Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Maus antralen Oozyten basierend auf nucleolar Organisation.
Introduction
Antralen ausgewachsene Oocyten (GV, Keimbläschen) aus dem Antrum Fach der Ovarien isoliert werden routinemäßig für verschiedene Zwecke verwendet, wie zum Beispiel die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die in vitro-Reifung bis Metaphase II Stufe.
Trotz ihres schönen Aussehens meisten antralen Eizellen, aber nicht alle sind in der Lage, um die Meiose zu vervollständigen und erreichen das Blastozystenstadium; in der Tat, in vielen Säugetierspezies, einschließlich Menschen, 1,2, etwa 30% von ihnen verhaften ihre Entwicklung in der 2-Zell-Stadium, wenn die Befruchtung stattfindet 3-5. Bisher sind nur wenige Parameter verwendet werden, um zwischen den Oozyten der Lage, die Embryonalentwicklung von denen nicht in der Lage, dies zu tun aufrecht zu unterscheiden.
Zum Beispiel ist Cresyl-Blau-Färbung (BCB) einen gültigen Methode die Oozyten basierend auf der Aktivität der Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu sortieren, obwohl der Nutzen dieses Sortierverfahren den BCB + oder BCB- Färbung zusammenhängtnoch Labor abhängig 6-8.
Eine andere gut etablierte Methode liegt in ihrer Chromatinorganisation: Wenn bei allen DNA interkalierende Farbstoffe (wie Hoechst33342) gefärbt, 70% der antralen Oozyten zeigen eine farbstoff positive Ring um den Nukleolus und sind umgeben Nucleolus (SN) aufgerufen wird, während die restlichen 30% zeigen eine gefleckte positive Signale und werden als Nicht Umgeben Nucleolus (NSN) 3-5. Kürzlich haben wir gezeigt, dass das Fehlen von zytoplasmatischen Gittern 9 (CPLs, wichtige Lagerstätten für maternalen mRNA und Ribosom in beiden Säugetier Eizellen und Embryonen) 10 und der Herunterregulierung der MATER (wichtig für CPLs Bildung 11) zusammen mit der Anwesenheit von Lipidtröpfchen in ihrem Zytoplasma 9,12, können andere Ursachen auf den NSN Oozyten Unfähigkeit, die auf über die 2-Zell-Stadium fortfahren.
Leider können einige Techniken angewendet, um antralen SN und NSN Eizellen und sortiert werden,Aus diesem Grund könnte die Entwicklung einer weniger invasiven Verfahren (ohne Kernfärbung, der Fixierung oder Manipulation mit Mund-Pipetten) sehr wichtig geworden, um die Raten der menschlichen und tierischen Embryo-Entwicklung zu erhöhen.
In diesem Papier haben wir ausführlich die einfache und schnelle Protokoll für die Anzeige Art SN und NSN antralen Eizellen von weiblichen Mäusen zu isolieren, und es wird an alle Wissenschaftler interessieren sich für das Studium der weiblichen Gametogenese, Eizellreifung und Embryoentwicklung gerichtet.
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Protocol
Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Leitlinien der europäischen (EU 63/2010) und Italienisch (26/2014) Gesetze zum Schutz von Tieren für die wissenschaftliche Forschung verwendet werden, durchgeführt. Genickbruch der Euthanasie ist für Eierstöcke Isolierung verwendet und es wird von Experten durchgeführt und ausgebildeten Personen in der genehmigten Protokoll über diese Studie aufgeführt.
1. Tiere
- Pflegen Erwachsenen 3- bis 6 Wochen alte weibliche Mäuse in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit (mit Phasen der 12L: 12D und ad libitum gefüttert).
- Spritzen Sie Mäusen intraperitoneal mit 2,5 IU pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) bis Follikelwachstum durch Nachahmung der Wirkungen von follikelstimulierendem Hormon (FSH) zu stimulieren. Isolieren Sie die Eierstöcke für antralen Oozyten Sammlung von 48 Stunden später. Euthanize die weibliche Maus zuvor mit PMSG injiziert, nach Ihren Richtlinien des Instituts.
- Schnelles Entfernen der Eierstöcke aus der Körperhöhle und legen Sie sie in die Petrischale containing M2 Medium für spätere Oozyten Isolierung (siehe Abschnitt 3).
- Einen Einschnitt in der Haut, welche die Bauchwand, gefolgt von einem Einschnitt in der Bauchfells unter Verwendung sterilen Sektions Schere. Öffnen Sie die Schnittführung, um den Bauch freizulegen, bewegen Sie den Mut, auf der einen Seite mit einer sterilen Pinzette und lokalisieren die Eileiter und bilden eine V-Form, ausgehend von der Blase.
