במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Summary

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

Protocol

כל הנהלים המיושמים במחקר זה עולה בקנה אחד עם האגודה לחקר משפט חזון עיניים עבור שימוש בבעלי חי עיניים וחזון המחקר אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש בבית החולים האוניברסיטאי הלאומיים בטייוואן.

1. ניתוק, הכנת התרבות ראשית ולאחר Immunostaining של השור CECs

1. רוכשת עיני שור טריות מטבחיים מקומי.
2. לחטא את העיניים בתוך 10% w / v פתרון povidone יוד במשך 3 דקות. לשטוף אותם עם תמיסת מלח פוספט שנאגר (PBS).
3. קציר את הכפתור הקרני עם אזמל ומספריים בתנאים סטריליים. מקלף את הממברנה של Descemet עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח (לציין כי במחקר זה, בעיני השור היו enucleated ידי מטבחיים מקומי, ולכן הליך המחקר הראשון היה חיטוי בעיני preenucleated במעבדה).
4. דגירה הממברנה של Descemet ב 1 מ"ל של לנסותpsin על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אסוף את CECs שור על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Resuspend תאי 1 מיליליטר של מדיום אפיתל הורמונלי השלים (שם) המכיל כמויות שווות של מדיום הנשר HEPES שנאגר השונה של Dulbecco והבינוני F12 של חם, בתוספת 5% בסרום שור עוברי, sulfoxide דימתיל 0.5%, 2 ng / ml של אפידרמיס אדם גורם הגדילה, 5 מ"ג / מ"ל ​​של אינסולין, 5 מ"ג / מ"ל ​​של transferrin, 5 ng / ml של סלניום, 1 nmol / L של רעלן הכולרה, 50 מ"ג / מ"ל ​​של גנטמיצין, ו -1.25 מ"ג / מ"ל ​​של B. amphotericin
5. זרעים תאים (כ 1 x 10 ⁵ תאים לכל עין) לתוך צלחת 6 ס"מ. תרבות אותם שם. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אווירה של 5% CO ₂ באוויר. שינוי התרבות בינוני כל 3 ימים.
6. כאשר התאים מגיעים למפגש, לשטוף אותם PBS דגירה אותם ב 1 מ"ל של טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. אסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 112 XG במשך 5 דקות. Re- להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל של שם טוב. ספירת התאים ב hemocytometer. זרעים התאים בשקופיות כיסוי בצפיפות של 1 x 10 ⁴ לכל היטב צלחת 24 גם, והתרבות התאים שם טוב. על חקירת השפעת EnMT-הדיכוי של marimastat, דגירת התאים שם טוב עם 10 מיקרומטר של marimastat הוסיפו לתוך מדיום התרבות, ולשנות את מדיום התרבות כל 3 ימים.

תקן את התאים בנקודת זמן מצוינת עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות. חסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.

דגירת התאים עם נוגדנים ראשוניים נגד-קטנין ביתא הפעיל (ABC), חילזון, חילזון הלילה ב 4 ° C.. הדילול של הנוגדנים העיקריים בשימוש הוא 1: 200. הנוגדנים הם מדולל diluent נוגדן מורכב של 10 מ"מ PBS, 1% w / v אלבומין בסרום שור, ו 0.09% w / v אזיד הנתרן.

שוטפים את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירהמ 'עם נוגדנים משני מצומדות פלואוריד אלקסה (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.

Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי התאים עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמים עם PBS במשך 15 דקות, ו הר איתם נגד דהיית פתרון גובר.

להשיג תמונות immunofluorescent על אורכי גל עירור של 405 ו 488 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר עם 20X ההגדלה אובייקטיבי.

2. מודל עכברוש קרנית האנדותל Cryoinjury הזרקת Intracameral

1. להרדים 12 שבועות בן חולדות Sprague-Dawley זכר עם זריקה תוך שרירית של 2% xylazine (5.6 מ"ג / ק"ג) ו tiletamine בתוספת zolazepam (18 מ"ג / ק"ג). בעדינות לצבוט את העור של החיות כדי לאשר הרדמה תקינה בהעדר מתעוות עור.
2. להחדיר טיפה אחת של hydrochloride proparacaine 0.5% אל עינו הימנית של כל העכברים כדי למזער את הכאב העין ואת רפלקס מצמוץ. לְהַחדִירמשחת טטרציקלין לעין השמאל כדי למנוע יובש קרני.
3. מגניב בדיקת נירוסטה (קוטר = 3 מ"מ) בחנקן נוזלי. החלת את חללית הנירוסטה אל הקרנית המרכזית של עין ימין למשך 30 שניות. לעתים קרובות להנחיל PBS על עינו הימנית במהלך ההליך כדי למנוע יובש קרני.
4. להחדיר 0.1% אטרופין סולפט גנטמיצין 0.3% מייד לאחר cryoinjury ופעם יומי כדי להקל על כאב עיני נובע התכווצות ריסים ולמנוע זיהום.
   1. לאחר ההליך, לשמור על החולדות לחמם באמצעות מנורת חום, ולבחון החלים כל 15 דקות אחרי ההרדמה עד שהם להחזיר שליטה מוטורית. בנוסף, החל משח טטרציקלין לעין הזכות למנוע יובש קרני במהלך תקופת ההחלמה.
5. חזור על cryoinjury הקרנית במשך 3 ימים רצופים.
6. עבור אספקת marimastat או bFGF לתוך החדר הקדמי של עיני החולדה, להרדים החולדות כפי שתואר לעיל. להחדיר טיפה אחתשל hydrochloride proparacaine 0.5% אל תוך עינו הימנית כדי למזער את כאב עין ואת רפלקס המצמוץ.
7. להשקות את פני השטח של העין עם PBS סטרילית. בצע ניקור הלשכה הקדמית תחת מיקרוסקופ ההפעלה על ידי החדרת מחט 30 G מצורף מזרק 1 מ"ל על הקרנית ברור paralimbal במטוס מעל ובמקביל הקשתית.
8. סובבו את המחט שפוע למעלה, ומעט לדכא את הפצע בקרנית לנקז קצת הומור מימית ולהפחית את הלחץ התוך עיני. להזריק 0.02 מ"ל של התרופה intracamerally. בעדינות לדחוס את דרכי מחט עם קצה כותנה בזמן נסיגת המחט.
9. צלם את שלהוציא בנקודת זמן מצוינת מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.

3. קצירי העכברוש קרני לחצן ו Immunostaining

1. כדי להרדים את החולדות, למקם אותם בתא המתת חסד להשרות 100% CO ₂ בקצב מילוי של 10-30% מנפח התא לדקה. שמור עירוי CO ₂ עבורדקה נוספת אחרי חוסר נשימת צבע עיניים דהוי.
2. לחדור לעין עכברוש בבית לימבוס עם להב חד. חותך את הקרניות במספריים קרניים לאורך לימבוס. שטח את הקרניות בשקופית. ודא חתכים רדיאליים נוספים אם הקרניות להתכרבל.
3. תקן את קרניות עם 250 μl של paraformaldehyde 4%, pH 7.4, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עם 250 μl של 0.5% Triton X-100 במשך 5 דקות, ולחסום עם אלבומין בסרום שור 10% למשך 30 דקות.
4. דגירה קרנית עם נוגדנים ראשוניים נגד ABC הלילה ב 4 ° C עם דילול של 1: 200 ב diluent נוגדן. שטפו את קרניות פעמיים עם PBS במשך 15 דקות, דגירה אותם עם נוגדנים משני (1: 100 ב diluent נוגדן) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. Counterstain בגרעין התא על ידי כיסוי תאים עם 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 15 דקות.
5. הר הקרני בתמיסה נגד דהייה גוברת. אובטיין התמונות immunofluorescent באורכי גל עירור של 405 ו 561 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר ב 20X ההגדלה אובייקטיבי.

Representative Results

לאחר בידוד של CECs שור, התאים היו בתרבית במבחנה. איור 1 מציג את התמונות בניגוד שלב של CECs שור. צורת המשושה של התאים בנקודת המפגש ציינה כי התאים לא היו מזוהמים על ידי פיברובלסטים סטרומה הקרניים במהלך בידוד תא. איור 2 מתארים את immunostaining כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC, חילזון, חילזון בנקודת זמן מצוינת. מלבד שינויים פנוטיפי בתרבות במבחנה, טרנסלוקציה גרעין מקבילה של רגולטורי ABC ו- EMT נצפתה. איור 3 ממחיש את השפעת marimastat, מעכב MMP ספקטרום רחב, על תהליך EnMT של CECs שור במבחנה התרבותית. איור 4 כולל התצלומים שלהוציא של חולדות לאחר cryoinjury ואחריו הזרקה intracameral. איור 5 מראה את immunostaining של r ב כפתור קרני כי בוצע באמצעות נוגדנים נגד ABC לאחר cryoinjury ואחריו הזרקת intracameral. טרנסלוקציה הגרעין של ABC נצפתה בקבוצת PBS ו הוגדל משמעותית בקבוצת bFGF, המציין הפעלה של איתות Wnt / β-קטנין ותהליך EnMT. לאחר הזרקת intracameral של bFGF ואחריו הזרקת marimastat, מכתים הגרעין של ABC פחת, דבר המצביע על אפקט EnMT-העיכוב של marimastat.

איור 1:. בניגוד שלב תמונות של במבחנה CECs שור בתרבית לאחר זורעים על הצלחת התרבות, שור CECs בתחילה הופיע פיברובלסטים דמויי בימים 3 ו -6 הם הפכו משושה יותר בהגיעם מפגש מלא על סרגל קנה מידה יום 9. = 50 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: Immunostaining של CECs שור בתרבית במבחנה במהלך בתרבות חוץ גופית של שור CECs, טרנסלוקציה הגרעין של ABC, חילזון, חילזון זוהה באמצעות יום 14. ABC:. Β-קטנין פעיל. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. Immunostaining של CECs שור במבחנה התרבותית עם או בלי marimastat ברמות מפגש תאים שונות שדי Immunostainingtrated כי ABC, חילזון, חילזון ניכר בגרעין של CECs שור עם או בלי 10 מיקרומטר של marimastat ביום 3. עם זאת, marimastat מופחת המכתים הגרעיני משמעותי של ABC, חילזון, חילזון ביום 9 כאשר CECs שור הפך לחלוטין ומחובר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נציג תמונות של 3 חזרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4:. תמונות שלהוציא של חולדות בנקודות הזמן המצוין לאחר cryoinjury בעקבות cryoinjury במשך 3 ימים רצופים, חולדות היו נתונים הזרקת intracameral של 0.02 מ"ל של PBS או 50 ng / ml bFGF ביום 3. ביום 6, 0.02 מ"ל של 10 מיקרומטר marimastat הוזרק intracamerally בקבוצת bFGF / מארי, ואילו PBS הוזרק ב grou 2 אחריםנ.ב. (n = 9 בכל קבוצה). תמונות שלהוציא חשף מופחת בצקת בקרנית לאחר הזרקת bFGF, ואילו בצקת בקרנית מופחתת marimastat נוספת לעומת bFGF לבד. N = 9 בכל קבוצה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5:. Immunostaining כפתורי עכברוש קרני Immunostaining של כפתורים הקרניים העכברוש שנמסקו ביום 9 גילה מכתים גרעיני קטן של ABC בקבוצת PBS. בקבוצת bFGF, היה מכתים גרעיני נרחב של ABC, אשר הופחת משמעותית בקבוצת bFGF / מארי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של תיהדמות של.

Discussion

CECs ידוע נטייתן לעבור EnMT במהלך התפשטות תאים. כדי לפתח אסטרטגיות דיכוי תהליך EnMT למטרות טיפוליות, הבנה מעמיקה של מנגנון EnMT הכרחית. תיארנו 2 דגמים לחקור EnMT, כלומר CEC שור במודל תרבות במבחנה דגם cryoinjury האנדותל עכברוש הקרנית. התוצאות שלנו הוכיחו את תהליך EnMT בשני המודלים. יתר על כן, השפעת מדכאי EnMT של marimastat שוחזרה בשני המודלים, דבר המצביע על כך 2 דגמים אלה לשתף אותו המנגנון.

ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה מציעה הקלות של מניפולציה. בנוסף, בהשוואת CEC האדם או הפרימטים במודלי תרבות במבחנה מועסקות מחקרים קודמים ^17,18, עיני שור הם גדולים יותר, קלים יותר לרכוש, ולכן יש יותר CECs זמין. במחקר שלנו, רכשנו את עיני שור enucleated מ מטבחיים מקומי. בגלל fres הטבע h של העיניים שור, את המספר המדויק של CECs שור שנקטפו נתון לשינויים, בערך בשעה 1 x 10 ⁵ תאים לכל עין. לעומת זאת, מספר CECs אדם בתוך קרנית נורמלית הוא כ 3 x 10 ⁵ לכל עין. המספר הזה נמוך ב קרניות כיתת מחקר ואפילו קטן ב חישוקי קרנית הנותרת לאחר השתלה. מניפולציות במהלך הליך הקצירה תהיינה לצמצם עוד יותר את מספר התאים המתקבלים. יתר על כן, CECs שור יכול להתרבות ועוברים EnMT ספונטני; ולכן, ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה שימושית בחקירת מנגנון EnMT וסינון EnMT-דיכוי כימיקלים, כגון marimastat. למרות יש דאגה לגבי הבדלי מינים הקשורים, כגון יכולת השגשוג של CECs, התוצאות שלנו הראו כי מסלול איתות EnMT של שור CECs דומה לזה של CECs האדם, לרבות הפעלת Wnt / β-קטנין ^18,19.

אוהל "> במהלך הבידוד של שור CECs, קילוף הקרום של Descemet הוא קריטי. בחלק העיניים שור, הממברנה של Descemet עשויה להיות הדבקה חזקה עם stroma הקרני, מה שמוביל רקמת סטרומה מופרזת על הממברנה של קלופי Descemet. trypsinization נוספת עשויה להוביל שחרור keratocytes סטרומה כי להפוך פיברובלסטים קרני, אשר משפיע טוהר תא ולכן את תוצאות הניסוי. במחקר שלנו, אנו קלופים הממברנה של Descemet בזהירות תחת מיקרוסקופ. כדי להבטיח טוהר תא נוסף, אנחנו ראשוני תרבית התאים שנקטפו 6 צלחת סנטימטר עד מפגש תא. רק כאשר התאים היו משושה בכושר הייתה הם השתמשו בניסויים נוספים.

כדי להמשיך לבסס את הממצאים של ועדת הבחירות המרכזית שור במודל תרבות במבחנה, השתמשנו במודל cryoinjury האנדותל העכברוש הקרני אמץ במחקרים קודמים ^20,21. לאחר cryoinjury, את CECs העכברוש עבר EnMT במהלך רגנרציה, manifested ידי טרנסלוקציה הגרעין של β-קטנין פעיל, המציין כי הפעלת איתות Wnt / β-קטנין נשמרת בין מינים במהלך רגנרציה CEC. בנוסף, מודל זה שימושי בחקירת הפונקציה של CECs כי פונקצית CEC נמוכה מובילה בצקת בקרנית ברורה. בשילוב עם ציוד אחר, כגון biomicroscope אולטרסאונד, טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית מקטע קדמי, וכן במיקרוסקופ confocal, עובי הקרנית ניתן להעריך כמותית ובכך לשקף פונקציה CEC.

כדי לעורר את ההתחדשות של CECs ולדכא EnMT לאחר ריפוי פצע, אנחנו מנוהלים זריקות intracameral של bFGF ואחריו הזרקת marimastat. הטיפול הפחית משמעותית את היקף בצקת בקרנית. מחקרים קודמים השתמשו יישום מקומי של-stimulating agents צמיחה CEC, כגון מעכבי ROCK, וסוכני EnMT-דיכוי, כגון ^21,22 מעכב Notch. עם זאת, החדירה של תרופות לתוך CEC שכבהאה היא מוגבלת על ידי אפיתל הקרנית stroma, אשר עשוי להשפיע על יעילות הטיפול ^23. בניגוד יישום מקומי, הזרקת intracameral מאפשרת גישה ישירה אל האנדותל הקרני על ידי החדרת תרופות ישירות לתוך החדר הקדמי. לכן, מגרה הצמיחה EnMT-דיכוי השפעת הכימיקלים ניתן להעריך unbiasedly הבא cryoinjury. במחקר שלנו, ביצענו ניקור הלשכה הקדמית כדי להוריד את הלחץ התוך עיני לפני הזריקה intracameral. ללא ניקור, גידול פתאומי בלחץ תוך עיני גורם לבצקת בקרנית או אפילו צניחה של הקשתית דרך מערכת המחט. בעדינות דחיסה בדרך במהלך עזרי נסיגת מחט איטום הפצע ומניעת זיהום תוך עיניים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug