Introduction
Варианты лечения инфекционных заболеваний осложняется быстрым ростом множественной лекарственной устойчивостью бактерий, которые устойчивы к широкому спектру антибиотиков 1. С высокой заболеваемости и смертности от устойчивых бактерий-опосредованные инфекции, существует необходимость эскалации процессов развития наркотиков и / или исследовать более антибактериальными альтернативы для улучшения терапевтических возможностей. В последнее время, подход анти-вирулентность набирает интерес, учитывая его потенциал в предотвращении вирулентность не через бактерицидные методы, следовательно, смягчению рисков механизмов сопротивления 2.
Кворум зондирования является «главный выключатель" в бактериальной вирулентности и нарушение этого явления сигнализации является перспективным методом борьбы с вирулентность против патогенезе 3. Наступление вирулентности требует накопления кворума молекул в внеклеточной среде после критического бактериального плотность населения достигается. Как-квоМолекулы ром диффундируют обратно в внутриклеточного матрикса, связывание с их родственными рецепторами приводит к активации факторов вирулентности, а также генов, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам и биопленки 4. В общем, нарушение кворума зондирования включает ингибирование кворума молекулу и взаимодействие рецептора, не затрагивая основных метаболических путей. Следовательно, он не имеет никакого прямого последствия на рост клеток. Так фитнес не будет нарушена, есть минимальное давление отбора для бактерий развиваться и сопротивление против таких методов лечения 5 получить. Кроме того, нарушение кворума зондирования может мешать присущих бактериальных защитных механизмов, как в случае образования биопленки, который обеспечивает защиту от антибактериальных агентов и иммунного ответа.
Считается, что 99% микробов на Земле существуют в сложных биопленки, как матриц, присвоении важные преимущества выживания для микроорганизмов, обитающих внутри йESE структуры 6. Что еще более важно, формирование этих сидячих доменов является причиной самых упорных и хронических внутрибольничных инфекций 7. Acinetobacter baumannii является одним из основных человеческих патогенов, что связано с глобальными внутрибольничных инфекций и его вирулентность в значительной степени объясняется кворума зондирования -опосредованной образование биопленки 8. Кворум-тушения ферменты были успешно использованы в срыве кворума опосредованной трансдукции сигнала от ориентации группу соединений, известных как N-ацил гомосериндегидрогеназу лактонов (AHLs), которые производятся грамотрицательных бактерий 9. Несколько исследований также расширены с использованием этих ферментов блокировать бактериальный патогенез путем уменьшения экспрессии фактором вирулентности и клеточных чисел в биопленок 10,11. К сожалению, остается отсутствие ощутимой демонстрацией эффективного использования кворума закалки ферментов против образования биопленки бактериальными патогенами.Re были попытки использовать ингибиторы кворума (AHL), аналоги вместо кворума закалки ферменты, чтобы сорвать А. baumannii образование биопленки 12. Хотя этот метод с использованием ингибиторов малых молекул является действительным подход, поддерживая его биодоступность в трансляционных использования может быть проблемой. Напротив, использование каталитических кворумных закалки ферментов может обойти проблему биодоступность, как ферменты более пригодными в сторону иммобилизации на поверхности биомедицинских устройств для терапевтического воздействия.
Здесь мы опишем оценку последствий инженерных кворума закалки lactonases из Geobacillus kaustophilus (ГКЛ) 13 об образовании бактериальной биопленки, используя кристалл фиолетовый окрашивание и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Это исследование является первым успешная демонстрация нарушения биопленки в клинически значимых А. baumannii S1 напряжение с помощью кворума закалки ферменты. Описанные методыв данном исследовании являются полезными для оценки эффективности других кворума закалки ферментов в последующих терапевтических усилий в области развития против патогенных грамотрицательных бактерий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Кристалл Фиолетовый Количественное образование биопленки в А. baumannii S1
- Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в лизогении бульона (LB) (триптон 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л) при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
- Отрегулируйте культуры А. baumannii S1 до желаемого OD 600 0,8. Использование 96-луночного планшета, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 10 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 100 мкл.
- Подготовка управления культуры, а также, это не содержит каких-либо фермент. Повторите аналогичные условия, с получением желаемого количества повторов.
- Накройте тарелку с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 3 часов, прежде чем осторожно извлечением носителя.
- Добавить еще 100 мкл свежей среды LB к колодцу и инкубируйте в течение 21 ч при 30 ° С. После второго периода инкубации, осторожно удалить все носители. Вымойте планктона бактерий ячейку с 200 мкл стерильной воды. Убедитесь, что существует только минимальное нарушение в клетках во время стирки.
- Добавить 100 мкл 1% раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Извлеките кристаллическим фиолетовым раствором путем промывания скважины с 200 мкл стерильной воды. Повторите мыть для более двух раз.
- Добавить 100 мкл 33% уксусной кислоты в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин с легким встряхиванием; это будет распустить краситель.
- Определения количества биопленки, образованную путем измерения оптической плотности кристаллического фиолетового при 600 нм. Количество кристаллического фиолетового пропорциональна количеству биопленки, образованной.
2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии А. baumannii S1 биопленки
- Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в LB при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
- Объявлениетолько культура А. baumannii S1 до желаемого OD 600 0,8. Использование 35 мм со стеклянным дном М блюдо, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 30 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 1 мл.
- Обложка М-Блюдо с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Выдержите М-блюдо на 30 ° С в течение 3 ч перед удалением мягко СМИ. Добавить 30 мкл очищенного фермента и ГКЛ свежей средой, доводя его до общего объема 1 мл. Инкубировать в течение еще 21 ч при 30 ° С.
- Повторите шаг 2,3 и инкубируют в М-Dish еще в течение 24 ч при 30 ° С. Затем снимите СМИ осторожно.
- Добавить 500 мкл 5 мкг / мл Алекс Fluo-488 конъюгированного агглютинина зародышей пшеницы (WGA), растворенного в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с мю-Петри и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин; это будет пятно сформированную биопленку. Удалить окрашивания раствор и промойте тон мю-Блюдо с 2 мл HBSS. Повторите стадии промывки еще раз.
- Добавить 500 мкл 3,7% формальдегида, растворенного в HBSS и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин; это будет исправить биопленки на х-блюдо. Вымойте М блюдо один раз 2 мл HBSS и затем снимите решение полностью. Μ-блюдо фиксируется с биопленки могут быть сохранены в темноте при 4 ° С до визуализации CLSM.
- Для CLSM изображений и анализа, использовать 63-кратное увеличение, чтобы генерировать 97 стеков за изображения с интервалом 0,21 мкм на стеке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В количественного эксперимента кристаллического фиолетового, две кворума закалки ферменты используются для демонстрации возможности в срыве биопленки: дикого типа ГКЛ и улучшенный GKL двойной мутант (E101G / R230C). Оба фермента были показаны, чтобы продемонстрировать lactonase активность против 3-гидрокси-деканоил-L-гомосерин лактон (3-ОН-С 10 -HSL), главным кворума молекула используется А. baumannii S1 14. Для действительного оценки нарушения биопленки, соответствующие каталитически неактивные ферменты (ранее показанные не изолировать AHL лиганды) также были включены в качестве непосредственных управления (ГКЛ D266N мутанта и ГКЛ E101G / R230C / D266N мутанта). Кроме того, с помощью дикого типа A. baumannii S1, биопленки формирования способности мутантного штамма Δ Абая (АХЛ-синтазы с дефицитом), также был протестирован. Оба кворума закалки ферменты, дикого типа ГКЛ ГКЛ и E101G / R230C мутанта смогли значительно снизить образование биопленки в предварительнолечение А. baumannii S1 культуры (п = 10; р-значение ≤ 0,0001) (Рисунок 1). Тем не менее, степень разрушающего биологические пленки для обоих ферментов не пропорционально их эффективности против 3-ОН-С 10 -HSL. Текучесть (к кот) из ГКЛ E101G / R230C мутанта в шесть раз быстрее, чем дикого типа ГКЛ против 3-ОН-С 10 -HSL 14. Тем не менее, разница в степени биопленки нарушения между ферментами только два раза.
Рисунок 1. А. формирование baumannii нарушение биопленки анализ. биопленки измеряли окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Красные столбцы представляют собой сумму биопленки, образованный дикого типа А. baumannii и Δ Абая мутант, без добавления кворума закалки lactonases. Синие столбцы представляют АМОUNT биопленки формируются дикого типа A. baumannii в присутствии четырех различных ферментов: ГКЛ ГКЛ неактивным D266N мутантных дикого типа ГКЛ, неактивный ГКЛ E101G / R230C / D266N мутантных и ГКЛ E101G / R230C мутанта. ****, Р- величина ≤ 0,0001. Воспроизводится с разрешения противомикробным препаратам и химиотерапии 58, 1802-1805 (2014). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Конфокальной визуализации А. формирование baumannii S1 биопленки использовался для обеспечения качественного и количественного меру кворума жажду воздействия на структурной морфологии этих сидячих доменов. Усовершенствованный GKL E101G / R230C мутанта и его каталитически неактивным ферментом были использованы для сравнения. Контраст изображения дифференциал (ДВС) изображения показали, что лечение с улучшенной ГКЛ E101G / R230C мутанта привело к снижению размера биопленки (фигуре 2). Анализ флуоресценции изображений также показало, что было снижение площади поверхности, биомассы и средней толщины биопленки при обработке улучшенной GKL E101G / R230C мутанта (Таблица 1).
