In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Summary

Una cultura primarie di cellule endoteliali corneali bovini è stato utilizzato per studiare il meccanismo di transizione corneale endoteliale-mesenchimale. Inoltre, un corneale endotelio modello cryoinjury ratto è stato utilizzato per dimostrare corneale endoteliale transizione-mesenchimali in vivo.

Protocol

Tutte le procedure seguite in questo studio accordato con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali del National Taiwan University Hospital.

1. Isolamento, coltura primaria Preparazione e Immunocolorazione bovina CEC

1. Acquisire gli occhi bovino fresco da un mattatoio locale.
2. Disinfettare gli occhi in un 10% w / v soluzione di iodio-povidone per 3 min. Lavare con una soluzione tampone fosfato (PBS).
3. Raccogliere il pulsante corneale con un bisturi e forbici in condizioni sterili. Membrana Peel della Descemet con una pinza sotto un microscopio da dissezione (si noti che in questo studio, gli occhi bovini sono stati enucleati da un mattatoio locale, pertanto, la prima procedura di studio era la disinfezione degli occhi preenucleated in laboratorio).
4. Incubare la membrana di Descemet in 1 ml di provaPSIN a 37 ° C per 30 min. Raccogliere i PEC bovine per centrifugazione a 112 g per 5 min. Risospendere le cellule in 1 ml di integrazioni media epiteliale ormonale (SHEM) contenente volumi uguali di HEPES-buffered medio di Dulbecco Modified Eagle e medie F12 di Ham, integrato con 5% di siero fetale bovino, 0,5% dimetilsolfossido, 2 ng / ml di epidermico umano fattore di crescita, 5 mg / ml di insulina, 5 mg / ml di transferrina, 5 ng / ml di selenio, 1 nmol / l di tossina colerica, 50 mg / ml di gentamicina, e 1,25 mg / ml di amfotericina B.
5. Seme le cellule (circa 1 x 10 ⁵ cellule per occhio) in un piatto di 6 centimetri. loro cultura nel SHEM. Incubare il piatto a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO ₂ in aria. Modificare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
6. Quando le cellule raggiungono confluenza, lavarli in PBS e incubare in 1 ml di tripsina a 37 ° C per 5 min. li Raccogliere per centrifugazione a 112 xg per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 1 ml di SHEM. Contare le cellule in un emocitometro. Seme le cellule su vetrini di copertura ad una densità di 1 x 10 ⁴ per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti, e la cultura nelle cellule del SHEM. Per indagare l'effetto EnMT di soppressione di Marimastat, incubare le cellule in SHEM con 10 micron di Marimastat aggiunti nel terreno di coltura, e cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni.

Fissare le cellule in un punto di tempo indicato con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min. Blocco con 10% di sieroalbumina bovina per 30 min.

Incubare le cellule con anticorpi primari contro attivo beta-catenina (ABC), lumaca, e lumaca notte a 4 ° C. La diluizione degli anticorpi primari utilizzati è di 1: 200. Gli anticorpi sono diluiti in diluente anticorpale composto di 10 mM PBS, 1% w / v di BSA e 0,09% w / v di sodio azide.

Lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e incubare lam con l'anticorpo Alexa Fluor-coniugato secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora.

Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo, lavare le cellule due volte con PBS per 15 min, e montarli con anti-sbiadimento soluzione di montaggio.

Ottenere immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 405 e 488 nm utilizzando un scansione laser microscopio confocale con 20X ingrandimento dell'obiettivo.

