In vitro og in vivo modeller til at studere hornhindeendothel-mesenkymale Transition

Summary

En primær kultur af bovine hornhindeendothelceller blev anvendt til undersøgelse af mekanismen af ​​hornhindeendothel-mesenkymal overgang. Endvidere blev en rotte hornhindeendothel kryobeskadigelse model, der anvendes til at demonstrere hornhindeendothel-mesenchymal overgang in vivo.

Protocol

Alle procedurer, der følges i denne undersøgelse indrømmes med foreningen for Forskning i Vision og Oftalmologi Erklæring for anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National Taiwan University Hospital.

1. Isolation, Primary Kultur Forberedelse og immunfarvning af Bovin CØE

1. Anskaf friske bovine øjne fra et lokalt slagteri.
2. Desinficere øjnene i en 10% vægt / volumen povidon-iod-opløsning i 3 minutter. Vaske dem med phosphatbufret saltvand (PBS) opløsning.
3. Høst hornhindens knap med en skalpel og en saks under sterile betingelser. Skræl Descemet membran med pincet under et dissektionsmikroskop (bemærk, at i denne undersøgelse blev de bovine øjne enukleeres af en lokalt slagteri, og derfor den første undersøgelse procedure var desinficering af de preenucleated øjne i laboratoriet).
4. Inkubér Descemet membran i 1 ml prøvepsin ved 37 ° C i 30 minutter. Saml de bovine central- og østeuropæiske lande ved centrifugering ved 112 xg i 5 min. Resuspender cellerne i 1 ml suppleret hormonal epitel medium (SHEM) indeholdende lige volumener af HEPES-pufret Dulbeccos modificerede Eagle-medium og Hams F12-medium, suppleret med 5% føtalt bovint serum, 0,5% dimethylsulfoxid, 2 ng / ml human epidermal vækstfaktor, 5 mg / ml insulin, 5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml selen, 1 nmol / l koleratoksin, 50 mg / ml gentamicin, og 1,25 mg / ml amphotericin B.
5. Pode celler (ca. 1 x 10 ⁵ celler pr øjet) i en 6 cm skål. Kultur dem i SHEM. Inkubér fadet ved 37 ° C i en atmosfære af 5% _CO2 i luft. Skift dyrkningsmediet hver 3. dag.
6. Når cellerne når konfluens, vaske dem i PBS og inkuberes dem i 1 ml trypsin ved 37 ° C i 5 min. Samle dem ved centrifugering ved 112 xg i 5 min. Re-suspendere cellepelleten i 1 ml af SHEM. Tæl cellerne i et hæmocytometer. Frø cellerne på dækslides ved en densitet på 1 x 10 ⁴ pr brønd i en plade med 24 brønde, og dyrke cellerne i SHEM. Til undersøgelse af EnMT-undertrykkende virkning af marimastat, inkuberes cellerne i SHEM med 10 uM af marimastat tilsat til dyrkningsmediet, og ændre dyrkningsmediet hver 3. dag.

Fikseres cellerne på en angivet tidspunkt med 250 pi 4% paraformaldehyd, pH 7,4, i 30 minutter ved stuetemperatur. Permeabilisere med 250 pi 0,5% Triton X-100 i 5 minutter. Blok med 10% bovint serumalbumin i 30 minutter.

Inkubér cellerne med primære antistoffer mod aktiv beta-catenin (ABC), snegl, og slug natten over ved 4 ° C. Fortyndingen af ​​de primære antistoffer anvendt er 1: 200. Antistofferne fortyndes i antistoffortyndingsmiddel sammensat af 10 mM PBS, 1% vægt / vol bovint serumalbumin og 0,09% vægt / volumen natriumazid.

Vask cellerne to gange med PBS i 15 min, og inkuberesm med Alexa Fluor-konjugeret sekundært antistof (1: 100 i antistoffortyndingsmiddel) ved stuetemperatur i 1 time.

Kontrastfarve cellekernen ved at dække cellerne med 2 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol, vaskes cellerne to gange med PBS i 15 min, og montere dem med anti-fading monterings opløsning.

Opnå immunfluorescerende billeder på excitationsbølgelængder på 405 og 488 nm ved hjælp af en laser konfokalt mikroskop med 20x objektiv forstørrelse.

