Summary
En primär kultur av bovina korneala endotelceller användes för att undersöka mekanismen av korneal endotel-mesenkymala övergång. Vidare har en råtta hornhinneendotel cryoinjury modell som används för att demonstrera korneal endotel-mesenkymala övergång in vivo.
Protocol
Alla de förfaranden som följts i denna studie överensstämde med Föreningen för forskning i Vision och Ögon uttalande för användning av djur i ögon och Vision Research och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av National Taiwan University Hospital.
1. Isolering, primär kultur beredning, och immunfärgning av bovint östeuropeiska länderna
- Förvärva nya nötkreatur ögon från en lokalt slakteri.
- Desinficera ögonen i en 10% vikt / volym povidon-jodlösning under 3 min. Tvätta dem med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning.
- Skörda korneal knappen med en skalpell och sax under sterila betingelser. Skala Descemets membran med pincett under ett dissektionsmikroskop (observera att i denna studie nötkreatur ögonen enukleation av en lokalt slakteri och därför den första studien förfarandet var desinficering av preenucleated ögon i laboratoriet).
- Inkubera Descemets membran i 1 ml försöketPSIN vid 37 ° C under 30 min. Samla in de bovina länderna i Centraleuropa genom centrifugering vid 112 xg under 5 min. Resuspendera cellerna i 1 ml kompletterat hormonell epitelial medium (SHEM) innehållande lika volymer av HEPES-buffrad Dulbeccos modifierade Eagles-medium och Hams F12-medium, kompletterat med 5% fetalt bovint serum, 0,5% dimetylsulfoxid, 2 ng / ml av human epidermal tillväxtfaktor, 5 mg / ml insulin, 5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml selen, 1 nmol / l av koleratoxin, 50 mg / ml gentamicin och 1,25 mg / ml amfotericin B.
- Ympa cellerna (ca 1 x 10 5 celler per öga) till en 6 cm skål. Kultur dem i SHEM. Inkubera skålen vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 i luft. Ändra odlingsmediet var 3 dagar.
- När cellerna når sammanflytning, tvätta dem i PBS och inkubera dem i 1 ml trypsin vid 37 ° C under 5 min. Samla dem genom centrifugering vid 112 xg under 5 min. Återsuspendera cellpelleten i 1 ml av SHEM.
2. Rat hornhinneendotel Cryoinjury modell och intrakameral Injection
- Söva 12 veckor gamla Sprague-Dawley-råttor med intramuskulära injektioner av 2% xylazin (5,6 mg / kg) och tiletamin plus zolazepam (18 mg / kg). Försiktigt nypa huden på djur för att bekräfta korrekt anestesi i frånvaro av huden ryckningar.
- Ingjuta en droppe 0,5% proparakain hydroklorid till det högra ögat hos varje råtta för att minimera ögonsmärta och blinkreflexen. Ingjutatetracyklin salva på det vänstra ögat för att förhindra korneal torrhet.
- Kyla en sond av rostfritt stål (diameter = 3 mm) i flytande kväve. Applicera sonden av rostfritt stål till den centrala hornhinnan i det högra ögat under 30 sek. Vanliga ingjuta PBS till det högra ögat under förfarandet för att förhindra hornhinnan torrhet.
- Ingjuta 0,1% atropin och 0,3% gentamicinsulfat omedelbart efter cryoinjury och en gång dagligen för att lindra okulär smärta till följd av ciliära spasm och för att förhindra infektion.
- Efter ingreppet, hålla råttorna värma med hjälp av en värmelampa, och observera deras återhämtning var 15 minuter efter anestesi tills de återfår motorstyrning. Dessutom gäller tetracyklin salva till höger öga för att förhindra hornhinnan torrhet under återhämtningsperioden.
- Upprepa korneal cryoinjury under 3 på varandra följande dagar.
- För att leverera marimastat eller bFGF i den främre kammaren hos råtta ögon, söva råttorna som beskrivits tidigare. Ingjuta en droppe0,5% proparakain hydroklorid i höger öga för att minimera ögonsmärta och blinkreflexen.
