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方法文章

体外 和 在体 内 研究角膜内皮-间质转化的模型

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DOI：

10.3791/54329

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2016年8月20日

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

本文内容

摘要

使用牛角膜内皮细胞的原代培养研究角膜内皮-间充质转化的机制。此外，采用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型以证实角膜内皮-间充质转化的发生 体内.

摘要

角膜内皮细胞（CECs）通过主动泵功能在维持角膜透明性中发挥关键作用。CEC数量减少可能导致角膜水肿和视力下降。然而，人角膜内皮细胞的增殖潜能易受损害。此外，细胞生长的刺激常因逐渐发生的内皮-间质转化（EnMT）而变得复杂。因此，理解EnMT的机制对于促进具有正常功能的CEC再生至关重要。在本研究中，我们通过剥离角膜瓣上的CECs及其后弹力膜建立了牛CEC的原代培养，并证明牛CEC表现出EnMT过程，包括表型改变、β-catenin的核转位以及EMT调控因子snail和slug的表达变化 体外 培养。此外，我们采用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型来证实内皮-间质转化（EnMT）过程 体内总体而言， 体外 牛角膜内皮细胞的原代培养 体内 大鼠角膜内皮冷冻损伤模型为研究内皮-间质转分化（EnMT）机制提供了有用的平台。

引言

角膜内皮细胞（CECs）通过主动泵送作用调节角膜基质的水合状态，从而在维持角膜透明性和视力方面发挥关键作用1。由于人角膜内皮细胞的增殖能力有限，细胞数量随年龄增长而减少，角膜内皮损伤后的修复通常通过细胞扩大和迁移实现，而非细胞有丝分裂2。当角膜内皮细胞密度降至约500个细胞/mm2以下时，角膜基质的脱水状态无法维持，导致大泡性角膜病变和视力受损3,4。

人类角膜内皮细胞增殖潜力有限的原因包括衰老细胞中表皮生长因子及其受体的表达降低5，房水中的抗增殖性TGFβ26，以及接触抑制2,7尽管一些生长因子（如碱性成纤维细胞生长因子，bFGF）可促进体外培养的人角膜内皮细胞增殖，但其培养效率仍然有限8,9此外，CECs 可能在培养过程中发生表型改变 离体 扩增，类似于上皮-间质转化（EMT）10-13内皮-间充质转化（EnMT）的特征包括细胞连接失稳、顶-基底极性丧失、细胞骨架重排、α-平滑肌肌动蛋白表达以及I型胶原分泌。14上述所有特性可能会破坏角膜内皮细胞（CECs）的正常功能，从而妨碍其应用 离体 组织工程中培养的角膜内皮细胞。此外，内皮-间质转分化（EnMT）与多种角膜内皮疾病的发生机制相关，包括福克斯角膜内皮营养不良和角膜后膜形成15,16因此，理解内皮间质转化（EnMT）的机制可能有助于调控EnMT过程，并促进角膜内皮细胞（CECs）的再生，从而恢复其正常功能。

在本研究中，我们描述了一种从角膜瓣中分离牛角膜内皮细胞（CECs）的方法。在原代培养中 体外，观察到内皮间质转化（EnMT）过程，包括表型改变、β-catenin 的核转位以及 EMT 调控因子 snail 和 slug 的变化。我们进一步描述了一种用于验证 EnMT 的方法 体内 通过使用大鼠角膜内皮冷冻损伤模型。利用这两种模型，我们证明了广谱基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂马里马司他（marimastat）能够抑制内皮间质转化（EnMT）过程。所述实验方案有助于深入分析EnMT机制，并推动针对EnMT过程的调控策略的开发，以实现进一步的临床应用。

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方案

本研究中遵循的所有操作程序均符合眼科与视觉研究中动物使用方面的《视力研究协会声明》，并已获得台湾大学医学院附属医院机构动物照护及使用委员会的批准。

1. 牛角膜内皮细胞的分离、原代培养制备及免疫染色

  1. 从当地屠宰场获取新鲜的牛眼。
  2. 将眼球置于10% w/v聚维酮碘溶液中消毒3分钟，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。
  3. 在无菌条件下使用手术刀和剪刀切取角膜片，然后在解剖显微镜下用镊子剥离后弹力层（需注意，本研究中牛眼由当地屠宰场预先摘除，因此本实验的第一步是在实验室中对已摘除的眼球进行消毒）。
  4. 将后弹力层置于1 ml胰蛋白酶中，在37 °C孵育30分钟。以112 × g离心5分钟收集牛角膜内皮细胞（CECs）。将细胞重悬于1 ml补充激素的上皮培养基（SHEM）中，该培养基由等体积的HEPES缓冲的DMEM培养基和Ham's F12培养基组成，并添加5%胎牛血清、0.5%二甲基亚砜、2 ng/ml人表皮生长因子、5 mg/ml胰岛素、5 mg/ml转铁蛋白、5 ng/ml硒、1 nmol/l霍乱毒素、50 mg/ml庆大霉素和1.25 mg/ml两性霉素B。
  5. 将细胞（每只眼约1 × 105个细胞）接种至6 cm培养皿中，在SHEM培养基中培养。将培养皿置于37 °C、含5% CO2的空气环境中孵育，每3天更换一次培养基。
  6. 当细胞达到融合状态时，用PBS洗涤，并加入1 ml胰蛋白酶在37 °C孵育5分钟。以112 × g离心5分钟收集细胞，将细胞沉淀重悬于1 ml SHEM培养基中。
    1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以每孔1 × 104的密度将细胞接种至24孔板中的盖玻片上，在SHEM培养基中培养。为研究马立马司他（marimastat）对上皮-间质转化（EnMT）的抑制作用，将细胞在添加了10 µM马立马司他的SHEM培养基中孵育，并每3天更换一次培养基。
  7. 在指定时间点，加入250 µl 4%多聚甲醛（pH 7.4），室温固定细胞30分钟。用250 µl 0.5% Triton X-100透化5分钟，再用10%牛血清白蛋白封闭30分钟。
  8. 加入针对活化型β-连环蛋白（active beta-catenin, ABC）、snail和slug的一抗，在4 °C孵育过夜。一抗稀释比例为1:200，稀释液为含10 mM PBS、1% w/v牛血清白蛋白和0.09% w/v叠氮化钠的抗体稀释液。
  9. 用PBS洗涤细胞两次，每次15分钟，然后在室温下加入Alexa Fluor标记的二抗（按1:100比例稀释于抗体稀释液中），孵育1小时。
  10. 用含2 µg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液覆盖细胞进行细胞核复染，再用PBS洗涤两次，每次15分钟，最后用抗荧光淬灭封片剂封片。
  11. 使用激光共聚焦显微镜，采用20倍物镜，在激发波长405 nm和488 nm下获取免疫荧光图像。

2. 大鼠角膜内皮冷冻损伤模型建立与前房注射

  1. 使用肌肉注射 2% 赛拉嗪（5.6 mg/kg）和替来他明联合唑拉西泮（18 mg/kg）对 12 周龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠进行麻醉。轻轻捏压动物皮肤，确认在无皮肤抽搐的情况下达到适当麻醉状态。
  2. 向每只大鼠右眼滴加一滴 0.5% 盐酸丙帕卡因，以减轻眼部疼痛和眨眼反射。向左眼涂抹四环素眼膏，防止角膜干燥。
  3. 将不锈钢探针（直径 = 3 mm）置于液氮中冷却。将该探针置于右眼角膜中央，持续 30 秒。操作过程中频繁向右眼滴加 PBS，以防止角膜干燥。
  4. 冷冻损伤后立即以及每日一次滴加 0.1% 阿托品和 0.3% 硫酸庆大霉素，以缓解睫状肌痉挛引起的眼部疼痛并预防感染。
    1. 操作后使用加热灯保持大鼠体温，并在麻醉后每 15 分钟观察其恢复情况，直至恢复运动控制能力。此外，在恢复期间向右眼涂抹四环素眼膏，防止角膜干燥。
  5. 连续 3 天重复进行角膜冷冻损伤操作。
  6. 为将 marimastat 或 bFGF 注入大鼠眼前房，按照前述方法对大鼠进行麻醉。向右眼滴加一滴 0.5% 盐酸丙帕卡因，以减轻眼部疼痛和眨眼反射。
  7. 用无菌 PBS 冲洗眼表。在手术显微镜下，将连接 1 ml 注射器的 30 G 针头插入近角膜缘透明角膜处，进针平面位于虹膜上方并与之平行，进行前房穿刺。
  8. 将针头斜面朝上，轻微按压角膜伤口以排出部分房水，降低眼内压。随后将 0.02 ml 药物注入前房。拔针时用棉签轻轻压迫针道。
  9. 在指定时间点，于手术显微镜下拍摄眼部外部图像。

3. 大鼠角膜片的获取与免疫染色

  1. 处死大鼠时，将其放入安乐死舱内，并以每分钟舱室体积的10-30%的流速注入100% CO2。在呼吸停止且眼球颜色变浅后，继续维持CO2注入1分钟。
  2. 用锋利刀片在角膜缘处刺入大鼠眼球。沿角膜缘使用角膜剪剪下角膜。将角膜展平于载玻片上。若角膜卷曲，可作额外的放射状切口。
  3. 用250 µl的4%多聚甲醛（pH 7.4）在室温下固定角膜30分钟。用250 µl的0.5% Triton X-100透化5分钟，并用10%牛血清白蛋白封闭30分钟。
  4. 将角膜与针对ABC的初级抗体在4 °C孵育过夜，抗体稀释比例为1:200（使用抗体稀释液）。用PBS洗涤角膜两次，每次15分钟；然后在室温下与二抗（1:100稀释于抗体稀释液中）孵育1小时。用2 µg/ml的4',6-二脒基-2-苯基吲哚覆盖细胞以复染细胞核，并用PBS洗涤两次，每次15分钟。
  5. 将角膜用抗荧光淬灭封片液封片。使用激光扫描共聚焦显微镜，在20倍物镜放大倍数下，于405 nm和561 nm激发波长下获取免疫荧光图像。

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结果

在分离牛角膜内皮细胞（CECs）后，将细胞进行培养 体外. 图1 展示了牛角膜内皮细胞的相差显微图像。细胞汇合时呈现的六边形形态表明，在细胞分离过程中未受到角膜基质成纤维细胞的污染。 图2 显示了在指定时间点使用针对 ABC、snail 和 slug 的抗体进行的免疫染色。除了表型变化外 体外 培养过程中，观察到ABC和EMT调控因子相应的核转位现象。 图3 说明广谱MMP抑制剂marimastat对EnMT过程的影响 体外 培养的牛角膜内皮细胞。 图4 包括大鼠在冷冻损伤后进行前房注射的外部眼部照片。 图5 显示了在冷冻损伤后进行前房注射的大鼠角膜纽的免疫染色结果，该实验使用了针对 ABC 的抗体。在 PBS 组中观察到 ABC 的核转位现象，而在 bFGF 组中该现象显著增强，表明 Wnt/β-catenin 信号通路及内皮间质转化（EnMT）过程...

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讨论

CECs 以其在细胞增殖过程中易于发生内皮间质转化（EnMT）而著称。为了制定抑制 EnMT 过程的治疗策略，必须深入理解 EnMT 的作用机制。本文描述了两种用于研究 EnMT 的模型，即牛角膜内皮细胞（bovine CEC） 体外 培养模型和大鼠角膜内皮冷冻损伤模型。我们的结果在两种模型中均证实了内皮间质转化（EnMT）过程的发生。此外，马立马司他在两种模型中均重现了抑制EnMT的效果，提示这两种模型具有相同的机制。

牛的CEC 体外 培养模型易于操作。此外，与人或灵长类动物的角膜内皮细胞（CEC）相比 体外 先前研究中采用的培养模型17,18，牛眼更大且更容易获取，因此可获得更多的角膜内皮细胞（CECs）。在本研究中，我们从当地屠宰场获取摘除的牛眼。由于牛眼具有新鲜性，所收获的牛角膜内皮细胞数量可能存在变异，约为 1 x 105 每只眼睛的细胞数。相比之下，正常人角膜内皮细胞（CECs）的数量约为 3 x 105 每只眼睛。此数量在研究级角膜中较低，在移植后...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

感谢中国台湾大学医院医学研究部第二核心实验室工作人员提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白酶ThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基与 Ham's F12 培养基ThermoFisher Scientific11330
胎牛血清ThermoFisher Scientific26140-079
二甲基亚砜SigmaD2650
人表皮生长因子ThermoFisher ScientificPHG0311
胰岛素、转铁蛋白、硒 ThermoFisher Scientific41400-045
霍乱毒素SigmaC8052-1MG
庆大霉素ThermoFisher Scientific15750-060
两性霉素BThermoFisher Scientific15290-026
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences111219
吐温X-100SigmaT8787 
牛血清白蛋白SigmaA7906
马立马司他SigmaM2699-25MG
抗活性β-连环蛋白抗体Millpore05-665
抗snail抗体Santa cruzsc28199
抗slug抗体Santa cruzsc15391
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗ThermoFisher ScientificA-11001用于牛角膜内皮细胞ABC染色
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗ThermoFisher ScientificA-11003用于大鼠角膜内皮ABC染色
山羊抗兔IgG（H+L）二抗ThermoFisher ScientificA-11008用于牛角膜内皮细胞snail和slug染色
抗体稀释液Genemed Biotechnologies10-0001
4',6-二脒基-2-苯基吲哚ThermoFisher ScientificD1306
封片剂Vector LaboratoriesH-1000
激光扫描共聚焦显微镜ZEISSLSM510
赛拉嗪 BayerN/A
替来他明与唑拉西泮混合物VirbacN/A兽用药物
盐酸丙帕他莫滴眼液AlconN/A兽用药物
0.1% 阿托品吴福药业有限公司N/A临床药物 
0.3% 硫酸庆大霉素信华集团N/A临床药物 
碱性成纤维细胞生长因子ThermoFisher ScientificPHG0024临床药物 

参考文献

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