Summary
Her presenterer vi en protokoll for karakterisering av muse antrum ubefruktede egg basert på nukleolært organisasjon.
Introduction
Antrum fullvoksne oocytter (GV, germinal vesikkel) isolert fra antral rommet i eggstokken blir rutinemessig brukt til ulike formål, slik som for eksempel studier av de molekylære og cellulære mekanismene bak in vitro-modning til meta II stadium.
Til tross for sine vakre utseende mest antrum ubefruktede egg, men ikke alle, er i stand til å fullføre meiose og nå blastocyststadiet; faktisk, i mange pattedyrarter, inkludert mennesker 1,2, omtrent 30% av dem gripe deres utvikling ved to-trinns-celle, hvis befruktning skjer 3-5. Til dags dato er det få parametre som brukes til å skille mellom oocytter i stand til å opprettholde den embryoutvikling fra de som ikke klarer å gjøre det.
For eksempel, er kresyl blått-farging (BCB) en gyldig fremgangsmåte for å sortere oocytter basert på aktiviteten til glukose-6-fosfat-dehydrogenase, selv om nytten av denne sorteringsmåte er relatert til BCB + eller BCB- farging erfortsatt laboratorium avhengige 6-8.
En annen veletablert metode ligger i deres kromatin organisasjon: hvis farget med eventuelle DNA-interkaleringsforbindelser fargestoffer (som Hoechst33342), 70% av antrum ubefruktede egg viser en dye-positive ring rundt nukleolus og kalles Omgitt nukleolus (SN), mens de resterende 30% viser en mer flekket positive signaler og kalles Ikke Omgitt nukleolus (NSN) 3-5. Nylig viste vi at fraværet av cytoplasmatiske innhegninger 9 (cpls, viktige lagringsplasser for maternelle mRNA og ribosomer både pattedyr egg og embryoer) 10 og nedregulering av MATER (avgjørende for cpls formasjon 11), sammen med tilstedeværelse av lipid dråper i sine cytoplasms 9,12, kan være andre årsaker knyttet til NSN oocytter manglende evne til å fortsette utover to-celle stadiet.
Dessverre kan noen teknikker brukes til å sortere antral SN og NSN oocytter og,på grunn av dette, kan utviklingen av en mindre invasiv metode (uten nukleær farging, fikseringsprosedyrer eller manipulering med appetitt pipetter) blitt svært viktig for å øke forekomsten av både mennesker og dyr embryo utvikling.
I denne artikkelen, vi detalj enkel og rask protokoll som brukes til å isolere annonsen slags SN og NSN antrum eggceller fra hunnmus, og det er adressert til alle forskere som er interessert i studiet av kvinnelige gametogenesis, oocytmodningen og embryo utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er gjennomført i samsvar med de veiledende prinsippene for europeisk (EU 63/2010) og Italiensk (26/2014) lover som beskytter dyr som brukes til vitenskapelig forskning. Halsdislokasjon dødshjelp brukes til eggstokkene isolasjon og den utføres av ekspert og trente personer som er oppført i den godkjente protokollen dekker denne studien.
1. Dyr
- Oppretthold voksen 3- til 6-uker gamle hunnmus i et rom med kontrollert temperatur og fuktighet (med faser av 12L: 12D og matet ad libitum).
- Injisere mus intraperitonealt med 2,5 IE gravid mare serum gonadotropin (PMSG) for å stimulere follikkelutvikling ved å etterligne effekten av follikkelstimulerende hormon (FSH). Isoler eggstokkene for antrum oocytter samling 48hrs senere. Avlive den kvinnelige mus sprøytet PMSG, i henhold til institusjonelle retningslinjer.
- Raskt fjerne eggstokkene fra kroppens hulrom og plassere dem i petriskål fortsinnelukker M2 medium for senere oocytes isolasjon (se punkt 3).
