Summary
ここでは、核小体の組織に基づいて、マウス胞状卵母細胞の特徴付けのためのプロトコルを提示します。
Introduction
卵巣の胞状コンパートメントから分離された胞状十分に成長した卵母細胞（GV、卵核胞）は日常、などなど、さまざまな目的に使用されている例えば、中期II段階まで体外成熟の背後に分子・細胞メカニズムの研究。
その美しい外観で最も胞状卵母細胞にもかかわらず、すべてではないが、減数分裂を完了し、胚盤胞段階に到達することができます。受精が3-5が発生した場合 、実際には、人間1,2を含む多くの哺乳動物種において、それらのおよそ30％が、2細胞期で、その開発を逮捕します。今日までに、いくつかのパラメータは、そうすることができないものから胚発生を維持することができる卵母細胞を区別するために使用されます。
例えば、クレシルブルー染色（BCB）はBCB +またはBCB-染色に関連し、このソート方法の有用性はあるが、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの活性に基づいて、卵母細胞を分類するための有効な方法であり、まだ研究室に依存6-8。
もう一つのよく確立された方法は、彼らのクロマチン組織に存在する：（Hoechst33342のような）任意のDNAインターカレー色素で染色した場合、胞状卵母細胞の70％が核小体の周りの色素陽性リングを示し、小体（SN）囲ま呼ばれ、残りの30％ながら、より多くの斑点陽性シグナルを示し、仁（NSN）3-5囲まれていないと呼ばれています。最近では、ことを示した細胞質格子9（のCPL、哺乳動物の卵母細胞および胚の両方で母体由来のmRNAとリボソームのための重要な貯蔵部位）の不在10との存在と一緒（のCPL形成の11のために必須）MATERのダウンレギュレーション、その細胞質9,12における脂肪滴は、2細胞期を超えて進行するNSNの卵母細胞の無力に関連する他の原因であることができます。
残念ながら、いくつかのテクニックが胞状SNとNSN卵母細胞とをソートするために適用することができ、このため、（核染色、固定手順や口のピペットとの操作なし）少ない侵襲的方法の開発は、ヒトおよび動物の両方の胚発生の速度を向上させることが非常に重要になる可能性があります。
本稿では、詳細簡単かつ迅速プロトコルは、広告ソートSNと雌マウスからNSN胞状卵母細胞を単離するために使用し、それは女性の配偶子形成、卵成熟と胚発生の研究に興味を持つすべての科学者にアドレス指定されています。
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Protocol
このプロトコルは、欧州（EU 2010分の63）、科学研究のために使用される動物の保護イタリア（2014分の26）法律の指針に従って実施されます。頸椎脱臼を安楽死は、卵巣の単離のために使用され、それは、この研究をカバーする承認されたプロトコルに記載されている個体を専門家によって行われ、訓練されます。
1.動物
- 制御された温度および湿度の部屋で6週齢の雌マウスに大人3を維持（12Lの位相と：12Dおよび摂食自由摂取 ）。
- 卵胞刺激ホルモン（FSH）の効果を模倣することにより卵胞の成長を刺激するために妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）の2.5 IUを腹腔内にマウスを注入。後で洞卵母細胞の収集48時間のための卵巣を分離します。あなたの機関のガイドラインによると、以前にPMSGを注射したマウスを安楽死させる女性。
- すぐに体腔から卵巣を除去し、ペトリ皿の続きにそれらを置きますその後の卵母細胞の単離のためのM2培地をaining（セクション3を参照）。
- 無菌解剖ハサミを使用して、腹膜の切開に続いて腹壁をカバーする皮膚の切開を行います。膀胱から始まるV字形状を形成する、腹部を露出するように切開を開き、滅菌ピンセットを用いて、一方の側に勇気を移動させ、子宮管をローカライズ。
- 腎臓の下方に位置する卵巣を観察します。滅菌ピンセットで各チューブを持ち、それらを解放するために卵巣の下部に小さな切開を行います。予め平衡化培地を含むペトリ皿の底に両方の卵巣を転送します。
2.ホルモンの準備
- 適切な注入量0.1 1mlあたり2.5 IUホルモンの作用濃度を得るために、滅菌等張食塩水PMSG（異なるストック濃度で利用可能）を希釈します。
注：ホルモンソリューションを0.5 mlチューブに分注し、で保存する必要があります-2使用日まで0℃。 -20℃で3ヶ月よりも長い希釈アリコートを保管しないでください。解凍したら、シリアル注射が行われた場合、4℃のホルモンソリューションのアリコートを保存し、4日以内にそれらを使用しています。
3.洞卵母細胞の分離
適切な卵母細胞の単離のために：
- 卵母細胞の単離手順を開始する前に少なくとも1時間、5％CO 2、37℃でM2培地13（M2）を平衡化。 2ペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）で、卵巣穿刺からの単離後の卵母細胞の転送のためにミネラルオイル（〜1.5ミリリットル）で覆われたM2の小滴を有する第二1（20μL）のためのM2の1ミリリットルのものを準備します卵巣（3.4から3.6を参照）。準備が使用されるようになるまで、5％CO 2、37℃のインキュベーター内で両方のペトリ皿にしてください。