- Skölj den okulära ytan med steril PBS. Utför främre kammaren paracentesis enligt ett operationsmikroskop genom att sätta in en 30 G nål fäst till en 1 ml spruta vid paralimbal klara hornhinnan i ett plan ovanför och parallellt med iris.
- Vrid nålen fasa upp, och något tryck hornhinnans såret rinna några kammarvattnet och minska det intraokulära trycket. Injicera 0,02 ml av drogen intrakameralt. komprimera försiktigt nålen tarmkanalen med en bomullstopp under ånger nålen.
- Fotografera den externa ögat vid en indikerad tidpunkt under operationsmikroskop.
3. Skörd Rat Corneal knappen och immunfärgning
- Att avliva råttorna, placera dem i en dödshjälp kammare och ingjuta 100% CO2 vid en fyllningshastighet av 10-30% av kammarens volym per minut. Bibehålla CO2 infusion för enytterligare en minut efter bristande andning och bleka ögonfärg.
- Penetrerar rått ögat vid limbus med en vass kniv. Skär hornhinnor med hornhinnan sax längs limbus. Platta hornhinnor på en bild. Gör ytterligare radiella snitt om hornhinnorna krypa upp.
- Fäst hornhinnor med 250 | il av 4% paraformaldehyd, pH 7,4, under 30 min vid rumstemperatur. Permeabilisering med 250 pl av 0,5% Triton X-100 under 5 minuter, och blockera med 10% bovint serumalbumin under 30 min.
- Inkubera hornhinnor med primära antikroppar mot ABC över natten vid 4 ° C med en utspädning om 1: 200 i antikroppsspädningsmedel. Tvätta hornhinnorna två gånger med PBS under 15 min, och inkubera dem med den sekundära antikroppen (1: 100 i antikroppsspädningsmedel) vid rumstemperatur under en timme. Motfärg cellkärnan genom att täcka cellerna med 2 | j, g / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, och tvätta cellerna två gånger med PBS under 15 min.
- Montera hornhinnor i anti-fading monteringslösning. obtain immunofluorescens bilder vid exciteringsvåglängder av 405 och 561 nm med en laserskanning konfokalmikroskop vid 20X objektivförstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter isolering av länderna i Centraleuropa nötkreatur, odlades cellerna in vitro. Figur 1 presenterar de faskontrast bilder av de bovina länderna i Centraleuropa. Den sexkantiga formen på cellerna vid konfluens indikerade att cellerna inte var förorenat av korneal stromal fibroblast under cellisolering. Figur 2 skildrar den immunfärgning som utfördes med användning av antikroppar mot ABC, snigel, och slug vid en indikerad tidpunkt. Bortsett från fenotypiska förändringar i in vitro-kultur, var en motsvarande nukleär translokation av ABC och EMT regulatorer observerats. Figur 3 illustrerar effekten av marimastat, ett bredspektrum MMP-inhibitor, på EnMT processen av de odlade länderna i Centraleuropa in vitro nötkreatur. Figur 4 innefattar de yttre ögon fotografier av råttor efter cryoinjury följt av intrakameral injektion. Figur 5 visar immunfärgning av r på knappen hornhinnans som utfördes med användning av antikroppar mot ABC efter cryoinjury följt av intrakameral injektion. Den nukleära translokation av ABC observerades i PBS-gruppen och ökade signifikant i den bFGF-gruppen, vilket indikerar aktivering av Wnt / β-catenin signalering och EnMT process. Efter intrakameral injektion av bFGF följt av marimastat injektion, var nukleär färgning av ABC minskat, vilket tyder på EnMT hämmande effekten av marimastat.
Figur 1:. Faskontrast bilder av in vitro odlade östeuropeiska länderna nötkreatur Efter att ympas på odlingsplattan, bovin central- och östeuropeiska länderna ursprungligen verkade fibroblastliknande på dagarna 3 och 6. De blev mer sexkantiga vid uppnående av fullständig sammanflödet på dag 9. Skala bar = 50 | j, m. Representativa bilder av 3 replikat.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: immunfärgning av in vitro odlade östeuropeiska länderna nötkreatur under odlingen av nötkreaturs östeuropeiska länderna, kärntranslokation av ABC, snigel, och slug in vitro påvisades genom dag 14. ABC. Aktiv β-catenin. Skalstreck = 100 | j, m. Representativa bilder av 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Immunofärgning av odlade bovina länderna i Centraleuropa in vitro med eller utan marimastat vid olika cell confluence nivåer Immunfärgning demonerkoncentrerat att ABC, snigel, och slug var uppenbara i kärnan av nötkreatur östeuropeiska länderna med eller utan 10 nM av marimastat dag 3. Emellertid marimastat avsevärt minskat nukleär färgning av ABC, snigel, och snigel på dag 9 När nötkreatur östeuropeiska länderna blev helt sammanflytande. Skalstreck = 100 | j, m. Representativa bilder av 3 replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Externa ögon fotografier av råttor vid angivna tidpunkter efter cryoinjury Efter cryoinjury 3 dagar i följd, råttor utsattes för intrakameral injektion av 0,02 ml PBS eller 50 ng / ml bFGF dag 3. På dag 6, 0,02 ml 10 iM marimastat injicerades intrakameralt i bFGF / Mari grupp, medan PBS injicerades i den andra två groups (n = 9 i varje grupp). Externa fotografier öga visade nedsatt kornealödem efter bFGF injektion, medan marimastat ytterligare minskat kornealödem jämfört med bFGF enbart. N = 9 i varje grupp. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Immunfärgning av råtthornhinnan knappar immunfärgning av råtthornhinnan knappar som skördades på dag 9 visade liten nukleär färgning av ABC i PBS-gruppen. I bFGF gruppen fanns omfattande nukleär färgning av ABC, vilket avsevärt minskade i bFGF / Mari grupp. Skalstreck = 100 nm. Klicka här för att se en större version av this siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Länderna i Centraleuropa är kända för sin benägenhet att undergå EnMT under cellproliferation. Att utveckla strategier för att undertrycka EnMT processen för terapeutiska ändamål, är det nödvändigt med en grundlig förståelse av EnMT mekanismen. Vi beskrivit 2 modeller för att undersöka EnMT, nämligen bovint CEC in vitro odlingsmodell och rått hornhinneendotel cryoinjury modell. Våra resultat visade det EnMT processen i båda modellerna. Dessutom var EnMT-hämmande effekten av marimastat återges i båda modellerna, vilket tyder på att dessa 2 modeller dela samma mekanism.
Nötkreatur CEC in vitro-kultur-modellen erbjuder enkel manipulation. Dessutom, jämfört med den humana eller primat CEC in vitro odlingsmodeller som användes i tidigare studier 17,18, bovina ögon är större och lättare att förvärva, och därmed har fler länderna i Centraleuropa tillgängliga. I vår studie har vi förvärvat de enukleerade ögon nötkreatur från en lokalt slakteri. På grund av de fres h typ av nötkreatur ögon, är det exakta antalet östeuropeiska länderna nötkreatur skördas föremål för variation på cirka 1 x 10 5 celler per öga. Däremot är antalet mänskliga östeuropeiska länderna i en normal hornhinna ca 3 x 10 5 per öga. Denna siffra är lägre i studien kvalitet hornhinnor och är ännu lägre i resthornhinnan fälgar efter transplantation. Manipulationer under skördeförfarande kommer att ytterligare minska antalet celler som erhållits. Dessutom kan central- och östeuropeiska länderna nötkreatur föröka sig och genomgå EnMT spontant; Därför är nötkreatur CEC in vitro-kultur-modellen användbar vid undersökning av EnMT mekanismen och screening EnMT hämmande kemikalier, såsom marimastat. Trots att det fortfarande oro artsrelaterade skillnader, till exempel den proliferativa kapaciteten hos länderna i Centraleuropa, visade våra resultat att den EnMT signaleringsvägen av bovint östeuropeiska länderna är liknande den av mänskliga östeuropeiska länderna, inklusive aktivering av Wnt / β-catenin 18,19.