- Lag et snitt i huden som dekker bukveggen fulgt av et snitt i bukhinnen ved hjelp sterile disseksjon saks. Åpne innsnitt for å eksponere magen, tarmene bevege seg på den ene side ved hjelp av sterile pinsetter og lokalisere eggledere, danner en V-form fra blæren.
- Observere eggstokkene ligger under nyrene. Holde hvert rør med steril pinsett og lage et lite snitt på bunnen av eggstokkene for å frigjøre dem. Overfør begge eggstokkene på bunnen av en petriskål som inneholdt pre-ekvilibrert medium.
2. hormonpreparat
- Fortynn PMSG (tilgjengelig i forskjellige lager konsentrasjoner) med steril isotonisk saltoppløsning for å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 2,5 IU hormon per 0,1 ml i en passende injeksjonsvolum.
MERK: Hormon løsninger må alikvoteres i 0,5 ml rør og lagres ved -20 ° C inntil bruksdagen. Ikke holde utvannet porsjoner lengre enn tre måneder ved -20 ° C. Tint, hvis serie injeksjoner utføres, lagre porsjoner av hormon løsninger ved 4 ° C og bruke dem innen 4 dager.
3. Antral Oocytter Isolation
For riktig oocytter isolasjon:
- Ekvilibrer M2 medium 13 (M2) ved 5% CO2 og 37 ° C i minst en time før den oocytter isoleringsprosedyren. Tilberede to petriskåler (35 mm x 10 mm), en med 1 ml M2 for eggstokk punkterings og den andre med små dråper (20 ul) av M2 dekket med mineralolje (~ 1,5 ml) i oocytter overføring etter isolering fra eggstokk (se 03.04 til 03.06). Hold begge petriskåler i inkubator ved 5% CO2 og 37 ° C inntil de er klare til bruk.
- Bruk en stereo under oocytter isoleringsprosedyrer.
- Forbered tynne munn glass pipetter for å samle oocytter etter med strekkeXing glass Pasteur pipetter holdes horisontalt (som holder endene av pipetten med begge hender), over en vertikal flamme som kommer fra gassbrenner (figur 1).
- Når glasset begynner å smelte, ta pipette ut av flammen og utføre en rask trekkbevegelsen for å oppnå den ønskede pipette. Fast kutte det overskytende glass nær den smale punkt av pipetten med negler for å justere lengden og diameteren av det indre kapillær. Sørge for at den tynne kapillær har en innvendig diameter på ~ 100 um, litt større enn en oocytt diameter (~ 80 nm).
- Til munn pipette, koble den ene enden av aspirator røret til trekkes pipetten ved å bruke en passende tips og plasser den andre enden i munnen, sikre den med tennene.
- Samle eggstokkene ved hjelp av sterile pinsetter og avsetter dem på bunnen av et cellekulturpetriskål (35 mm x 10 mm). Dekke dem med 1 ml av M2 på forhånd er ekvilibrert ved 37 ° Cog 5% CO 2 (figur 2).
- Forsiktig punktere antrum follikler i ovariene med en steril nål insulinsprøyte for å frigjøre antrum oocytter i M2 (figur 3).
- Forsiktig munn pipettér oocyttene gjennom en snever Pasteur-pipette for å fjerne hårsekkceller og eventuell annen mulig vevsrester (figur 4A), og deretter slå dem på bunnen av små dråper (20 ul) av M2 dekket med mineralolje egnet for embryokultur (tidligere fremstilt, figur 4B).
MERK: Det er viktig å fjerne alle cumulus celler festet til zona pellucida av ubefruktede egg ved kontinuerlig pipettering gjennom flere og ulike dråper M2. Dette utføres så raskt som mulig for å unngå forandringer i pH i mediet.
4. Antral Oocytter Farging med Hoechst33342
MERK: Antral ubefruktede egg kan skilles i SN (omgitt kjerne), NSN (Ikke Omgitt nukleolus) elleri en hvilken som helst annen mellomliggende form, basert på deres kromatin organisasjon etter farging med supravital konsentrasjon av Hoechst33342 (eller andre markører spesifikke for basiser AT) 14. Faktisk SN ubefruktede egg viser en Hoechst-positive ring rundt nucleolus mens NSN ikke gjør det, derav navnet.