Рисунок 2. Представитель конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изображения А. baumannii биопленки. А. baumannii биопленки лечили неактивной ГКЛ E101G / R230C / D266N мутанта (A) и ГКЛ E101G / R230C мутанта (Б) и окрашивали Alexa Fluor 488-конъюгировали WGA. DIC образы биопленок (слева) и флуоресцентные изображения биопленок (справа) показаны для представительного ху (в центре), уг (справа), и хг (внизу) секций. Воспроизводится с разрешения противомикробным препаратам и химиотерапии <сильный> 58, 1802-1805 (2014). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Значение ± SD а | |||
| Характеристика | Нет лечения | Лечение с неактивным мутантом | Лечение E101G / R230C мутанта |
| Биомасса (мкм 3 / мкм 2) | 2.57 ± 1.65 | 3.39 ± 1.33 | 1.37 ** ± 0,20 |
| Толщина Среднее (мкм) | 3.68 ± 2.51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** ± 0,21 |
| Площадь (мкм) | 235,920.59 79,456.46 ± | 209,872.6 115,094.7 ± | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| н = 10 изображения стеки. ** Р ≤ 0,001; * Р ≤ 0,05, по сравнению с лечением с неактивной E101G / R230C / D266N мутанта. | |||
Таблица 1. А. baumannii биопленки структурное количественного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В обоих наборов эксперимента А. baumannii S1 культивировали в LB среде без NaCl в высокой концентрации соли может уменьшить количество биопленки, образованную бактерий 15. Наличие такого артефакта может недооценивать количество биопленки, образованный, а также эффекты кворумных закалки ферментов через различные условий обработки. Использование фермента каталитически неактивным важно в качестве отрицательного контроля, чтобы устранить возможные эффекты связывания фермента. 1 показано, что, даже если неактивные ферменты секвестрацию кворумных молекулы, образование биопленки не нарушается.
А. baumannii S1 образует тонкий кольцеобразную структуру биопленки между воздухом и жидкой фаз в лунку 96-луночного планшета. Следовательно, очень важно, чтобы избежать чрезмерного волнения во время стадий удаления средств массовой информации и стиральных, чтобы предотвратить случайное удаление бактериальных биопленок. LB среду удаляли после каждой инкубации кустранить планктонных клеток. Кроме того, 96-луночный планшет помещали в 10 л пластиковый контейнер, чтобы минимизировать возмущения в поток воздуха и создания микро-анаэробной среде, которая способствует образование биопленки. Биопленки количественного в 96-луночный планшет также зависит от количества добавленного кристаллического фиолетового в каждую лунку. В том случае, избыток кристаллического фиолетового добавляют в скважину, число стадий промывки может быть увеличена. Эксперимент окрашивание фиолетовый кристалл обеспечивает относительную сравнение эффективности кворума тушения в нарушение биопленки. Хотя окрашивание кристаллический фиолетовый количественный для измерения образования биопленки, это только полуколичественный с точки зрения каталитической эффективности кворумных закалки ферментов. Для точного статистического сравнения, достаточные размеры выборки важны для различных групп лечения. Выбросы также должны быть удалены, чтобы предотвратить искажение результатов.
Конфокальной визуализации и анализа бактериальной биопленки является USEFул инструмент для оценки качественных последствий кворума закалки ферментов. Тем не менее, процесс выбора биопленки для анализа может быть потенциальным каналом уклоном, если пользователь знает о типе кворумного закалки фермента вводят (активный или неактивный). Чтобы избежать предвзятости, эксперимент может быть выполнен, чтобы исключить фермента информацию от пользователя или использовать случайный подход к выбору. Объективный стратегия выбора также позволяет лучше количественное сравнение биопленки морфологии по CLSM. Тем не менее, это первое исследование, которое описывает метод оценки результатов кворума закалки ферментов на бактериальных биопленок. Окрашивание фиолетовый кристалл продемонстрировал полезность кворумных закалки ферментов в разрушающего биологические пленки, и показали, что модифицированный operandorum ферментов "не ограничиваются уменьшения числа клеток и экспрессию фактора вирулентности. Между тем, морфологические изменения, определяемые с помощью анализа CLSM также может обеспечить способность проникновения в суть возможного moleculсоток цели этих ферментов. Хотя в настоящее время эксперимент был предназначен для изучения влияния ферментов предварительной обработки на бактериальных биопленок, протокол может быть изменен, чтобы оценить эффект фермента на сформованной биопленки добавлением фермента после бактериального роста или исследовать его компетенции в физиологических условиях за счет использования сыворотки -как условия для культуры. Протокол, используемый для изучения ГКЛ ферменты могут быть распространены на другие кворума закалки ферментов и патогенов, чтобы исследовать их отношения к нарушению биопленки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
