Summary
Aquí se presenta un protocolo para la caracterización de los ovocitos antrales ratón sobre la base de la organización nucleolar.
Introduction
Antrales ovocitos completamente crecidos (GV, vesícula germinal) aislados del compartimento antral del ovario se utilizan de forma rutinaria para diferentes propósitos, tales como, por ejemplo, el estudio de los mecanismos moleculares y celulares detrás de la maduración in vitro hasta la etapa metafase II.
A pesar de sus hermosos apariencia ovocitos más antrales, pero no todos, son capaces de completar la meiosis y llegar a la etapa de blastocisto; de hecho, en muchas especies de mamíferos, incluyendo seres humanos 1,2, aproximadamente 30% de ellos detener su desarrollo en la etapa de 2 células, si se produce la fertilización 3-5. Hasta la fecha, unos parámetros se utilizan para distinguir entre ovocitos capaces de sostener el desarrollo embrionario de los que no pueden hacerlo.
Por ejemplo, la tinción de azul de cresilo (BCB) es un método válido para ordenar los ovocitos basados en la actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa-aunque la utilidad de este método de clasificación relacionadas con BCB + o tinción es BCB-todavía depende 6-8 laboratorio.
Otro método bien establecido reside en su organización de la cromatina: si se tiñeron con los tintes de intercalación de ADN (como Hoechst33342), el 70% de los ovocitos antrales muestra un anillo de tinte positivo alrededor del nucléolo y se llaman Rodeado Nucleolo (SN), mientras que el restante 30% mostrar unas señales positivas más manchados y se llaman No Rodeado Nucleolo (NSN) 3-5. Recientemente hemos demostrado que la ausencia de celosías citoplasmáticos 9 (CPL, centros de almacenamiento importantes para ARNm y ribosomas maternos en ambos ovocitos de mamíferos y embriones) 10 y la baja regulación de MATER (esencial para la formación de CPL 11), junto con la presencia de gotas de lípidos en sus citoplasmas 9,12, puede haber otras causas relacionadas con el ovocitos incapacidad NSN para continuar más allá de la etapa de 2 células.
Desafortunadamente, algunas técnicas se pueden aplicar para ordenar SN antral y ovocitos NSN y,Por esta razón, el desarrollo de un método menos invasivo (sin tinción nuclear, los procedimientos de fijación o la manipulación con pipetas boca) podría llegar a ser muy importante para aumentar las tasas de tanto el desarrollo del embrión humano y animal.
En este trabajo se detalle el protocolo simple y rápida utilizó para aislar ad tipo SN y NSN ovocitos antrales de ratones hembras y se dirige a todos los científicos interesados en el estudio de la gametogénesis femenina, la maduración del ovocito y el desarrollo embrionario.
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Protocol
Este protocolo se lleva a cabo de conformidad con los principios rectores de la Europea (UE) 63/2010 y 26/2014 (italianos) leyes que protegen a los animales utilizados para la investigación científica. La eutanasia Dislocación cervical se utiliza para ovarios aislamiento y es realizado por expertos y personas que figuran en el protocolo aprobado abarca este estudio entrenado.
1. Los animales
- Mantener adultos de 3 a ratones hembra de 6 semanas de edad, en una habitación con temperatura y humedad controladas (con fases de 12L: 12D y alimentados ad libitum).
- Inyectar ratones por vía intraperitoneal con 2,5 UI de gonadotropina de suero de yegua embarazada (PMSG) para estimular el crecimiento folicular imitando los efectos de la hormona folículo estimulante (FSH). Aislar los ovarios para ovocitos antrales de 48 horas de recogida más tarde. La eutanasia del ratón hembra previamente inyectados con PMSG, de acuerdo con sus directrices institucionales.
- Quite rápidamente los ovarios de la cavidad del cuerpo y los situará en el cont placa de Petriaining medio M2 para el aislamiento ovocitos posterior (véase la sección 3).
- Hacer una incisión en la piel que cubre la pared abdominal seguido de una incisión en el peritoneo mediante el uso de tijeras de disección estériles. Abra la incisión para exponer el abdomen, mover las agallas en un lado con unas pinzas estériles y localizar las trompas uterinas, formando una forma de V a partir de la vejiga.