Modello 2. Rat endotelio corneale Cryoinjury e Intracameral Iniezione

1. Anestetizzare 12 settimane di età ratti maschi Sprague-Dawley con iniezioni intramuscolari di 2% xilazina (5,6 mg / kg) e tiletamina più zolazepam (18 mg / kg). Delicatamente pizzicare la pelle degli animali per confermare il corretto anestesia in assenza di contrazioni della pelle.
2. Instillare una goccia di 0,5% proparacaina cloridrato per l'occhio destro di ogni ratto per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre. Infonderetetraciclina unguento per l'occhio sinistro per prevenire la secchezza della cornea.
3. Raffreddare una sonda in acciaio inossidabile (diametro = 3 mm) in azoto liquido. Applicare la sonda in acciaio inossidabile per la cornea centrale dell'occhio destro per 30 sec. Spesso infondere PBS all'occhio destro durante la procedura per prevenire la secchezza della cornea.
4. Instillare 0,1% e dello 0,3% atropina gentamicina solfato subito dopo cryoinjury e una volta al giorno per alleviare il dolore oculare derivante da ciliare spasmo e per prevenire l'infezione.
   1. Dopo la procedura, mantenere i ratti calda usando una lampada di calore, e osservare il loro recupero ogni 15 min dopo l'anestesia fino a quando non riprendere il controllo del motore. Inoltre, applicare tetraciclina pomata per l'occhio destro per prevenire la secchezza della cornea durante il periodo di recupero.
5. Ripetere la cryoinjury corneale per 3 giorni consecutivi.
6. Per fornire Marimastat o bFGF nella camera anteriore degli occhi ratto, anestetizzare i topi come descritto in precedenza. Instillare una gocciadel 0,5% proparacaina cloridrato in l'occhio destro per ridurre al minimo dolore agli occhi e lo sbattere delle palpebre.
7. Irrigare la superficie oculare con PBS sterile. Eseguire paracentesi camera anteriore sotto un microscopio operatorio inserendo un ago 30 G attaccato ad una siringa da 1 ml a cornea chiara paralimbal in un piano sopra e parallela alla dell'iride.
8. Girare l'ago smusso, e un po 'deprimono la ferita corneale per drenare un po' di umore acqueo e ridurre la pressione intraoculare. Iniettare 0,02 ml del farmaco intracamerally. comprimere delicatamente il tratto ago con una punta di cotone durante il ritiro dell'ago.
9. Fotografare l'occhio esterno in un punto di tempo indicato sotto il microscopio operatorio.

3. La raccolta Rat bottone corneale e Immunocolorazione

1. Per eutanasia i topi, metterli in una camera di eutanasia e di infondere il 100% di CO ₂ ad un tasso di riempimento del 10-30% del volume della camera per minuto. Mantenere CO ₂ di infusione per unulteriore minuto dopo la mancanza di respiro e colore degli occhi sbiaditi.
2. Penetrare l'occhio ratto a limbus con una lama affilata. Tagliare le cornee con le forbici corneali lungo il limbus. Appiattire le cornee di una diapositiva. Fai incisioni radiali supplementari se le cornee rannicchiarsi.
3. Fissare le cornee con 250 ml di paraformaldeide al 4%, pH 7,4, per 30 min a temperatura ambiente. Permeabilize con 250 ml di 0,5% Triton X-100 per 5 min, e bloccare con il 10% di sieroalbumina bovina per 30 min.
4. Incubare le cornee con anticorpi primari contro ABC notte a 4 ° C con una diluizione di 1: 200 nel diluente. Lavare le cornee due volte con PBS per 15 min, e incubare con l'anticorpo secondario (1: 100 nel diluente) a temperatura ambiente per 1 ora. Controcolorare nucleo della cellula coprendo le cellule con 2 ug / ml di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo, e lavare le cellule due volte con PBS per 15 min.
5. Montare le cornee di anti-sbiadimento soluzione di montaggio. Obtain le immagini di immunofluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione di 405 e 561 nm con un microscopio confocale a scansione laser a 20X di ingrandimento obiettivo.

Representative Results

Dopo l'isolamento di PEC bovina, le cellule sono state coltivate in vitro. La Figura 1 presenta le immagini contrasto di fase dei PEC bovina. La forma esagonale delle cellule a confluenza indicato che le cellule non sono stati contaminati da corneale fibroblasti stromali durante l'isolamento delle cellule. La Figura 2 illustra l'immunocolorazione che è stata eseguita utilizzando anticorpi contro ABC, lumaca, e in blocco in un punto di tempo indicato. Oltre a modificazioni fenotipiche nella coltura in vitro, è stato osservato un corrispondente traslocazione nucleare di regolatori ABC e EMT. La figura 3 illustra l'effetto di Marimastat, un inibitore di MMP ampio spettro, sul processo EnMT dei PEC bovine coltivate in vitro. Figura 4 comprende le fotografie occhio esterno di ratti dopo cryoinjury seguita da iniezione intracameral. Figura 5 mostra l'immunocolorazione della r a pulsante corneale che è stata effettuata utilizzando anticorpi contro ABC dopo cryoinjury seguito da iniezione intracameral. La traslocazione nucleare di ABC è stato osservato nel gruppo PBS ed è stata significativamente aumentata nel gruppo bFGF, che indica l'attivazione della segnalazione / β-catenina Wnt e il processo EnMT. Dopo l'iniezione di intracameral bFGF seguito da iniezione Marimastat, la colorazione nucleare di ABC è stata diminuita, suggerendo l'effetto EnMT inibizione di Marimastat.