For riktig ubefruktede egg farging:
- Overfør oocytter ved hjelp av et munn pipette inn i dråper av Hoechst33342 (20 ul) fortynnet i M2 ved supravital konsentrasjon på 50 ng / mL i 10 min i mørket.
- Etter inkubasjon med Hoechst33342, overføre hver enkelt oocytten med en munn pipette på bunnen av små dråper (5 pl) av M2 dekket med mineralolje, for sortering basert på kromatin organisasjon (SN eller NSN). Bruk noen fluorescens mikroskop utstyrt med Hoechst33342 filter (emisjonsbølgelengde 486 nm) for å visualisere kromatin konfigurasjonen av oocyttene.
MERK: Avhengig av hvilken type fluorescensmikroskop brukt, jegt kan bli viktig å bruke glassbunn petriskål for image oppkjøpet. Den konfokalmikroskopi Olympus Fluoview Fv10i da utstyrt med en prøveholder for 35 mm tallerken krever bare glassbunn-retter til bilde oppkjøpet, med en 0,17 mm standard tykkelse og et område fra 0,13 til 0,21 mm akseptable. - Eksitere oocytter ikke lenger enn 5-10 sekunder, sannsynligvis nok tid til å visualisere nærværet eller fraværet av en ring rundt den kjerne (figur 5).
- Etter sortering, kultur antral SN og NSN oocytter i M2 ved 5% CO2 og 37 ° C for å indusere in vitro modning eller holde dem i passende buffere for molekylære og cellulære analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende bilder viser hvilken metode som brukes for å isolere antrum eggceller fra mus eggstokkene, fra pipetter forberedelse til de ubefruktede egg 'sortering ved hjelp av Hoechst33342. Denne fremgangsmåte er ganske enkel og kan utføres i en hvilken som helst laboratorium utstyrt med en CO 2 inkubator, et stereomikroskop og et fluorescens mikroskop utstyrt med riktig filter for observasjon av Hoechst33342 Figur 1 viser det innledende trinn av pipette preparat:. Som glasset begynner å smelte og bli myke, må begge ender av pipetten dras fra hverandre, og, på samme tid, må pipette tas ut av flammen. Alternativt kan glasskapillar trekkes på samme måte eller ved hjelp av en mikropipette avtrekker, hvis riktig kalibrert. Dette er et viktig skritt, fordi det er svært viktig å ha rett munn pipette med rett kapillær diameter: hvis den er for tynn, kan eggceller bli fragmentert inne i small capIllary og dø i løpet av få minutter, hvis den er for stor, et passende sug i mediet inneholdende de oocyttene kan gå tapt ved flytting oocyttene, for eksempel fra én dråpe til en annen. Figurene 2 og 3 viser den mekaniske isolering av antrum oocytter fra antrum folliklene ved hjelp av en steril insulin nål. Det er ganske lett å gjenkjenne disse folliklene, fordi de er karakterisert ved et hulrom eller antrum som inneholder en væske, er at mediet i hvilket granulosa celler og oocytt er funnet og gjennom hvilke forskjellige molekyler kan utveksles til og fra det ytre miljø. Når isolerte, antrum oocytter må overføres fra én dråpe til en annen av M2 medium for å fjerne somatiske celler som omgir oocyttene, som vist i figurene 4a og b. Når "ribbet", antrum oocytter er klar for klassifisering. Figur 5 viser det siste trinnet av denne protokollen, er at farging av de isolerte antrum oocyttene med Hoechst33342 feller en rask sortering basert på deres kromatin organisasjon. Denne markøren flekker levende celler mye raskere enn DAPI, for eksempel, og må brukes på supravital konsentrasjon (50 ng / mL) for å bevare celle levedyktighet. Cellefarging for kromatin organisasjon er trolig den mest kritiske trinn i denne protokollen: hvis ubefruktede egg er glade for lenge kan de bli skadet og blir ubrukelig for fremtidige essays. Totalt, hvis brukt på mus oocytter, dette er en enkel metode som ikke krever spesielle forholdsregler (unntatt de som er angitt i metoden avsnitt). Alle trinnene kan utføres ved romtemperatur.
Figur 1. Utarbeidelse av en munn pipette bruker glass Pasteur pipetter og en Bunsen-brenner. Klikk her for å se en større versjon av this figur.
Figur 2. Intakte eggstokkene i petriskål fylt med forvarmet og likevekt M2 medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Initial isolering av antrum ubefruktede egg fra antrum folliklene ved hjelp av en steril nål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Overføring av nyisolerte ubefruktede eggmed en munn pipette fra petriskål (A) til en annen petriskål som inneholder små dråper med forvarmet og likevekt M2medium (B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Oocytter farget og sorteres med Hoechst33342. Enkeltbilder av NSN og SN oocytter tatt på konfokalmikroskop Olympus Fluoview Fv10i (forstørrelse 60X; bar: 10 mikrometer; PhC: fase kontrast). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver metoden som brukes til å isolere og klassifisere mus antrum GV eggceller. Det er ingen spesielle viktige skritt for å understreke, med få unntak. Først: denne prosedyren skal utføres så raskt som mulig å: a) opprettholde vitalitet av ubefruktede egg og b) unngå pH-endringer i mediet som brukes. Second: ubefruktede egg bør være kort spent (5-10 sek) for å Hoechst33342 å unngå kromatin skader og påfølgende død av ubefruktede egg, spesielt hvis IVM og IVF er følgende trinn. Til dags dato er dette den raskeste måten å sortere SN og NSN muse antrum eggceller.
Hochest33342 har vist seg å være en effektiv måte å karakter SN og NSN oocytter i hunnmus (og andre pattedyr laboratoriemodeller), men det kan ikke være, dessverre, brukes til å sortere antrum oocytter i mennesker for fruktbarhet formål.
Men siden in vitro modning av umodne oocytter er rutinemessig brukt hos mennesker også, det would være svært viktig å finne en ikke-invasiv måte å skille de "gode" ubefruktede egg (dvs. SN) fra "dårlig" dem (dvs. NSN) for å øke suksessen av in vitro fertilisering og påfølgende potensielle embryo utvikling. Dessuten kunne isolering og kultur av SN ubefruktede egg fra eggstokkvev brukes for fruktbarhet bevaring hos kvinner som gjennomgår kreftbehandling eller lider med eggstokkene patologi.
Ved å utnytte dette naturfenomenet, kan viktige data bli gitt for forståelsen av naturlig forekommende embryo preimplantation tap som taler ikke bare til de som er interessert i den grunnleggende biologi eggcelle utvikling, men også til mennesker og dyr IVF klinikere.
Implikasjonene av denne teknikken for menneskers helse, Biopolitics av embryoer og dyr reproduksjon er betydelige 15. Å kunne identifisere og eliminere "livs uforenlig" oocytter villestor grad øke den effektive nivå av IVF teknikker, som fører til banebrytende løsninger for viktige udekkede medisinske behov.
Faktisk kunne det internasjonale forskningsmiljøet av kjønnsceller biologer bidra til å søke de kritiske forbedringer som trengs for å bruke denne protokollen til menneskelige IVF prosedyrer. Selv om protokollen ikke kan brukes på mennesker (for klare sikkerhetsmessige grunner), fortsatt holder det en enorm kapasitet til å øke kunnskapen om sammenhengen mellom kromatin organisasjon (dvs. genom arkitektur) og genuttrykk i sluttfasen av antral modning , en av de varme temaer i menneskelig reproduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A.