- Observar los ovarios ubicados debajo de los riñones. Mantenga cada tubo con pinzas estériles y hacer una pequeña incisión en la parte inferior de los ovarios para liberarlos. Transferencia ambos ovarios en la parte inferior de una placa de Petri que contiene medio de pre-equilibrada.
2. Preparación de la hormona
- Diluir PMSG (disponible en diferentes concentraciones madre) con solución salina isotónica estéril para obtener una concentración de trabajo de 2,5 UI de hormona por 0,1 ml para un volumen de inyección adecuado.
NOTA: Las soluciones de hormonas deben alícuotas en tubos de 0,5 ml y se almacenaron a -20 ° C hasta el día de uso. No mantenga alícuotas diluidas de más de tres meses a -20 ° C. Una vez descongelado, si se realizan inyecciones de serie, almacenar las alícuotas de las soluciones de la hormona en el 4 ° C y utilizarlos dentro de 4 días.
3. antro ovocitos Aislamiento
Para el aislamiento ovocitos adecuado:
- Equilibrar medio M2 13 (M2) en 5% de CO 2 y 37 ° C durante al menos 1 hr antes de iniciar el procedimiento de aislamiento ovocitos. Preparar dos placas de Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 ml de M2 para perforar ovario y la segunda una con pequeñas gotas (20 l) de M2 cubierto con aceite mineral (~ 1,5 ml) para la transferencia de ovocitos después del aislamiento de la ovario (ver 3.4 a 3.6). Mantenga ambas placas de Petri en la incubadora a 5% de CO 2 y 37 ° C hasta que esté listo para ser utilizado.
- Utilice un microscopio estereoscópico durante los procedimientos de aislamiento de ovocitos.
- Preparar pipetas de vidrio boca delgadas para recoger los ovocitos por stretchhing pipetas Pasteur de vidrio mantienen horizontalmente (la celebración de los extremos de la pipeta con las dos manos), sobre una vertical de la llama procedente del quemador Bunsen (Figura 1).
- Una vez que el vidrio comienza a derretirse, tome la pipeta de la llama y realizar un movimiento de tracción rápida para obtener la pipeta deseada. Firmemente cortar el exceso de vidrio cerca de la punta de la pipeta con uñas para ajustar la longitud y el diámetro del capilar interno estrecho. Asegúrese de que el capilar fina tiene un diámetro interno de ~ 100 m, ligeramente mayor que el diámetro del ovocito (~ 80 m).
- Para la boca pipeta, conecte un extremo del tubo de aspiración a la pipeta tirado por el uso de una punta adecuada y coloque el otro extremo en la boca, asegurándolo con los dientes.
- Recoger los ovarios usando pinzas estériles y depositarlas en la parte inferior de una placa de cultivo celular de Petri (35 mm x 10 mm). Cubra con 1 ml de M2 equilibraron previamente a 37 ° Cy 5% de CO 2 (Figura 2).
- Pinchar suavemente los folículos antrales de los ovarios con una aguja de jeringa de insulina estéril para liberar ovocitos antrales en M2 (Figura 3).
- Suavemente boca pipetear los ovocitos a través de una pipeta Pasteur estrecha para eliminar las células del folículo y cualquier otra restos de tejido sea posible (Figura 4A) y luego conformarse ellos en la parte inferior de las pequeñas gotas (20 l) de M2 cubiertos con aceite mineral adecuado para el cultivo de embriones (anteriormente preparado; Figura 4B).
NOTA: Es importante eliminar todas las células del cúmulo unidos a la zona pelúcida de los ovocitos por pipeteo continua a través de varias y diferentes gotas de M2. Realice este paso lo más rápido posible para evitar alteraciones en el pH del medio.
4. antral Los ovocitos tinción con Hoechst33342
NOTA: los ovocitos antrales se puede distinguir en SN (Rodeado Nucleolo), NSN (No Rodeado Nucleolo) oen cualquier otra forma intermedia, en función de su organización de la cromatina después de la tinción con la concentración de supravital Hoechst33342 (o cualquier otro marcadores específicos de bases AT) 14. De hecho, los ovocitos SN muestran un anillo de Hoechst-positivas alrededor del nucléolo, mientras que el NSN no lo hacen, de ahí su nombre.
Para la tinción de ovocitos adecuado:
- La transferencia de los ovocitos utilizando una pipeta de boca en gotas de Hoechst33342 (20 l) diluido en M2 a la concentración supravital de 50 ng / l durante 10 min en oscuridad.
- Después de la incubación con Hoechst33342, transferir cada solo ovocito con una pipeta de boca en la parte inferior de las pequeñas gotas (5 l) de M2 cubiertos con aceite mineral, para la clasificación sobre la base de organización de la cromatina (SN o NSN). Utilice cualquier microscopio de fluorescencia equipado con filtro Hoechst33342 (longitud de onda de emisión de 486 nm) para visualizar la configuración de la cromatina de los ovocitos.
NOTA: Dependiendo del tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, it puede llegar a ser imperativo el uso de fondo de cristal placa de Petri para la adquisición de imágenes. La microscopía confocal Olympus Fluoview FV10i cuando está equipado con un soporte de muestra para 35 mm plato requiere sólo de abajo a los platos de cristal para la adquisición de imágenes, con un grosor estándar de 0,17 mm y un rango de 0,13 a 0,21 mm aceptables. - Excite los ovocitos durante no más de 5-10 segundos, probablemente tiempo suficiente para visualizar la presencia o la ausencia de un anillo alrededor del nucléolo (Figura 5).
- Después de la clasificación, la cultura de la SN antral y ovocitos NSN en M2 en el 5% de CO 2 y 37 ° C para inducir la maduración in vitro o mantenerlos en tampones apropiados para los análisis moleculares o celulares.
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Representative Results
Las siguientes imágenes muestran el método utilizado para aislar los ovocitos de los ovarios de ratones antrales, a partir de la preparación de las pipetas para la clasificación de los ovocitos 'mediante Hoechst33342. Este método es bastante sencillo y se puede realizar en cualquier laboratorio equipado con una incubadora de CO 2, un estereomicroscopio y un microscopio de fluorescencia equipado con el filtro correcto para la observación de la Hoechst33342 Figura 1 muestra la etapa inicial de preparación de pipeta:. Como el cristal empieza a fundirse y se vuelven blandos, ambos extremos de la pipeta deben ser separados y, al mismo tiempo, la pipeta debe ser sacado de la llama. Alternativamente, capilar de vidrio se puede tirar de la misma manera o usar un extractor de micropipeta, si está calibrado correctamente. Este es un paso crucial, ya que es muy importante contar con la pipeta de boca derecha con el diámetro capilar derecha: si es demasiado delgada, los ovocitos pueden ser fragmentados dentro de la pequeña capitalizaciónIllary y morir en pocos minutos, si es demasiado grande, una succión adecuada del medio que contiene los ovocitos se puede perder cuando se mueve los ovocitos, por ejemplo, a partir de una gota a otro. Las figuras 2 y 3 muestran el aislamiento mecánico de ovocitos antrales de los folículos antrales utilizando una aguja de insulina estéril. Es bastante fácil de reconocer estos folículos debido a que se caracterizan por una cavidad o antro que contiene un fluido, que es el medio en el que las células de la granulosa y el ovocito se encuentran ya través del cual diferentes moléculas pueden ser intercambiados desde y hacia el entorno externo. Una vez aislados, los ovocitos antrales deben ser transferidos de una gota a otro de medio M2 para eliminar las células somáticas que rodean a los ovocitos, como se muestra en las Figuras 4A y B. Una vez "desnudas", los ovocitos antrales están listos para la clasificación. La Figura 5 muestra el último paso de este protocolo, que es la tinción de los ovocitos antrales aisladas con Hoechst33342 fo una clasificación rápida en función de su organización de la cromatina. Este marcador manchas células, que viven mucho más rápidamente que DAPI por ejemplo, y se deben utilizar a una concentración supravital (50 ng / l) para preservar la viabilidad celular. Tinción celular para la organización de la cromatina es probablemente el paso más crítico de este protocolo: si los ovocitos se excitan demasiado tiempo pueden resultar dañados y no se pueden utilizar para los ensayos futuros. En general, si se aplica a los ovocitos de ratón, este es un método sencillo que no requiere precauciones específicas (a excepción de los indicados en la sección de método). Todas las etapas se pueden realizar a temperatura ambiente.
Figura 1. Preparación de una pipeta de boca utilizando pipetas Pasteur de vidrio y un mechero Bunsen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de this figura.
Figura 2. ovarios intactos en placa de Petri llena de medio M2 precalentado y se equilibra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. aislamiento inicial de ovocitos antrales de folículos antrales por medio de una aguja estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Traslado de los ovocitos recién aisladascon una pipeta de boca de la placa de Petri (A) a una placa de petri diferente que contiene pequeñas gotas de pre-calentado y se equilibró M2medium (B) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Los ovocitos manchadas y ordenados con Hoechst33342. Imágenes individuales de NSN y SN ovocitos tomadas en el microscopio confocal Olympus Fluoview FV10i (ampliación 60X; bar: 10 m; PhC: contraste de fase). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe el método usado para aislar y clasificar antrales ratón ovocitos GV. No hay pasos críticos particulares a subrayar, con pocas excepciones. En primer lugar: este procedimiento debe realizarse lo más rápidamente posible para: a) mantener la vitalidad de los ovocitos y b) evitar los cambios de pH en el medio utilizado. Segunda: los ovocitos deben ser brevemente excitado (5-10 seg) para Hoechst33342 para evitar daños de la cromatina y la posterior muerte de los ovocitos, especialmente si IVM y la FIV son los siguientes pasos. Hasta la fecha, esta es la manera más rápida de resolver SN y NSN ratón ovocitos antrales.
Hochest33342 ha demostrado ser una forma eficaz para caracterizar SN y NSN ovocitos en ratones hembra (y otros modelos de laboratorio de mamíferos), pero no puede ser, por desgracia, que se utiliza para ordenar los ovocitos antrales en los seres humanos con fines de fertilidad.
Sin embargo, ya que la maduración in vitro de oocitos inmaduros se utiliza de forma rutinaria en los seres humanos también, woULD ser extremadamente importante encontrar una forma no invasiva para distinguir los "buenos" los ovocitos (es decir, SN) de los "malos" (es decir, NSN) para aumentar el éxito de la fecundación in vitro y posterior desarrollo de los futuros embriones. Además, el aislamiento y cultivo de ovocitos SN a partir de tejido de ovario podrían ser utilizados para preservación de la fertilidad en mujeres sometidas a tratamientos contra el cáncer o que sufren de patologías de ovario.
Al explotar este fenómeno natural, los datos importantes se podrían proporcionar para la comprensión del origen natural pérdidas preimplantación de embriones que habla no sólo a los interesados en la biología básica de desarrollo de los ovocitos, sino también para los médicos de FIV humanos y animales.
Las implicaciones de esta técnica para la salud humana, la biopolítica de embriones y la reproducción animal son significativas 15. Ser capaz de identificar y eliminar los ovocitos "de la vida" sería incompatibleaumentar en gran medida el nivel efectivo de las técnicas de fecundación in vitro, lo que lleva a las soluciones de vanguardia para importantes necesidades clínicas insatisfechas.
De hecho, la comunidad científica internacional de biólogos de gametos podría contribuir a buscar las mejoras críticas necesarias para aplicar este protocolo con los procedimientos de fecundación in vitro humanos. A pesar de que el protocolo no puede aplicarse a los seres humanos (por razones de seguridad claras), todavía mantiene una enorme capacidad para mejorar el conocimiento de la relación entre la organización de la cromatina (es decir, la arquitectura del genoma) y la expresión génica durante las etapas finales de la maduración antral , uno de los temas candentes en la reproducción humana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
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