Figura 1:. Immagini a contrasto di fase in vitro Dopo essere stato seminato sulla piastra di coltura, PEC bovina è apparso inizialmente CEC bovini colture di fibroblasti-come nei giorni 3 e 6. Si è diventato più esagonale al raggiungimento di confluenza completo il giorno 9. Barra di scala = 50 micron. Immagini rappresentative della 3 repliche.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immunocolorazione di in vitro CEC bovini coltivate Durante la coltura in vitro dei bovini CEC, la traslocazione nucleare di ABC, lumaca, e lumaca è stato rilevato attraverso giorno 14. ABC:. Attivi β-catenina. Barra di scala = 100 micron. Immagini rappresentative della 3 repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Immunocolorazione di CEC bovini coltivate in vitro con o senza Marimastat a diversi livelli di confluenza delle cellule immunocolorazione demonitrato che ABC, lumaca, e Slug erano evidenti nel nucleo delle CEC bovine con o senza 10 micron di Marimastat il giorno 3. Tuttavia, Marimastat ridotto in modo significativo la colorazione nucleare di ABC, lumaca, e lumaca il giorno 9 quando il CEC bovine è divenuta pienamente confluenti. Barra di scala = 100 micron. Immagini rappresentative della 3 repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4:. Fotografie occhio esterno di ratti a tempi indicati dopo cryoinjury seguito cryoinjury per 3 giorni consecutivi, i ratti sono stati sottoposti ad iniezione intracameral di 0,02 ml di PBS o 50 ng / ml bFGF il giorno 3. Il giorno 6, 0,02 ml di 10 mM Marimastat stato iniettato intracamerally nel gruppo bFGF / Mari, considerando PBS è stato iniettato nell'altro 2 Groups (n = 9 in ciascun gruppo). Fotografie occhio esterno rivelato ridotti edema corneale dopo l'iniezione bFGF, che Marimastat ulteriormente ridotto edema corneale confrontato con bFGF sola. N = 9 in ogni gruppo. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5:. Immunocolorazione di pulsanti ratto corneale Immunocolorazione dei pulsanti corneali ratto che sono state raccolte il giorno 9 rivelato poco colorazione nucleare della ABC nel gruppo PBS. Nel gruppo bFGF, non vi era abbondante colorazione nucleare di ABC, che è stato significativamente ridotto nel gruppo bFGF / Mari. Barra di scala = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di This figura.

Discussion

PEC sono noti per la loro propensione a subire EnMT durante la proliferazione cellulare. Sviluppare strategie per sopprimere il processo EnMT per scopi terapeutici, una conoscenza approfondita del meccanismo EnMT è necessario. Abbiamo descritto 2 modelli di indagare EnMT, vale a dire la CEC bovina nel modello di coltura in vitro e nel ratto corneale endoteliale modello cryoinjury. I nostri risultati hanno dimostrato il processo EnMT in entrambi i modelli. Inoltre, l'effetto di soppressione del EnMT Marimastat stato riprodotto in entrambi i modelli, suggerendo che questi 2 modelli condividono lo stesso meccanismo.