2. Rat hornhindeendotelet kryobeskadigelse Model og intrakameral Injection

1. Bedøver 12 uger gamle Sprague-Dawley hanrotter med intramuskulære injektioner af 2% xylazin (5,6 mg / kg) og tiletamin plus zolazepam (18 mg / kg). Knib forsigtigt huden af ​​dyrene for at bekræfte korrekt anæstesi i fravær af huden trækninger.
2. Instill en dråbe 0,5% proparacainhydrochlorid til det højre øje på hver rotte for at minimere øjensmerter og øjnene lukkes. indgydetetracyclin salve til venstre øje for at forhindre corneal tørhed.
3. Afkøl en rustfri stål probe (diameter = 3 mm) i flydende nitrogen. Påfør stål probe rustfrit til den centrale hornhinde det højre øje i 30 sek. Ofte indgyde PBS til det højre øje under proceduren for at forhindre corneal tørhed.
4. Indgyde 0,1% atropin og 0,3% gentamicinsulfat umiddelbart efter kryobeskadigelse og en gang dagligt til at lindre okulær smerter som følge af ciliær spasmer og for at forebygge infektion.
   1. Efter indgrebet, holde rotterne varme under anvendelse af en varmelampe, og observere deres helbredelse hver 15 min efter anæstesi, indtil de genvinder motorstyring. Derudover gælder tetracyclin salve til det højre øje til at forhindre hornhindens tørhed under restitutionsperioden.
5. Gentag hornhindens kryobeskadigelse i 3 på hinanden følgende dage.
6. Til afgivelse marimastat eller bFGF i forkammeret rottens øjne, bedøver rotterne som tidligere beskrevet. Indgyde en dråbe0,5% proparacainhydrochlorid i det højre øje at minimere smerter i øjet og at øjnene lukkes.
7. Skyl den okulære overflade med sterilt PBS. Udfør forkammeret paracentesis under et operationsmikroskop ved at indsætte en 30 G nål fastgjort til en 1 ml sprøjte på paralimbal klare hornhinde i et plan over og parallelt med iris.
8. Drej nåleaffasningen op, og lidt nedtrykke hornhindesåret at dræne nogle vandige humor og reducere det intraokulære tryk. Injicer 0,02 ml af lægemidlet intracameralt. komprimere forsigtigt nålen tarmkanalen med en vatpind under nålen tilbagetrækning.
9. Fotografere ydre øje på en angivet tidspunkt under operationsmikroskopet.

3. Høst Rat Hornhinde Button og Immunfarvning

1. For at aflive rotterne, placere dem i en eutanasi kammer og indgyde _100% CO2 ved en fill rate på 10-30% af kammeret volumen per minut. Opretholde CO ₂ infusion for enyderligere minut efter manglende respiration og falmede øjenfarve.
2. Trænge ind i rotte øjet ved limbus med en skarp kniv. Skær hornhinder med hornhinde saks langs limbus. Glat hornhinder på et dias. Foretag yderligere radiale indsnit hvis hornhinder krølle op.
3. Fastgør hornhinderne med 250 pi 4% paraformaldehyd, pH 7,4, i 30 minutter ved stuetemperatur. Permeabilisere med 250 pi 0,5% Triton X-100 i 5 minutter, og blokere med 10% bovint serumalbumin i 30 minutter.
4. Inkuber hornhinderne med primære antistoffer mod ABC natten over ved 4 ° C med en fortynding på 1: 200 i antistoffortyndingsmiddel. Vask hornhinder to gange med PBS i 15 min, og inkubere dem med det sekundære antistof (1: 100 i antistoffortyndingsmiddel) ved stuetemperatur i 1 time. Kontrastfarve cellekernen ved at dække cellerne med 2 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol, og vask af cellerne to gange med PBS i 15 min.
5. Monter hornhinder i anti-fading monteringsløsning. obtain de immunfluorescerende billeder med excitationsbølgelængder på 405 og 561 nm med en laser konfokalt mikroskop ved 20X objektiv forstørrelse.

Representative Results

Efter isoleringen af bovine CØE, blev cellerne dyrket in vitro. Figur 1 viser fasekontrast billeder af bovine CØE. Den sekskantede form af cellerne på konfluens indikerede, at cellerne ikke var forurenet af corneal stromal fibroblast under celleisolering. Figur 2 viser immunfarvning, der blev udført under anvendelse af antistoffer mod ABC, sneglen, og slug på en angivet tidspunkt. Bortset fra fænotypiske ændringer i in vitro kultur, blev der observeret en tilsvarende nuklear translokation af ABC og EMT regulatorer. Figur 3 illustrerer virkningen af marimastat, et bredspektret MMP-inhibitor, om EnMT processen af in vitro dyrkede bovine CØE. Figur 4 omfatter ydre øje fotografier af rotter efter kryobeskadigelse efterfulgt af intrakameral injektion. Figur 5 viser immunfarvning af r ved corneal knap, der blev udført under anvendelse af antistoffer mod ABC efter kryobeskadigelse efterfulgt af intrakameral injektion. Det nukleare translokation af ABC blev observeret i PBS koncernen og blev øget betydeligt i bFGF gruppen, hvilket indikerer aktivering af Wnt / β-catenin signalering og EnMT proces. Efter intrakameral injektion af bFGF efterfulgt af marimastat injektion blev nukleare farvning af ABC formindsket, hvilket tyder på EnMT-inhiberende virkning af marimastat.

Figur 1:. Fasekontrast billeder af in vitro dyrkede bovine CØE Efter at være seedet på kultur plade, den bovine centraleuropæiske lande oprindeligt optrådte fibroblastlignende på dag 3 og 6. De blev mere sekskantet efter at have nået komplet sammenløb på dag 9. Skala bar = 50 um. Repræsentative billeder af 3 replikater.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: immunfarvning af in vitro dyrkede bovine CØE under in vitro dyrkning af det bovine CØE, den nukleare translokation af ABC, sneglen, og slug blev påvist gennem dag 14. ABC:. Aktiv β-catenin. Scale bar = 100 um. Repræsentative billeder af 3 gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:. Immunfarvning af in vitro dyrkede bovine CØE med eller uden marimastat på forskellige celle Confluence niveauer Immunfarvning dæmonertreret, at ABC, sneglen, og slug var tydeligt i kernen af ​​de bovine CØE med eller uden 10 uM marimastat på dag 3. Dog marimastat reducerede signifikant nukleare farvning af ABC, sneglen, og slug på dag 9 Når bovine CØE blev fuldt sammenflydende. Scale bar = 100 um. Repræsentative billeder af 3 gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4:. Eksterne eye fotografier af rotter ved angivne tidspunkter efter kryobeskadigelse Efter kryobeskadigelse i 3 på hinanden følgende dage blev rotter underkastet intrakameral injektion af 0,02 ml PBS eller 50 ng / ml bFGF på dag 3. På dag 6, 0,02 ml 10 uM marimastat blev injiceret intracameralt i bFGF / Mari gruppe, mens PBS blev injiceret i den anden 2 Groups (n = 9 i hver gruppe). Eksterne øjet fotografier afslørede reduceret cornea ødem efter bFGF injektion, hvorimod marimastat yderligere reduceret cornea ødem sammenlignet med bFGF alene. N = 9 i hver gruppe. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5:. Immunfarvning af rotte hornhinde knapper immunfarvning af hornhindens knapper rotte, der blev høstet på dag 9 afslørede lidt nuklear farvning af ABC i PBS-koncernen. I bFGF gruppen, der var omfattende nukleare farvning af ABC, som i væsentlig grad blev reduceret i den bFGF / Mari gruppe. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større udgave af this figur.

Discussion

CØE er kendt for deres tilbøjelighed til at undergå EnMT under celleproliferation. At udvikle strategier for at undertrykke EnMT processen til terapeutiske formål, en grundig forståelse af EnMT mekanisme er nødvendig. Vi beskrev 2 modeller til at undersøge EnMT, nemlig den bovine CEC in vitro kultur model og rotte hornhindeendothel kryobeskadigelse model. Vores resultater viste den EnMT processen i begge modeller. Endvidere blev EnMT-undertrykkende virkning af marimastat gengivet i begge modeller, antyder, at disse 2 modeller deler den samme mekanisme.

Den bovine CEC in vitro kultur model tilbyder nem manipulation. I forhold til den humane eller primat CEC in vitro-dyrkning anvendte modeller i tidligere undersøgelser ^17,18, bovine øjne er større og lettere at erhverve, og således har flere CØE rådighed. I vores undersøgelse, købte vi de tømte bovine øjne fra et lokalt slagteri. På grund af de fres h arten af de bovine øjne, det nøjagtige antal kvæg CØE høstet er genstand for variation, med ca. 1 x 10 ⁵ celler pr øjet. Derimod er antallet af humane CØE i en normal hornhinde er ca. 3 x 10 ⁵ pr øje. Dette tal er lavere i studie-grade hornhinder og endnu lavere i resterende hornhinde fælge efter transplantation. Manipulationer under proceduren høst vil yderligere reducere antallet af celler opnået. Desuden kan kvæg CØE formere og gennemgå EnMT spontant; derfor, det bovine CEC in vitro kultur model er anvendelig til at undersøge EnMT mekanismen og screening EnMT-undertrykkende kemikalier, såsom marimastat. Selv om der stadig bekymring arts-relaterede forskelle, såsom proliferative kapacitet CØE, vores resultater viste, at EnMT signalvejen af bovin CØE ligner den menneskelige CØE, herunder aktivering af Wnt / β-catenin ^18,19.

telt "> Under isoleringen af ​​bovine CØE, skrælning af Descemet membran er kritisk. I nogle bovine øjnene, kan det Descemet membran har tæt klæbning med hornhindens stroma, hvilket fører til overdreven stromavæv på skrællede Descemet membran. Yderligere trypsinisering kan føre til frigivelsen af ​​stromakeratocytter der omdanner i corneale fibroblaster, som påvirker celle renhed og derfor de eksperimentelle resultater. i vores undersøgelse, vi flåede den Descemet membran omhyggeligt under et mikroskop. for yderligere at sikre celle renhed, vi først dyrket de høstede celler i en 6 cm skål indtil celle konfluens. Kun når cellerne var syvkantede blev de brugt i yderligere forsøg.

For yderligere at underbygge resultaterne af kvæg CEC in vitro kultur model, vi brugte rotten hornhindeendotelet kryobeskadigelse model vedtaget i tidligere undersøgelser ^20,21. Efter kryobeskadigelse, rotte CØE undergik EnMT under regenereringen, manifetake place af den nukleare translokation af aktiv β-catenin, hvilket indikerer, at aktivering af Wnt / β-catenin signalering konserveret blandt arter under CEC regenerering. Desuden er en god model til undersøgelse af funktionen af ​​CØE fordi lav CEC-funktionen fører til indlysende hornhindeødem. Kombineret med andre udstyr, såsom ultralyd biomikroskop, forreste segment optisk kohærens tomografi, og konfokal mikroskopi, kan hornhindetykkelse kvantitativt evalueres og afspejler således CEC-funktionen.

For at stimulere revitalisering af central- og østeuropæiske lande og undertrykke EnMT efter sårheling, vi administrerede intrakameral injektioner af bFGF efterfulgt af marimastat injektion. Behandlingen reducerede signifikant graden af ​​cornea ødem. Tidligere undersøgelser har anvendt den topiske anvendelse af CEC vækststimulerende midler, såsom ROCK inhibitor og EnMT-undertrykkende midler, såsom Notch inhibitor ^21,22. Men indtrængningen af ​​lægemidler ind CEC låER er begrænset af hornhindens epitel og stroma, som kan påvirke behandlingseffekt ^23. I modsætning til topisk anvendelse, intrakameral injektion muliggør direkte adgang til hornhindeendotelet ved at indføre lægemidler direkte ind i det forreste kammer. Derfor kan den vækststimulerende og EnMT-hæmmende effekt af kemikalier vurderes unbiasedly efter kryobeskadigelse. I vores undersøgelse, udførte vi forkammeret paracentesis for at sænke det intraokulære tryk inden intrakameral injektion. Uden paracentese, en brat stigning i intraokulært tryk forårsager cornea ødem eller endda prolaps af iris gennem nålen tarmkanalen. Forsigtigt komprimering af tarmkanalen under nålen tilbagetrækning hjælpemidler i forsegling såret og forebygge intraokulær infektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug