade med antibiotikaresistens och biofilmbildning 4. I allmänhet, quorum kännande störningar innebär att hämma quorum molekyl och receptorinteraktion utan att påverka primära metabola vägar. Därför har det inte någon direkt implikation på celltillväxt. Eftersom lämplighet inte äventyras, det är minimal selektionstryck för bakterier att utvecklas och få motståndskraft mot sådana behandlingar 5. Dessutom kan quorum-sensing störningar störa inneboende bakterieskyddsmekanismer, som i fallet av biofilmbildning, vilket ger skydd mot antibakteriella medel och värdimmunsvar.
Det uppskattas att det finns 99% av mikrober på jorden i komplexa biofilm liknande matriser, som ger viktiga överlevnads fördelar för mikroorganismerna som lever inom these strukturer 6. Ännu viktigare är bildandet av dessa fastsittande domäner orsaken till de flesta långlivade och kroniska sjukhusförvärvade infektioner 7. Acinetobacter baumannii är en av de viktigaste humana patogener som är förknippade med globala sjukhusförvärvade infektioner och dess virulens är till stor del tillskrivas quorum kännande medierad biofilm formation 8. Quorum läckande enzymer har använts framgångsrikt i att störa beslutför-medierad signaltransduktion genom att rikta en grupp av föreningar som kallas N-acyl homoserinlaktoner (Ahls) som produceras av gramnegativa bakterier 9. Flera studier har också expanderat på användningen av dessa enzymer för att blockera bakteriell patogenes genom att minska virulensfaktorn uttryck och cellantal i biofilmer 10,11. Tyvärr finns det fortfarande en brist på påtaglig demonstration av en effektiv användning av kvorum- läckande enzymer mot biofilmbildning av bakteriella patogener. Dere har gjorts försök att använda kvorummöten hämmare (AHL analoger), i stället för kvorum- läckande enzymer, för att störa A. baumannii biofilm formation 12. Även om denna metod för att använda små molekyler hämmare är en effektiv strategi, kan upprätthålla sin biotillgänglighet i translationella användningsområden vara en utmaning. Tvärtom skulle användningen av katalytiska beslutförhet läckande enzymer kringgå biotillgänglighet fråga som enzymer är mer mottagliga mot immobilisering på ytor av biomedicinska anordningar för terapeutiska effekter.
Här beskriver vi en bedömning av effekterna av manipulerade kvorum- läckande lactonases från Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 på bakteriell biofilm bildning, användning av kristallviolett färgning och konfokala laserskanning mikroskopi (CLSM). Denna studie är den första lyckade demonstrationen av biofilm störningar i en kliniskt relevant A. baumannii S1-stam med användning kvorum- läckande enzymer. Metoderna beskrivnai denna studie är användbara för att bedöma effekten av andra kvorum- läckande enzymer i efterföljande terapeutiska utvecklingsinsatser mot patogena gramnegativa bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crystal Violet kvantifiering av biofilmbildning i A. baumannii S1
- Odla en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i lysogeni-buljong (LB) (trypton 10 g / liter, jästextrakt 5 g / I) vid 30 ° C i en skakinkubator (220 rpm) under 16 timmar.
- Justera kultur av A. baumannii S1 till en önskad OD 600 av 0,8. Med användning av en 96-brunnars platta, ympa bakteriekulturen (1: 100 spädning) i färskt LB innehållande 10 | il av renat GKL enzym (40 mg / ml); den nya kulturen slutliga volym är 100 l.
- Förbered en kontrollkultur samt; Detta kommer inte att innehålla något enzym. Upprepa likartade förhållanden för att ge önskat antal upprepningar.
- Täck plattan med ett lock och placera den i en förseglad 10 L plastbehållare. Inkubera plattan vid 30 ° C under 3 h före försiktigt avlägsna media.
- Lägg ytterligare 100 | il färskt LB-medium till brunn och inkubera plattan under 21 h vid 30 ° C. Efter den andra perioden av inkubering, försiktigt bort all media. Tvätta planktonbakteriecellen med 200 | j, l sterilt vatten. Säkerställ att det finns endast minimal störning till cellerna under tvättningen.
- Tillsätt 100 ni 1% kristallviolett lösning till varje brunn och inkubera under 15 min vid RT. Avlägsna kristallviolettlösning genom tvättning av brunnen med 200 ul sterilt vatten. Upprepa tvätta två gånger till.
- Tillsätt 100 ni 33% ättiksyra till varje brunn och inkubera under 15 min med försiktig skakning; detta kommer att upplösa färgämnet.
- Kvantifiera mängden av biofilm bildad genom att mäta absorbansen av kristallviolett vid 600 nm. Mängden kristallviolett är proportionell mot mängden av biofilm bildas.
2. konfokal laserscanningsmikroskopi A. baumannii S1 Biofilm
- Odla en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i LB vid 30 ° C i en skakinkubator (220 rpm) under 16 timmar.
- A.dbara den kultur av A. baumannii S1 till en önskad OD 600 av 0,8. Med användning av en 35 mm glasbottnad μ-skålen, ympa bakteriekulturen (1: 100 spädning) i färskt LB innehållande 30 pl renat GKL enzym (40 mg / ml); den nya kulturen slutliga volymen är 1 ml.
- Täck μ-skålen med ett lock och placera den i en förseglad 10 L plastbehållare. Inkubera μ-skålen vid 30 ° C under 3 h före försiktigt avlägsna media. Tillsätt 30 ul av renat GKL enzym och färskt medium, föra den till en total volym av 1 ml. Inkubera i ytterligare 21 h vid 30 ° C.
- Upprepa steg 2,3 och inkubera μ-skålen i ytterligare 24 h vid 30 ° C. Ta sedan bort mediet försiktigt.
- Tillsätt 500 pl av 5 | ig / ml Alex Fluo 488-konjugerad vetegroddagglutinin (WGA) löst i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till μ-skålen och inkubera vid 37 ° C under 30 min; detta färgar den bildade biofilmen. Ta bort färgningslösningen och tvätta than | j-Dish med 2 ml HBSS. Upprepa tvättn en gång till.
- Tillsätt 500 pl av 3,7% formaldehyd löst i HBSS och inkubera vid 37 ° C under 30 min; Detta kommer att fixa biofilmen på μ-Dish. Tvätta μ-Dish gång med 2 ml HBSS och sedan ta bort lösningen helt. Den μ-Dish fast med biofilm kan lagras i mörker vid 4 ° C före CLSM avbildning.
- För CLSM bildbehandling och analys, använder 63 gångers förstoring för att generera 97 staplar per bild med ett intervall på 0,21 um per stack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I kristallviolett kvantifiering experiment två beslutsförhet läckande enzymer används för att demonstrera genomförbarheten i att störa biofilmsbildning: vildtyp GKL och en förbättrad GKL dubbel mutant (E101G / R230C). Båda enzymerna har visat sig demonstrera laktonas aktivitet mot 3-hydroxi-dekanoyl-L-homoserinlakton (3-OH-C 10 -HSL), den viktigaste quorum molekyl som används av A. baumannii S1 14. För giltigt bedömning av biofilm störningar, deras respektive katalytiskt inaktiva enzymer (tidigare visat sig inte binda AHL-ligander) ingår också som omedelbara kontroller (GKL D266N mutant och GKL E101G / R230C / D266N mutant). Förutom att använda vild-typ A. baumannii S1, biofilmen bildande förmågan hos en mutant Δ Abai stam (AHL-syntas-defekta) testades också. Både beslutförhet läckande enzymer, vildtyp GKL och GKL E101G / R230C mutanta kunde avsevärt minska biofilmbildning i prebehandlade A. baumannii S1 kulturer (n = 10, p-värde ≤ 0,0001) (Figur 1). Ändå är omfattningen av biofilm störningar för båda enzymerna inte i proportion till deras effektivitet mot 3-OH-C 10 -HSL. Omsättningshastigheten (kcat) i GKL E101G / R230C mutanten är sex gånger snabbare än vildtypen GKL mot 3-OH-C 10 -HSL 14. Emellertid är skillnaden i graden av biofilm störningar mellan enzymerna endast två gånger.
Figur 1. A. baumannii biofilm störningar analys. Biofilm bildning mättes genom kristallviolettfärgning. Röda kolumnerna representerar mängden biofilm som bildas av vild typ A. baumannii och Δ Abai mutant, utan tillsats av beslutförhet läckande lactonases. Blå kolumnerna representerar amount av biofilm som bildas av vild-typ A. baumannii i närvaro av fyra olika GKL enzymer: inaktiv GKL D266N mutanta, vildtyp GKL, inaktiv GKL E101G / R230C / D266N mutanta och GKL E101G / R230C mutanta. ****, P- värde ≤ 0,0001. Återges med tillstånd från Antimicrobial Agents and Chemotherapy 58, 1802-1805 (2014). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Konfokal avbildning av A. baumannii S1 biofilmsbildning användes för att ge ett kvalitativt och kvantitativt mått på beslutförhet läckande effekter på den strukturella morfologin hos dessa fastsittande domäner. Den förbättrade GKL E101G / R230C mutanten och dess katalytiskt inaktivt enzym användes för jämförelse. Differentialbildkontrast (DIC) bild visade att behandling med den förbättrade GKL E101G / R230C mutanten resulterade i en minskning av biofilm storlek (Figure 2). Analys av fluorescens bilder visade också att det fanns minskning av ytan, biomassa och medeltjocklek biofilm vid behandling med den förbättrade GKL E101G / R230C mutanten (tabell 1).
Figur 2. Representativa konfokal laserscanningsmikroskopi bilder av A. baumannii biofilmer. A. baumannii biofilmer behandlades med inaktiv GKL E101G / R230C / D266N mutanten (A) och GKL E101G / R230C mutanten (B) och färgades med Alexa Fluor 488-konjugerad WGA. DIC bilder av biofilmer (vänster) och fluorescens bilder av biofilmer (höger) visas för representativa xy (mitten), yz (till höger), och xz (botten) sektioner. Återges med tillstånd från Antimicrobial Agents and Chemotherapy <strong> 58, 1802-1805 (2014). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Värde ± SD en | |||
| Karakteristisk | Ingen behandling | Behandling med inaktiv mutant | Behandling med E101G / R230C-mutanten |
| Biomassa (im 3 / im 2) | 2,57 ± 1,65 | 3,39 ± 1,33 | 1,37 ** ± 0,20 |
| Genomsnittligt tjocklek (nm) | 3,68 ± 2,51 | 3,41 ± 1,31 | 1,21 ** ± 0,21 |
| Yta (pm) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| a n = 10 bildstaplar. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, jämfört med behandling med inaktiva E101G / R230C / D266N mutanten. | |||
Tabell 1. A. baumannii biofilmen strukturell kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I båda uppsättningarna av experiment A. baumannii S1 odlades i LB-medium utan NaCl som en hög saltkoncentration kan minska mängden av biofilm som bildas av bakterierna 15. Närvaron av sådan artefakt kan underskatta mängden av biofilm bildad, liksom effekterna av kvorum- läckande enzymer i olika behandlingsbetingelser. Användningen av ett katalytiskt inaktivt enzym är viktigt som en negativ kontroll för att eliminera de möjliga effekterna av enzym kvarstad. Figur 1 visar att även om inaktiva enzymer sekvestrerar beslutförhet molekyler är biofilm formation inte störs.
A. baumannii S1 bildar en delikat ringliknande biofilm struktur mellan luft och vätskegränsytan i brunnen av 96-brunnar. Därför är det viktigt att undvika överdriven agitation under medie borttagning och tvätt åtgärder för att förhindra oavsiktlig borttagning av bakteriella biofilmer. LB-medium avlägsnades efter varje inkubation tilleliminera planktonceller. Dessutom var den 96-brunnar placerades i en 10 L plastbehållare för att minimera störningar i luftflödet och för att skapa en mikro anaerob miljö som gynnar bildning av biofilm. Biofilm kvantifiering i en 96-brunnar är också beroende på mängden kristallviolett tillsattes till varje brunn. I händelse av att överskottet av kristallviolett tillsätts i en brunn, kan antalet tvättningssteg ökas. Kristallviolett färgning experiment ger en relativ jämförelse av beslutsmässighet läckande effektivitet i biofilm störningar. Fastän kristallviolettfärgning är kvantitativ för mätning biofilmbildning är det endast semikvantitativ i termer av den katalytiska effektiviteten hos kvorum- läckande enzymer. För exakt statistisk jämförelse tillräckliga provstorlekar är viktiga för de olika behandlingsgrupperna. Extremvärden bör också tas bort för att förhindra förvrängning av resultat.
Konfokal avbildning och analys av bakteriell biofilm är en USEFul verktyg för att bedöma de kvalitativa effekterna av kvorum- läckande enzymer. Emellertid kan processen att välja biofilmen för analys vara ett potentiellt kanal för förspänning om användaren är medveten om vilken typ av quorum läckande enzym administreras (aktiv eller inaktiv). För att undvika risken för bias, kan försöket utformas för att utesluta enzym information från användaren eller använd ett slumpmässigt tillvägagångssätt för val. En opartisk urvalsstrategi möjliggör också bättre kvantitativ jämförelse av biofilm morfologier av CLSM. Ändå är detta den första studien som beskriver en metod för att utvärdera resultatet av beslutförhet läckande enzymer på bakteriella biofilmer. Kristallviolettfärgning har visat användbarheten av beslutförhet läckande enzymer i biofilm avbrott och avslöjade att enzymers modi operandorum inte är begränsade till att minska cellantal och virulensfaktorn uttryck. Samtidigt kan morfologiska förändringar bestäms av CLSM analys också ge insikter om misstänkt molecular mål av dessa enzymer. Även om den nuvarande experiment utformades för att undersöka effekterna av enzymer förbehandling på bakteriella biofilmer, kan protokollet modifieras för att bedöma enzymets effekt på förformad biofilm genom tillsats av enzymet efter bakterietillväxt eller för att undersöka sin kompetens under fysiologiska förhållanden genom användning av serum -liknande villkor för kultur. Det protokoll som används för att studera GKL enzymer kan utvidgas till andra kvorum läckande enzymer och patogener att undersöka deras förhållande i biofilm störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