Il CEC bovina nel modello di coltura in vitro offre facilità di manipolazione. Inoltre, rispetto al CEC umano o primate modelli di coltura in vitro impiegati in studi precedenti ^17,18, occhi bovini sono più grandi e più facili da acquisire, e hanno quindi più CEC disponibili. Nel nostro studio, abbiamo acquisito gli occhi bovini enucleati da un mattatoio locale. A causa dei fres h natura degli occhi bovini, il numero esatto di CEC bovina raccolto è soggetto a variazioni, a circa 1 x 10 ⁵ cellule per occhio. Per contro, il numero di CEC umani in una cornea normale è di circa 3 x 10 ⁵ per occhio. Questo numero è più basso in cornee studio-grade ed è ancora più bassa in cerchi corneali residue dopo il trapianto. Le manipolazioni durante la procedura di raccolta ridurrà ulteriormente il numero di cellule ottenute. Inoltre, CEC bovini possono proliferare e subire EnMT spontaneamente; di conseguenza, la CEC bovina nel modello di coltura in vitro è utile nelle indagini il meccanismo EnMT e lo screening di sostanze chimiche EnMT-soppressione, come Marimastat. Anche se rimane la preoccupazione per quanto riguarda le differenze specie-correlati, come la capacità proliferativa delle CEC, i nostri risultati hanno dimostrato che la via di segnalazione EnMT del CEC bovina è simile a quella della CEC umani, tra cui l'attivazione di Wnt / β-catenina ^18,19.

tenda "> Durante l'isolamento di PEC bovina, peeling membrana di Descemet è fondamentale. In alcuni occhi bovini, la membrana di Descemet può avere l'adesione stretto con lo stroma corneale, portando ad un eccessivo tessuto stromale sulla membrana pelati di Descemet. Ulteriori tripsinizzazione può portare a il rilascio di cheratociti stromali che si trasformano in fibroblasti corneali, che influenzano la purezza delle cellule e quindi i risultati sperimentali. nel nostro studio, abbiamo pelati membrana di Descemet accuratamente sotto un microscopio. Per assicurare ulteriormente la purezza delle cellule, abbiamo prima coltura le cellule raccolte in un 6 cm piatto fino confluenza delle cellule. Solo quando le cellule erano di forma esagonale erano utilizzati in ulteriori esperimenti.

Per confermare ulteriormente i risultati del CEC bovina nel modello di coltura in vitro, abbiamo usato il corneale endotelio modello cryoinjury ratto adottato in studi precedenti ^20,21. Dopo cryoinjury, le CEC di ratto sottoposti EnMT durante la rigenerazione, manifested dalla traslocazione nucleare di attivo β-catenina, che indica che l'attivazione di Wnt segnalazione / β-catenina è conservata tra le specie durante la rigenerazione CEC. Inoltre, questo modello è utile nelle indagini la funzione di CEC perché bassa funzione CEC porta alla evidente edema corneale. In combinazione con altre apparecchiature, come biomicroscopio ultrasuoni, segmento anteriore tomografia a coerenza ottica e la microscopia confocale, spessore corneale può essere valutata quantitativamente e riflettere così la funzione CEC.

Per stimolare la rigenerazione della PEC e sopprimere EnMT dopo la guarigione della ferita, abbiamo somministrato iniezioni intracameral di bFGF seguiti da iniezione Marimastat. Il trattamento ha ridotto significativamente il grado di edema corneale. Studi precedenti hanno utilizzato l'applicazione topica di agenti stimolatori della crescita CEC, come inibitore ROCK e agenti EnMT-soppressione, come inibitore Notch ^21,22. Tuttavia, la penetrazione dei farmaci nel CEC trovavaer è limitata dalla dell'epitelio corneale e stroma, che possono influenzare l'efficacia del trattamento ^23. In contrasto con l'applicazione topica, l'iniezione intracameral consente l'accesso diretto alla endotelio corneale introducendo farmaci direttamente nella camera anteriore. Pertanto, l'effetto di crescita stimolante e EnMT di soppressione di sostanze chimiche può essere valutata unbiasedly seguente cryoinjury. Nel nostro studio, abbiamo eseguito paracentesi camera anteriore per abbassare la pressione intraoculare prima dell'iniezione intracameral. Senza paracentesi, un brusco aumento della pressione intraoculare provoca edema corneale o addirittura prolasso dell'iride attraverso il tratto ago. comprimere delicatamente il tratto durante aiuti di astinenza ago nel sigillare la ferita e prevenire l'infezione intraoculare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug