Introduction
אפשרויות טיפול במחלות זיהומיות כבר מסובכות על ידי הגידול המהיר בחיידקים עמיד multidrug כי הם חסינים מפני מגוון רחב של תרופות אנטיביוטיות 1. עם תחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מזיהומים בתיווך חיידקים עמידים, יש צורך להסלים תהליכי פיתוח תרופות ו / או לחקור חלופות אנטי בקטריאלי טובים יותר כדי לשפר את האפשרויות טיפוליות. בזמן האחרון, הגישה האנטי-האלימות היא צוברת ריבית נתון את הפוטנציאל שלה במניעת אלימות באמצעות שיטות לא-bactericidal, ומכאן מקלים הסיכונים של מנגנוני התנגדות 2.
מניין החישה היא "מתג ראשי" בארסיות ושיבוש תופעת איתות זה חיידקים הוא שיטה אנטי-אלימות נגד מבטיחה פתוגנזה 3. תחילתה של אלימות דורשת ההצטברות של מולקולות מניין בסביבה תאית לאחר שהגיעה לצפיפות אוכלוסיית חיידקים קריטית. כקווהמולקולות רום מפוזרות בחזרה לתוך המטריצה תאית, מחייב עם קולטנים המקור שלהם מובילה להפעלה של גורמים ארסי כמו גם גנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות biofilm 4. בשיבוש כללי, מניין חישה כרוך עיכוב מולקולת מניין ואינטראקציה קולט מבלי להשפיע על מסלולי מטבוליים עיקריים. מכאן, שאין לה שום השלכה ישירה על צמיחה סלולרית. מאז כושר לא נפגעים, יש לחץ בחירה מינימאלי לחיידקים להתפתח ולהשיג התנגדות נגד טיפולים כגון 5. בנוסף, הפרעה מניין חישה יכולה להפריע למנגנוני הגנת חיידקים טבועים, כמו במקרה של היווצרות biofilm, המספקת הגנה מפני חומרים אנטי-בקטריאלי ויארח את תגובה חיסונית.
הערכה היא כי 99% מחיידקים על פני כדור הארץ קיימים במטריצות כמו biofilm-מורכבות, המקנות יתרונות הישרדות חיוניות למיקרואורגניזמים שחיים בתוך המבני ESE 6. יותר מכך, היווצרות של תחומים נייחים אלה היא הסיבה לזיהומים נרכשים בבית חולים מתמשכים והכרוניים ביותר 7. Acinetobacter baumannii היא אחד מגורמי המחלה האנושיים הגדולים שמזוהה עם זיהומים נרכשים בבית חולים העולמיים והארסיות שלה מיוחסת במידה רבה למניין חישה היווצרות biofilm תיווך 8. אנזימים-מרווה מניין שימשו בהצלחה בשיבוש העברת אותות בתיווך מניין על ידי מיקוד קבוצה של תרכובות המכונית lactones -acyl N homoserine (AHLs) המיוצרים על ידי חיידקים גראם-שלילי 9. גם מספר מחקרים הרחיבו את השימוש באנזימים אלה כדי לחסום פתוגנזה של חיידקים באמצעות הפחתת מספרי ביטוי גורם ארסיות ותא בbiofilms 10,11. למרבה הצער, יש עדיין חוסר ההפגנה מוחשית של השימוש היעיל של אנזימי מרווה-מניין נגד היווצרות biofilm ידי חיידקים פתוגנים.מחדש נעשו ניסיונות להשתמש מעכבי מניין (אנלוגים AHL), במקום אנזימי מרווה-מניין, לשבש א היווצרות biofilm baumannii 12. למרות ששיטה זו של שימוש במעכבי מולקולות קטנות היא גישה חוקית, שמירה על הזמינות הביולוגית שלה בשימושים translational יכולה להיות אתגר. להיפך, השימוש באנזימי מרווה-מניין קטליטי יכול לעקוף את הבעיה הזמינות הביולוגית כאנזימים הם נוחים יותר לחוסר תנועה על משטחים של מכשירים ביו-רפואיים להשפעות טיפוליות.
כאן אנו מתארים הערכה של ההשפעות של lactonases מרווה-מניין מהונדס מkaustophilus Geobacillus (GKL) 13 על היווצרות biofilm חיידקים, באמצעות מכתים סגול גביש ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). מחקר זה הוא ההפגנה המוצלחת הראשונה של שיבוש biofilm בא רלוונטי קליני זן baumannii S1 באמצעות אנזימי מרווה-מניין. השיטות שתוארובמחקר זה הם שימושיים להערכת יעילותם של אנזימי מרווה-מניין אחרים במאמצי פיתוח טיפוליים שלאחר מכן נגד חיידקים גראם שלילית פתוגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קריסטל ויולט Quantitation של ההיווצרות biofilm בא baumannii S1
- לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 במרק Lysogeny (LB) (tryptone 10 גרם / L, 5 גר '/ L תמצית שמרים) על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
- התאם את התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. שימוש בצלחת 96-היטב, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 10 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 100 μl.
- הכן תרבות שליטה, כמו גם; זה לא יכיל כל אנזים. חזור על תנאים דומים ללהניב את המספר הרצוי של משכפל.
- מכסה את הצלחת עם מכסה ומניח אותו לתוך מיכל פלסטיק 10 ליטר אטום. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת.
- להוסיף בינוני LB הטרי עוד 100 μl להיטב דגירה הצלחת במשך 21 שעות על 30 מעלות צלזיוס. לאחר התקופה השנייה של דגירה, בעדינות להסיר את כל אמצעי התקשורת. שטוף את תא חיידקי פלנקטון עם מים סטריליים 200 μl. ודא שיש הפרעה מינימאלית בלבד לתאים במהלך כביסה.
- להוסיף 1% פתרון סגול גביש 100 μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב RT. הסר את הפתרון סגול גביש על ידי שטיפה היטב עם מים סטריליים 200 μl. חזור על לשטוף לעוד פעמיים.
- להוסיף 33% חומצה אצטית 100 μl לכל היטב דגירה למשך 15 דקות עם רעד עדין; זה יהיה לפזר את הצבע.
- לכמת את כמות biofilm נוצרה על ידי מדידת הספיגה של סגול קריסטל ב 600 ננומטר. כמות סגולה גביש היא פרופורציונלית לסכום של biofilm נוצר.
2. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית של א ' baumannii S1 Biofilm
- לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 בLB על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
- מוֹדָעָהרק התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. באמצעות μ-צלחת עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 30 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 1 מיליליטר.
- מכסה את μ-הצלחת עם מכסה ומניח אותו במכל פלסטיק אטום 10 ליטר. דגירה μ-הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת. הוסף 30 μl של אנזים GKL מטוהר ובינוני טריים, הבאתו להיקף כולל של 1 מיליליטר. דגירה עבור שעות 21 נוספות על 30 מעלות צלזיוס.
- חזור על שלב 2.3 ודגירת μ-התבשיל לשעה עוד 24 על 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את המדיה בעדינות.
- הוסף 500 μl של 5 מיקרוגרם / מיליליטר 488 מצומדות- agglutinin אלכס Fluo נבט חיטה (WGA) מומס בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) לμ-הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה כתם biofilm נוצר. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף tהוא μ-צלחת עם 2 מיליליטר של HBSS. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת.
- הוסף 500 μl של פורמלדהיד 3.7% מומסים בHBSS ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה לתקן את biofilm על μ-הצלחת. לשטוף את μ-צלחת פעם אחת עם 2 מיליליטר של HBSS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לחלוטין. קבוע עם biofilm μ-הצלחת ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה CLSM.
- הדמיה CLSM וניתוח, להשתמש 63 הגדלת פעמים כדי ליצור 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרומטר לערימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי quantitation הסגול גביש, שני אנזימי מרווה-מניין שמשו כדי להדגים היתכנות בשיבוש היווצרות biofilm: פרא-הסוג GKL ומוטציה משופר GKL כפולה (E101G / R230C). שני האנזימים הוכחו להפגין פעילות lactonase נגד 3-הידרוקסי-decanoyl-L-homoserine לקטון (3-OH-C 10 -HSL), מולקולת המניין המרכזית בשימוש על ידי א ' baumannii S1 14. להערכה תקפה של שיבוש biofilm, האנזימים שלהם בהתאמה catalytically לא פעילים (הראו בעבר שלא לעקל ligands AHL) נכללו גם כבקרה מיידית (המוטציה D266N GKL ו / R230C / מוטציה D266N GKL E101G). חוץ מזה באמצעות א wild-type baumannii S1, יכולת biofilm יוצרים של מתח Δ abaI מוטציה (אוהל synthase הלקוי) גם נבדק. שני אנזימי מרווה-מניין, wild-type GKL ומוטציה / R230C GKL E101G הצליחו להפחית באופן משמעותי היווצרות biofilm במראשא טופל תרבויות baumannii S1 (n = 10, p-ערך ≤ 0.0001) (איור 1). עם זאת, במידה של שיבוש biofilm עבור שני האנזימים היא לא פרופורציונלית ליעילותם נגד 3-OH-C 10 -HSL. שיעור התחלופה (k חתול) של המוטציה / R230C GKL E101G הוא שש פעמים מהר יותר מאשר פרא-הסוג GKL נגד 3-OH-C 10 -HSL 14. עם זאת, ההבדל בהיקף שיבוש biofilm בין האנזימים הוא כפול בלבד.
איור 1. א היווצרות baumannii assay שיבוש biofilm. Biofilm נמדדה על ידי צביעה סגולה גביש. עמודות אדומות מייצגות את הסכום של biofilm נוצר על ידי א סוג בר baumannii וΔ abaI מוטציה, ללא התוספת של lactonases מרווה-מניין. עמודות כחולות מייצגות את אמוUNT של biofilm נוצר על ידי א 'בר-הסוג baumannii בנוכחות ארבעה אנזימי GKL שונים: מוטציה GKL פעיל D266N, wild-type GKL, / R230C / מוטציה D266N פעילה GKL E101G ומוטציה / R230C GKL E101G. ****, P-ערך של ≤ 0.0001. לשכפל באישור מסוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה 58, 1,802-1,805 (2014). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ההדמיה confocal של א ' היווצרות biofilm baumannii S1 שימשה לספק מידה איכותית וכמותית של תופעות מרווה-מניין במורפולוגיה המבנית של תחומים אלה נייחים. המוטציה המשופרת GKL E101G / R230C והאנזים catalytically פעיל שלה שמשו להשוואה. לעומת תמונת ההפרש תמונה (DIC) הראתה כי טיפול במוטציה / R230C המשופרת GKL E101G הביאה לירידה בגודל biofilm (Figurדואר 2). ניתוח של תמונות הקרינה גם גילה שיש ירידה בשטח, ביומסה ועובי ממוצע של biofilm כאשר טופל במוטציה המשופרת GKL E101G / R230C (טבלת 1).
תמונות מיקרוסקופי סריקת לייזר confocal 2. נציג איור של א ' biofilms baumannii. א טופלו biofilms baumannii עם R230C מוטציה פעילה GKL E101G / / D266N () וGKL E101G מוטציה / R230C (B) ומוכתם בAlexa פלואוריד 488-מצומדות WGA. תמונות של דסק"ש biofilms (משמאל) ותמונות הקרינה של biofilms (מימין) מוצגות לXY נציג (במרכז), YZ (מימין), וסעיפי XZ (תחתון). לשכפל באישור מסוכני מיקרוביאלית וכימותרפיה <strong> 58, 1,802-1,805 (2014). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ערך ± SD | |||
| מאפיין | אין טיפול | טיפול במוטציה לא פעילה | טיפול בE101G / מוטציה R230C |
| ביומסה (מיקרומטר 3 / מיקרומטר 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ** ± 0.20 |
| עובי ממוצע (מיקרומטר) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** ± 0.21 |
| שטח פנים (מיקרומטר) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| n = 10 ערימות תמונה. **, P ≤ 0.001; *, P ≤ 0.05, בהשוואה לטיפול עם E101G / R230C / מוטציה D266N לא פעילה. | |||
טבלה 1. א biofilm baumannii quantitation המבני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשני הסטים של ניסוי, א baumannii S1 היה בתרבית בתקשורת LB ללא NaCl כריכוז מלח גבוה יכול להפחית את כמות biofilm נוצרה על ידי החיידקים 15. נוכחותו של חפץ כזה יכול לזלזל בסכום של biofilm נוצר, כמו גם את ההשפעות של אנזימי מרווה-מניין פני תנאי טיפול שונים. השימוש באנזים catalytically פעיל הוא חשוב כביקורת שלילית לחסל את ההשפעות אפשריות של תפיסת אנזים. איור מציג 1 שגם אם אנזימים פעילים לעקל מולקולות מניין, היווצרות biofilm לא תופרע.
א baumannii S1 יוצר מבנה biofilm עדין כמו טבעת בין האוויר וממשק נוזלי בבאר של הצלחת 96-היטב. לפיכך, הוא חיוני כדי למנוע תסיסה מוגזמת במהלך שלבי הסרת תקשורת ושטיפה כדי למנוע ההסרה מקרית של biofilms חיידקים. תקשורת LB הוסרה לאחר כל דגירה ללחסל תאי פלנקטון. בנוסף, צלחת 96-היטב הושמה במכל פלסטיק 10 ליטר כדי למזער הפרעות בזרימת אוויר וליצור סביבת מיקרו-אנאירובי שמעדיפה היווצרות biofilm. quantitation biofilm בצלחת 96-היטב גם תלוי בכמות של סגול גביש הוסיפה לכל אחד. במקרה שסגול קריסטל עודף הוסיף לטוב, את מספר הצעדים לשטוף עשוי להיות מוגבר. ניסוי הצביעה סגולה קריסטל מספק השוואה היחסית של יעילות מניין-מרווה בשיבוש biofilm. למרות שהצביעה סגולה גביש היא כמותי למדידת היווצרות biofilm, זה רק חצי כמותית במונחים של היעילות הקטליטית של אנזימי מרווה-מניין. לשם השוואה סטטיסטית מדויקת, גודל מדגם מספיק חשוב לקבוצות טיפול השונות. גם חריגים יש להסיר כדי למנוע מצג שווא של תוצאות.
הדמיה וניתוח של biofilm חיידקי Confocal הוא usefכלי ul להערכת ההשפעות איכותיות של אנזימי מרווה-מניין. עם זאת, התהליך של בחירת biofilm לניתוח עשוי להיות ערוץ פוטנציאל להטיה אם המשתמש הוא מודע לסוג של אנזים מניין-מרווה מנוהל (פעיל או לא פעיל). כדי למנוע את האפשרות של הטיה, הניסוי יכול להיות שנועד להדיר מידע אנזים מהמשתמש או להשתמש בגישה אקראית לבחירה. אסטרטגית בחירה משוחדת גם מאפשרת השוואת כמותית טובה יותר של מורפולוגיות biofilm על ידי CLSM. עם זאת, זהו המחקר הראשון שמתאר שיטה להערכת התוצאה של אנזימי מרווה-מניין בbiofilms חיידקים. צביעה הסגולה Crystal הוכיחה את התועלת של אנזימי מרווה-מניין בשיבוש biofilm וגילתה כי operandorum מודי 'האנזימים אינם מוגבלים להפחתת מספרים סלולריים וביטוי גורם ארסיות. בינתיים, שינויים מורפולוגיים נקבעו על ידי ניתוח CLSM גם יכולים לספק תובנות molecul אפשרימטרות ar של אנזימים אלה. למרות שהניסוי הנוכחי נועד לחקור את ההשפעות של טיפול מקדים אנזימים על biofilms חיידקים, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להעריך את ההשפעה של האנזים בbiofilm preformed על ידי הוספת האנזים לאחר צמיחת חיידקים או לבחון מיומנותה בתנאים הפיסיולוגיים באמצעות סרום תנאים דמויים לתרבות. הפרוטוקול המשמש ללמוד אנזימי GKL ניתן להאריך לאנזימי מרווה-מניין אחרים ופתוגנים לחקור את יחסיהם בשיבוש biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