- 卵母細胞の単離手順中に実体顕微鏡を使用してください。
- ストレッチにより卵母細胞を収集するために、薄い口のガラスピペットを準備興ガラスパスツールピペットは、ブンゼンバーナーからの垂直燃焼（ 図1）を介して、（両手でピペットの先端を保持する）水平に保ちました。
- ガラスが溶融し始めると、炎の外にピペットを取り、目的のピペットを得るために迅速に引き運動を行います。しっかりと長さと内部の毛細血管の直径を調整するための爪とピペットの狭い点に近い過剰ガラスをカット。細い毛細血管が卵母細胞の直径よりも僅かに大きい〜100μmの内径を有することを確認します（〜80ミクロン）。
- 口のピペットには、適切なチップを使用して引っ張っピペットに吸引管の一端を接続し、歯とそれを確保、口の中にもう一方の端を置きます。
- 滅菌ピンセットを用いて卵巣を採取し、細胞培養用シャーレ（35ミリメートル×10ミリメートル）の底部にそれらを堆積させます。以前は、37℃で平衡化したM2の1mlでそれらをカバー、5％CO 2（ 図2）。
- ゆっくりM2（ 図3）で胞状卵母細胞を解放するために、滅菌インスリン注射針と卵巣の胞状卵胞を穿刺。
- そっと口は包細胞および他の可能性のある組織片（ 図4A）を削除し、以前に（胚培養に適したミネラルオイルで覆われたM2の小滴（20μL）の下でそれらを解決するための狭いパスツールピペットを通して卵母細胞をピペット準備; 図4B）。
注：これは、M2のいくつかの異なる滴を通して連続ピペットで卵母細胞の透明帯に接続されているすべての卵丘細胞を除去することが重要です。培地のpHの変化を避けるために、可能な限り迅速にこの手順を実行します。
Hoechst33342 4.胞状卵母細胞の染色
注：洞卵母細胞は、SN（囲ま小体）、NSN（小体を囲まれていない）、またはに区別することができます他の中間形式で、Hoechst33342の超生体濃度（又は塩基の具体的な任意の他のマーカーAT）14で染色した後、それらのクロマチン組織に基づきます。 NSNがいない間、実際には、SN卵母細胞は、したがって、その名前、核小体の周りヘキスト陽性リングを示しています。
適切な卵母細胞染色のために：
- 暗所で10分間、50 ngの/μLの濃度で超生体M2に希釈したHoechst33342（20μL）の液滴に口のピペットを用いて卵母細胞を転送します。
- Hoechst33342とのインキュベーションの後、クロマチン組織（SNまたはNSN）に基づいてソートするため、鉱物油で覆われたM2の小滴（5μL）の底に口のピペットを用いて各単一卵母細胞を転送します。卵母細胞のクロマチン構造を可視化するためにHoechst33342フィルタ（発光波長486ナノメートル）を装備した任意の蛍光顕微鏡を使用してください。
注：使用する蛍光顕微鏡の種類に応じて、私はtは、画像取得用のガラス底ペトリ皿を使用することが不可欠となることができます。 35mm皿のための試料ホルダーを装備した共焦点顕微鏡オリンパスFLUOVIEW Fv10iは0.17ミリメートルの標準的な厚さ0.13から0.21ミリメートル許容可能な範囲で、画像取得のための唯一のガラスボトムディッシュが必要です。 - そう、もはやよりも5〜10秒のために存在または核小体の周りにリングが存在しない場合（ 図5）を視覚化するのに十分な時間を卵母細胞エキサイト。
- 体外成熟を 誘導するか、または分子または細胞の解析のための適切な緩衝液中でそれらを保つために、5％CO 2、37℃でM2で、文化胞状SNとNSNの卵母細胞をソートした後。
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Representative Results
以下の写真は、Hoechst33342を用いて卵母細胞「ソートにピペットの準備から始めて、マウスの卵巣から胞状卵母細胞を単離するために使用する方法を示しています。この方法は非常に簡単で、CO 2インキュベーター、実体顕微鏡およびHoechst33342の観察のために正しいフィルターを備えた蛍光顕微鏡を備えた任意の実験室で行うことができます。図1は、ピペットの準備の最初のステップを示しています。ガラスのような溶融し、柔らかくなり始める、ピペットの両端を同時に、ピペットは炎から取り出されなければならない、引き離すとする必要があります。適切に較正場合代わりに、ガラスキャピラリーは、同じ方法またはマイクロピペットプラーを使用して引っ張ることができます。それが薄すぎると、卵母細胞は、小さなキャップの内側に断片化することができる：それは右の毛細管径の右口のピペットを持っていることは非常に重要であるため、これは重要なステップでありますそれはあまりにも大きい場合、卵母細胞を移動させるときillary、数分後に死亡し、卵母細胞を含む培地の適切な吸引が別のドロップから、例えば、失われる可能性があります。 図2と図 3は、洞卵母細胞の機械的な分離を示しました滅菌インスリン針を使用して胞状卵胞から。それは、それらが流体を収容する空洞または空洞を特徴とするので、これらの小胞を認識することは非常に簡単であり、それは、顆粒膜細胞および卵母細胞が発見され、それを通して異なる分子に、外部環境から交換することができる媒体です。分離された後は、図4AおよびBに示すように、洞卵母細胞は、卵母細胞を取り囲む体細胞を除去するために、M2培地の別のドロップから転送する必要があります。「裸出」したら、胞状卵母細胞は、分類のための準備ができている。 図5の最後の工程を示していますこのプロトコルの、それはHoechst33342 Fと孤立洞卵母細胞の染色がありますまたはそのクロマチン組織に基づいて、クイックソート。例えば、はるかに迅速にDAPIより生細胞、細胞生存率を維持するために超生体濃度（50 ngの/μL）で使用する必要があり、これは、マーカー染色。クロマチン組織の細胞染色は、おそらくこのプロトコルの最も重要なステップです：卵母細胞が長すぎる、彼らが損傷し、将来のエッセイのために使用できなくなることができます興奮している場合。マウス卵母細胞に適用して全体的に、これは（方法の項に示されたものを除く）は、特定の予防措置を必要としない簡単な方法です。全ての工程を室温で行うことができます。
ガラスパスツールピペットとブンゼンバーナーを使用して、口のピペットの 図1.準備 。THIの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいフィギュア。
図予め温め平衡化M2培地で満たされたペトリ皿で2無傷の卵巣。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
無菌注射針による胞状卵胞から胞状卵母細胞の図3.最初の単離。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
新たに単離した卵母細胞の図4.転送M2medium（B）予め温めの小滴を含む別のペトリ皿にシャーレ（A）から、口のピペットを用いて平衡化この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.卵母細胞を染色し、Hoechst33342でソート 。共焦点顕微鏡オリンパスFLUOVIEW Fv10iで撮影されたNSNおよびSN卵母細胞のシングル画像（倍率60X;バー：10ミクロン; PhCを：位相コントラスト）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、マウス洞のGV卵母細胞を分離し、分類するために使用される方法について説明します。いくつかの例外を除いて、下線する特段の重要なステップはありません。 A）卵母細胞の活力を維持し、b）に用いられる培地中のpH変化を避ける：まず：にこの手順は、可能な限り迅速に実行する必要があります。第二：卵母細胞は、IVMおよびIVFは、次の手順がある場合は特に、クロマチン損傷および卵母細胞のその後の死を回避するために、Hoechst33342に（5-10秒）簡単に励起されるべきです。現在までのところ、これはSNとNSNマウス胞状卵母細胞をソートする最も簡単な方法です。
Hochest33342が雌マウスにSNとNSN卵母細胞を特徴付けるための効率的な方法（および他の哺乳動物の実験室モデル）であることが証明されているが、それはすることはできません、残念ながら、不妊治療のためにヒトでの胞状卵母細胞をソートするために使用されます。
未成熟卵母細胞のインビトロ成熟を 日常的に過度にヒトに使用されるので、それはめざし体外受精とその後の将来の胚の開発の成功を高めるために「悪い」のもの（ すなわち 、NSN）から「良い」卵母細胞（ すなわち 、SN）を区別するための非侵襲的な方法を見つけることが非常に重要であるULD。また、卵巣組織からSN卵母細胞の単離および培養は、癌治療を受けている、または卵巣の病状に苦しんで女性の生殖能力の保存に使用することができます。
この自然現象を利用して、重要なデータが自然に卵母細胞の開発の基礎生物学に興味のある方にも人間と動物の体外受精の臨床医のみならず話す胚の着床前損失を発生を理解するために提供することができます。
人間の健康のためのこの技術の影響は、胚および動物の生殖のbiopoliticsは15重要です。 「生活不和合性」卵母細胞を識別し、排除することが可能になるという非常に重要な満たされていない臨床ニーズに最先端のソリューションに至る、IVF技術の効果的なレベルを上げます。
実際には、配偶子の生物学者の国際科学界は、人間のIVF手順にこのプロトコルを適用するために必要な重要な改善を求めるに貢献できました。プロトコルは（明確な安全上の理由のために）ヒトに適用することができないにもかかわらず、それはまだ洞成熟の最終段階クロマチン組織との間のリンク（ すなわち 、ゲノムアーキテクチャ）および遺伝子発現の知識を向上させるために多大な能力を保持、ヒトの生殖におけるホットな話題の一つ。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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