体外 和 在体 内 研究角膜内皮-间质转化的模型

摘要

使用牛角膜内皮细胞的原代培养研究角膜内皮-间充质转化的机制。此外，采用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型以证实角膜内皮-间充质转化的发生 体内.

摘要

角膜内皮细胞（CECs）通过主动泵功能在维持角膜透明性中发挥关键作用。CEC数量减少可能导致角膜水肿和视力下降。然而，人角膜内皮细胞的增殖潜能易受损害。此外，细胞生长的刺激常因逐渐发生的内皮-间质转化（EnMT）而变得复杂。因此，理解EnMT的机制对于促进具有正常功能的CEC再生至关重要。在本研究中，我们通过剥离角膜瓣上的CECs及其后弹力膜建立了牛CEC的原代培养，并证明牛CEC表现出EnMT过程，包括表型改变、β-catenin的核转位以及EMT调控因子snail和slug的表达变化 体外 培养。此外，我们采用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型来证实内皮-间质转化（EnMT）过程 体内总体而言， 体外 牛角膜内皮细胞的原代培养 体内 大鼠角膜内皮冷冻损伤模型为研究内皮-间质转分化（EnMT）机制提供了有用的平台。

引言

角膜内皮细胞（CECs）通过主动泵送作用调节角膜基质的水合状态，从而在维持角膜透明性和视力方面发挥关键作用¹。由于人角膜内皮细胞的增殖能力有限，细胞数量随年龄增长而减少，角膜内皮损伤后的修复通常通过细胞扩大和迁移实现，而非细胞有丝分裂²。当角膜内皮细胞密度降至约500个细胞/mm²以下时，角膜基质的脱水状态无法维持，导致大泡性角膜病变和视力受损^3,4。

人类角膜内皮细胞增殖潜力有限的原因包括衰老细胞中表皮生长因子及其受体的表达降低⁵，房水中的抗增殖性TGFβ2⁶，以及接触抑制^2,7尽管一些生长因子（如碱性成纤维细胞生长因子，bFGF）可促进体外培养的人角膜内皮细胞增殖，但其培养效率仍然有限^8,9此外，CECs 可能在培养过程中发生表型改变 离体 扩增，类似于上皮-间质转化（EMT）^10-13内皮-间充质转化（EnMT）的特征包括细胞连接失稳、顶-基底极性丧失、细胞骨架重排、α-平滑肌肌动蛋白表达以及I型胶原分泌。¹⁴上述所有特性可能会破坏角膜内皮细胞（CECs）的正常功能，从而妨碍其应用 离体 组织工程中培养的角膜内皮细胞。此外，内皮-间质转分化（EnMT）与多种角膜内皮疾病的发生机制相关，包括福克斯角膜内皮营养不良和角膜后....

方案

本研究中遵循的所有操作程序均符合眼科与视觉研究中动物使用方面的《视力研究协会声明》，并已获得台湾大学医学院附属医院机构动物照护及使用委员会的批准。

1. 牛角膜内皮细胞的分离、原代培养制备及免疫染色

1. 从当地屠宰场获取新鲜的牛眼。
2. 将眼球置于10% w/v聚维酮碘溶液中消毒3分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。
3. 在无菌条件下使用手术刀和剪刀切取角膜片，然后在解剖显微镜下用镊子剥离后弹力层（需注意，本研究中牛眼由当地屠宰场预先摘除，因此本实验的第一步是在实验室中对已摘除的眼球进行消毒）。
4. 将后弹力层置于1 ml胰蛋白酶中，在37 °C孵育30分钟。以112 × g离心5分钟收集牛角膜内皮细胞（CECs）。将细胞重悬于1 ml补充激素的上皮培养基（SHEM）中，该培养基由等体积的HEPES缓冲的DMEM培养基和Ham's F12培养基组成，并添加5%胎牛血清、0.5%二甲基亚砜、2 ng/ml人表皮生长因子、5 mg/ml胰岛素、5 mg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒、1 nmol/l霍乱毒素、50 mg/ml庆大霉素和1.25 mg/ml两性霉素B。
5. 将细胞（每只眼约1 × 10⁵个细胞）接种至6 cm培养皿中，在SHEM培养基中培养。将培养皿置于37 °C、含5% CO₂的空气环境中孵育，每3天更换一次培养基。
6. 当细胞达到融合状态时，用PBS洗涤，....

结果

在分离牛角膜内皮细胞（CECs）后，将细胞进行培养 体外. 图1 展示了牛角膜内皮细胞的相差显微图像。细胞汇合时呈现的六边形形态表明，在细胞分离过程中未受到角膜基质成纤维细胞的污染。 图2 显示了在指定时间点使用针对 ABC、snail 和 slug 的抗体进行的免疫染色。除了表型变化外 体外 培养过程中，观察到ABC和EMT调控因子相应的核转位现象。 图3 说明广谱MMP抑制剂marimastat对EnMT过程的影响 体外 培养的牛角膜内皮细胞。 图4 包括大鼠在冷冻损伤后进行前房注射的外部眼部照片。 图5 显示了在冷冻损伤后进行前房注射的大鼠角膜纽的免疫染色结果，该实验使用了针对 ABC 的抗体。在 PBS 组中观察到 ABC 的核转位现象，而在 bFGF 组中该现象显著增强，表明 Wnt/β-catenin 信号通路及内皮间质转化（EnMT）过程.......

讨论

CECs 以其在细胞增殖过程中易于发生内皮间质转化（EnMT）而著称。为了制定抑制 EnMT 过程的治疗策略，必须深入理解 EnMT 的作用机制。本文描述了两种用于研究 EnMT 的模型，即牛角膜内皮细胞（bovine CEC） 体外 培养模型和大鼠角膜内皮冷冻损伤模型。我们的结果在两种模型中均证实了内皮间质转化（EnMT）过程的发生。此外，马立马司他在两种模型中均重现了抑制EnMT的效果，提示这两种模型具有相同的机制。

牛的CEC 体外 培养模型易于操作。此外，与人或灵长类动物的角膜内皮细胞（CEC）相比 体外 先前研究中采用的培养模型^17,18，牛眼更大且更容易获取，因此可获得更多的角膜内皮细胞（CECs）。在本研究中，我们从当地屠宰场获取摘除的牛眼。由于牛眼具有新鲜性，所收获的牛角膜内皮细胞数量可能存在变异，约为 1 x 10⁵ 每只眼睛的细胞数。相比之下，正常人角膜内皮细胞（CECs）的数量约为 3 x 10⁵ 每只眼睛。此数量在研究级角膜中较低，在移植后.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基与 Ham's F12 培养基	ThermoFisher Scientific	11330
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140-079
二甲基亚砜	Sigma	D2650
人表皮生长因子	ThermoFisher Scientific	PHG0311
胰岛素、转铁蛋白、硒	ThermoFisher Scientific	41400-045
霍乱毒素	Sigma	C8052-1MG
庆大霉素	ThermoFisher Scientific	15750-060
两性霉素B	ThermoFisher Scientific	15290-026
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	111219
吐温X-100	Sigma	T8787
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
马立马司他	Sigma	M2699-25MG
抗活性β-连环蛋白抗体	Millpore	05-665
抗snail抗体	Santa cruz	sc28199
抗slug抗体	Santa cruz	sc15391
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗	ThermoFisher Scientific	A-11001	用于牛角膜内皮细胞ABC染色
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗	ThermoFisher Scientific	A-11003	用于大鼠角膜内皮ABC染色
山羊抗兔IgG（H+L）二抗	ThermoFisher Scientific	A-11008	用于牛角膜内皮细胞snail和slug染色
抗体稀释液	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	ThermoFisher Scientific	D1306
封片剂	Vector Laboratories	H-1000
激光扫描共聚焦显微镜	ZEISS	LSM510
赛拉嗪	Bayer	N/A
替来他明与唑拉西泮混合物	Virbac	N/A	兽用药物
盐酸丙帕他莫滴眼液	Alcon	N/A	兽用药物
0.1% 阿托品	吴福药业有限公司	N/A	临床药物
0.3% 硫酸庆大霉素	信华集团	N/A	临床药物
碱性成纤维细胞生长因子	ThermoFisher Scientific	PHG0024	临床药物