- Beachten Sie die Eierstöcke unterhalb der Nieren entfernt. Halten Sie jede Röhre mit steriler Pinzette und machen einen kleinen Schnitt an der Unterseite der Eierstöcke, um sie freizugeben. Übertragen beide Ovarien am Boden einer Petrischale mit voräquilibriert Medium.
2. Hormonpräparat
- Verdünnen Sie PMSG (in verschiedenen Aktien Konzentrationen) mit steriler isotonischer Kochsalzlösung, um eine Arbeitskonzentration von 2,5 IU Hormon pro 0,1 ml für eine geeignete Injektionsvolumen zu erhalten.
HINWEIS: Hormon-Lösungen müssen in 0,5 ml Röhrchen aliquotiert und gelagert bei -20 ° C bis zum Tag der Verwendung. Bewahren Sie keine verdünnten Aliquots länger als drei Monate bei -20 ° C. Einmal aufgetaut, wenn serielle Injektionen durchgeführt werden, speichern die Teilmengen von Hormon-Lösungen bei +4 ° C und verwenden Sie sie innerhalb von 4 Tagen.
3. Die Eizellen Antrum Isolation
Für die richtige Oozyten Trennung:
- Äquilibrieren M2 Medium 13 (M2) bei 5% CO 2 und 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor dem Beginn der Oozyten Isolierungsverfahren. Bereiten zwei Petrischalen (35 mm x 10 mm), eines mit 1 ml M2 für Ovar Punktierung und die zweite mit kleinen Tropfen (20 ul) von M2 mit Mineralöl (~ 1,5 ml) für Oozyten Übertragung nach Isolierung aus der überdachten Eierstock (siehe 3,4-3,6). Halten Sie beide Petrischalen im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C bis zur Verwendung bereit.
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop bei Oozyten Isolierungsverfahren.
- Bereiten dünnen Mundglaspipetten, um die Eizellen mit Strechfolie sammelnHing Glas Pasteurpipetten horizontal gehalten (Halten der Enden der Pipette mit beiden Händen), über eine vertikale Flamme aus dem Bunsenbrenner (Abbildung 1).
- Sobald das Glas zu schmelzen beginnt, nehmen Sie die Pipette aus der Flamme, und führen Sie einen schnellen Zugbewegung um das gewünschte Pipette zu erhalten. Fest schneiden das überschüssige Glas in der Nähe der Engstelle der Pipette mit den Fingernägeln, die Länge und der Durchmesser der inneren Kapillare einzustellen. Sicherzustellen, dass die dünne Kapillare einen Innendurchmesser von ~ 100 & mgr; m, der etwas größer als der Durchmesser der Eizelle (~ 80 & mgr; m).
- Zu-Mund-Pipette, schließen Sie ein Ende des Ansaugrohr auf die Pipette gezogen wird unter Verwendung einer geeigneten Spitze und das andere Ende in den Mund, befestigen Sie sie mit den Zähnen.
- Sammeln der Eierstöcke mit sterilen Pinzetten und legen sie an der Unterseite eines Zellkulturpetrischale (35 mm x 10 mm). Deckt sie mit 1 ml M2 zuvor bei 37 ° C äquilibriertund 5% CO 2 (Abbildung 2).
- Sanft durchstechen die Antralfollikeln der Eierstöcke mit einem sterilen Insulinspritze Nadel antralen Oozyten in M2 (Figur 3) zu lösen.
- Gently Mund pipettieren die Eizellen durch eine enge Pasteur-Pipette, um Follikelzellen und andere mögliche Gewebetrümmer (4A) zu entfernen und setzen sie an der Unterseite der kleinen Tropfen (20 ul) von M2 mit Mineralöl für Embryokultur überzogen (vorher dann hergestellt; 4B).
HINWEIS: Es ist wichtig, alle Cumuluszellen an die Zona pellucida der Eizellen durch kontinuierliches Pipettieren angebracht über mehrere und unterschiedliche Tropfen M2 entfernen. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich, um Veränderungen im pH des Mediums zu vermeiden.
4. Antral Oozyten Färbung mit Hoechst33342
HINWEIS: Antral Eizellen können in SN (Umgeben Nucleolus), NSN (Nicht Umgeben Nucleolus) oder unterschieden werdenin einer anderen Zwischenform auf der Grundlage ihrer Chromatinorganisation nach Färbung mit Supravital Konzentration Hoechst33342 (oder andere spezifische Marker für Basen AT) 14. In der Tat zeigen die SN Oozyten eine Hoechst-positive Ring um den Nukleolus, während der NSN nicht, daher der Name.
Für die richtige Oozyten-Färbung:
- Übertragen die Oozyten mit einer Mundpipette in Tropfen Hoechst33342 (20 ul) in M2 verdünnt im supravitalen Konzentration von 50 ng / & mgr; l für 10 Minuten im Dunkeln.
- Nach der Inkubation mit Hoechst33342 Transfer jeder einzelnen Oocyte mit einem Mundpipette an der Unterseite der kleinen Tropfen (5 ul) von M2 mit Mineralöl bedeckt, zum Sortieren basierend auf Chromatinorganisation (SN oder NSN). Verwenden Sie eine beliebige Fluoreszenzmikroskop mit Hoechst33342 Filter (Emissionswellenlänge 486 nm) ausgestattet, um die Chromatin-Konfiguration der Eizellen zu visualisieren.
HINWEIS: In Abhängigkeit von der Art des Fluoreszenzmikroskopes, it kann sich zwingend notwendig, um Glasboden Petrischale für die Bildaufnahme verwenden. Die konfokale Mikroskopie Olympus FluoView Fv10i, wenn mit einem Probenhalter für 35 mm-Schale ausgestattet benötigt nur Glasboden-Gerichte für die Bilderfassung, mit einer 0,17 mm Standard-Dicke und einem Bereich von 0,13 bis 0,21 mm akzeptabel. - Erregt die Oozyten auf nicht mehr als 5-10 sec, wahrscheinlich genügend Zeit, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit von einem Ring um den Nukleolus (Abbildung 5) zu visualisieren.
- Nach dem Sortieren, der Kultur der antralen SN und NSN Oozyten in M2 bei 5% CO 2 und 37 ° C, um in vitro-Reifung induzieren oder halten sie in geeigneten Puffern für die molekulare oder zelluläre Analysen.
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Representative Results
Die folgenden Bilder zeigen die verwendet werden, um antralen Eizellen aus den Eierstöcken der Maus zu isolieren, ausgehend von Pipetten Zubereitung der Oozyten "Sortierung mittels Hoechst33342 Methode. Diese Methode ist sehr einfach und kann in jedem Labor mit einem CO 2 -Inkubator, einem Stereomikroskop und einem Fluoreszenzmikroskop mit dem korrekten Filter für die Beobachtung des Hoechst33342 ausgestattet erfolgen Abbildung 1 zeigt den Anfangsschritt des Pipetten Zubereitung:., Wenn die Glas beginnt zu schmelzen und werden weich, müssen beide Enden der Pipette auseinandergezogen werden, und gleichzeitig muss die Pipette aus der Flamme genommen werden. Alternativ kann Glaskapillare auf die gleiche Weise oder mit Hilfe einer Mikropipette Abziehvorrichtung herausgezogen werden, wenn sie richtig geeicht. Dies ist ein entscheidender Schritt, da es sehr wichtig, die richtige Mundpipette mit der rechten Kapillardurchmesser haben: Wenn es zu dünn ist, kann Oozyten in der kleinen Kappe fragmentiertIllary und sterben innerhalb weniger Minuten, wenn sie zu groß ist, eine angemessene Ansaugung des Mediums, die die Eizellen beim Bewegen der Oozyten, beispielsweise verloren werden soll, von einem Tropfen zum anderen. Die 2 und 3 zeigen die mechanische Isolierung des antralen Oozyten von Antralfollikeln mit einer sterilen Insulin Nadel. Es ist ganz einfach, diese Follikel zu erkennen, da sie durch einen Hohlraum oder Antrum ein Fluid enthält, dadurch gekennzeichnet ist, dass das Medium, in dem die Granulosazellen und Eizelle gefunden werden und durch welche verschiedene Verbindungen zu und von der äußeren Umgebung ausgetauscht werden. Nachdem sie isoliert wurde, antralen Oozyten muss von einem Tropfen zum anderen von M2-Medium überführt werden, um somatische Zellen umgebenden Oozyten zu entfernen, wie in den 4A und B gezeigt ist. Nachdem "denudierte" sind antralen Oozyten bereit Klassifikation. 5 zeigt den letzten Schritt dieses Protokolls besteht darin, dass die Färbung der isolierten Antrum-Oozyten Hoechst33342 foder eine schnelle Sortierung der Grundlage ihrer Chromatinorganisation. Dieser Marker Flecken lebenden Zellen viel rascher als DAPI zum Beispiel und müssen supravitalen Konzentration (50 ng / & mgr; l) verwendet, um die Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Zellfärbung für Chromatinorganisation ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt dieses Protokolls, wenn die Eizellen angeregt werden zu lange sie beschädigt und unbrauchbar werden für zukünftige Essays werden kann. Insgesamt, wenn die Maus Oozyten angewendet wird, ist dies eine einfache Methode, die nicht besondere Vorkehrungen (mit Ausnahme derjenigen im Methodenteil angegeben) erfordern. Alle Schritte können bei RT durchgeführt werden.
Abbildung 1. Herstellung eines Mundpipette unter Verwendung von Glas Pasteur Pipetten und einem Bunsenbrenner. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thiWert.
Abbildung 2. Intact Eierstöcke in Petrischale mit vorgewärmten und ins Gleichgewicht gebracht M2 Medium gefüllt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Anfängliche Isolierung von antralen Oozyten von Antralfollikeln mittels einer sterilen Nadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Übertragung der frisch isolierten Oozytenmit einem Mund Pipette aus der Petrischale (A) in eine andere Petrischale mit kleinen Tropfen des vorgewärmten und ins Gleichgewicht gebracht M2medium (B) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Die Eizellen gebeizt und sortiert mit Hoechst33342. Einzelbilder von NSN und SN Oozyten am konfokalen Mikroskop Olympus FluoView Fv10i genommen (Vergrößerung 60X; bar: 10 & mgr; m; PhC: Phasenkontrast). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die verwendet werden, um zu isolieren und zu klassifizieren Maus antralen GV-Oozyten-Methode. Es gibt keine besonderen kritischen Schritte, um zu unterstreichen, mit wenigen Ausnahmen. Erstens: a) Erhaltung der Vitalität der Oozyten und b) zu vermeiden, den pH-Wert des verwendeten Mediums: Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Zweitens: Eizellen sollten kurz angeregt werden (5-10 sec), um Hoechst33342 Chromatin Schäden und der anschließenden Tod der Eizellen zu vermeiden, besonders wenn IVM und IVF sind die folgenden Schritte. Bis heute ist dies der schnellste Weg, SN und NSN Maus antralen Eizellen zu sortieren.
Hochest33342 ist erwiesen, um eine effiziente Möglichkeit, SN und NSN Oozyten bei weiblichen Mäusen (und andere Säugetierlabormodellen) zu charakterisieren, aber es kann nicht sein, leider zur antralen Oozyten beim Menschen für die Fruchtbarkeit Zwecke zu sortieren.
Da in-vitro-Reifung unreifer Oocyten wird routinemäßig auch beim Menschen verwendet wird, WO esULD ist äußerst wichtig, um eine nicht-invasive Möglichkeit, die "gute" Eizellen (dh SN) von den "schlechten" zu unterscheiden zu finden (dh NSN) um den Erfolg der in-vitro-Fertilisation und anschließende prospektive Embryonen Entwicklung zu erhöhen. Außerdem könnte die Isolierung und Kultivierung von SN Eizellen aus Eierstockgewebe für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei Frauen mit Krebsbehandlungen oder Leiden mit Eierstockerkrankungen verwendet werden.
Durch Ausnutzung dieses Naturphänomen, könnten wichtige Daten zum Verständnis der Natur vorkommenden Embryo preimplantation Verluste, die nicht nur für die Interessenten in der biologischen Grundlagen der Eizelle Entwicklung, sondern auch für die menschliche und tierische IVF Ärzte spricht Verfügung gestellt werden.
Die Implikationen dieser Technik für die menschliche Gesundheit sind Biopolitik von Embryonen und Tierreproduktion signifikante 15. In der Lage zu erkennen und zu beseitigen "lebens unvereinbar" Eizellen würdendie effektive Höhe der IVF-Techniken erheblich zu erhöhen, was zu innovativen Lösungen für wichtige ungedeckten klinischen Bedarf.
In der Tat könnte die internationale wissenschaftliche Gemeinschaft von Gameten Biologen dazu beitragen, die kritische Verbesserungen notwendig, um dieses Protokoll zu menschlichen IVF-Verfahren anwenden zu suchen. Auch wenn das Protokoll nicht auf den Menschen übertragen werden (klar, aus Sicherheitsgründen), noch ist es eine enorme Fähigkeit, das Wissen über die Verbindung zwischen Chromatinorganisation (dh Genom Architektur) und der Genexpression zu verbessern während der Endphase der antralen Reifung hält , eines der heißen Themen in der menschlichen Fortpflanzung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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