tält "> Under isoleringen av bovint länderna i Centraleuropa, avskalning av Descemets membran är kritisk. I vissa bovina ögonen kan Descemets membranet ha tät vidhäftning med hornhinnans stroma, vilket leder till överdriven stromal vävnad på skalade Descemets membran. Vidare trypsinisering kan leda till frisättningen av stromakeratocyter som kan ändras till korneala fibroblaster, som påverkar cell renhet och därför de experimentella resultaten. i vår studie skalade vi Descemets membranet noggrant under ett mikroskop. för att ytterligare säkerställa cellrenhet, först odlade vi de skördade cellerna i en 6 cm skål tills cellsammanflytning. Endast när cellerna var hexagonal till formen var de som användes i ytterligare experiment.För att ytterligare underbygga resultaten av nötkreatur CEC in vitro-kultur modell använde vi råtta hornhinnans endotel cryoinjury modell som antagits i tidigare studier 20,21. Efter cryoinjury, rått länderna i Centraleuropa gick EnMT under regenerering, manifested av nukleär translokation av aktiv β-catenin, vilket tyder på att aktivering av Wnt / β-catenin signalering konserverad mellan olika arter under CEC förnyelse. Dessutom är denna modell användbar vid undersökning av funktionen av länderna i Centraleuropa, eftersom låg CEC funktion leder till uppenbar kornealödem. I kombination med annan utrustning, såsom ultraljud biomikroskop, främre segmentet optisk koherens tomografi och konfokalmikroskopi kan hornhinnans tjocklek kvantitativt utvärderas och därmed återspegla CEC funktion.
För att stimulera förnyelse av länderna i Centraleuropa och undertrycka EnMT efter sårläkning, vi administrerade intrakamerala injektioner av bFGF följt av marimastat injektion. Behandlingen minskade signifikant graden av korneal ödem. Tidigare studier har använt den lokala appliceringen av CEC tillväxtstimulerande medel, såsom ROCK-inhibitor, och EnMT-undertryckande medel, såsom Notch inhibitor 21,22. Men penetrationen av läkemedel i CEC låger begränsas av hornhinnans epitel och stroma, som kan påverka behandlingens effektivitet 23. I kontrast till topisk applicering, möjliggör intrakameral injektion direkt tillgång på hornhinnans endotel genom att införa läkemedel direkt in i den främre kammaren. Därför kan den tillväxtstimulerande och EnMT-hämmande effekten av kemikalier bedömas unbiasedly följande cryoinjury. I vår studie, utförde vi främre kammaren paracentes för att sänka det intraokulära trycket innan intrakameral injektion. Utan paracentesis, orsakar en abrupt ökning av intraokulärt tryck kornealödem eller till och med framfall av iris genom nålen-tarmkanalen. Försiktigt komprimera vägarna under nålen tillbakadragande hjälpmedel i försegla såret och förhindra intraokulära infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
- Maurice, D. M. The location of the fluid pump in the cornea. J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).
- Joyce, N.
- Morishige, N., Sonoda, K. H. Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies. Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).
- Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report. Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).
- Wilson, S. E., Lloyd, S. A. Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).
- Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).
- Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).
- Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. Growth of human corneal endothelial cells in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).
- Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).
- Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors. Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).
- Ko, M. K., Kay, E. P. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).
- Lee, H. T., Kay, E. P. FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells. Mol Vis. 9, 624-634 (2003).
- Pipparelli, A., et al. ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells. PloS one. 8 (4), e62095 (2013).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Jakobiec, F. A., Bhat, P. Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins. Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).
- Okumura, N., et al. Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).
- Okumura, N., et al. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).
- Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions. J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).
- Ho, W. T., et al. Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).
- Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).
- Li, C., et al. Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).
- Okumura, N., et al. The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).
- Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics. Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).
