In vitro og in vivo-modeller for å studere hornhinne endotel-mesenchymale Transition

Summary

En primær kultur av bovine corneale endotelial-celler ble brukt for å undersøke mekanismen for hornhinnen endotelial-mesenchymale overgang. Videre ble en rotte hornhinneendotelet cryoinjury modell som brukes for å demonstrere korneal endotelial-mesenkymale overgang in vivo.

Protocol

Alle prosedyrer fulgt i denne studien tilstås med Foreningen for forskning i Vision og Ophthalmology Statement for bruk av dyr i Ophthalmic og Visjon Forskning og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité National Taiwan University Hospital.

1. Isolering, Primær Kultur Forberedelse og Farging av Bovine CECs

1. Tilegne seg friske storfe øyne fra en lokal slakteri.
2. Desinfisere øynene i en 10 vekt / volum% povidon-jodløsning i 3 min. Vask dem med fosfat-bufret saltvann (PBS) løsning.
3. Høste hornhinnen knappen med en skalpell og saks under sterile forhold. Skrelle den Descemefs membran med tang i henhold til et disseksjonsmikroskop (merk at i denne studien, ble bovine øynene enucleated av et lokalt slakteri, og derfor den første studien Måten var den desinfisering av preenucleated øynene i laboratoriet).
4. Inkuber descemets membran i 1 ml prøvepsin ved 37 ° C i 30 minutter. Samle bovine CECs ved sentrifugering ved 112 xg i 5 minutter. Resuspender cellene i 1 ml supplementert hormonell epitel medium (SHEM) inneholdende like volumer av HEPES-bufret Dulbeccos modifiserte Eagle medium og Hams F12-medium supplert med 5% føtalt bovint serum, 0,5% dimetylsulfoksyd, 2 ng / ml human epidermal vekstfaktor, 5 mg / ml insulin, 5 mg / ml transferrin, 5 ng / ml selen, 1 nmol / l av koleratoksin, 50 mg / ml gentamicin, og 1,25 mg / ml amfotericin B.
5. Seed cellene (ca. 1 x 10 ⁵ celler per øye) til en 6 cm parabolen. Kultur dem i SHEM. Inkuber fatet ved 37 ° C i en atmosfære av _5% CO2 i luft. Endre kulturen medium hver 3. dag.
6. Når cellene når konfluens, vaske dem i PBS og inkubere dem i 1 ml trypsin ved 37 ° C i 5 minutter. Samle dem ved sentrifugering ved 112 xg i 5 minutter. Re-suspendere cellepelleten i 1 ml av SHEM. Telle celler i et hemocytometer. Seed cellene på dekkglass i en tetthet på 1 x 10 ⁴ per brønn i en 24-brønners plate, og kulturen cellene i SHEM. For å undersøke den EnMT-undertrykkende effekt av marimastat, inkuberes cellene i SHEM med 10 pM av marimastat tilsatt til kulturmediet, og endre dyrkningsmediet etter 3 dager.

Fiksere cellene på et angitt tidspunkt med 250 pl av 4% paraformaldehyd, pH 7,4, i 30 minutter ved romtemperatur. Permeabilize med 250 mL av 0,5% Triton X-100 i 5 min. Blokk med 10% bovint serumalbumin i 30 min.

Inkuber cellene med primære antistoffer mot aktiv beta-catenin (ABC), snegler, og slug over natten ved 4 ° C. Fortynningen av de primære antistoffer som brukes er 1: 200. Antistoffene blir fortynnet i antistoff-fortynningsmiddel bestående av 10 mM PBS, 1% w / v bovint serumalbumin og 0,09% vekt / volum natriumazid.

Vask cellene to ganger med PBS i 15 min, og inkuberm med Alexa Fluor-konjugert sekundært antistoff (1: 100 i antistoff-fortynningsmiddel) ved romtemperatur i 1 time.

Counterstain cellekjernen ved å dekke cellene med 2 ug / ml av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, vaskes cellene to ganger med PBS i 15 min, og montere dem med anti-fading monteringsløsning.

Skaff Immunofluorescent bilder på eksitasjonsbølgelengdene av 405 og 488 nm ved hjelp av en laser scanning confocal mikroskop med 20x objektiv forstørrelse.

2. Rat hornhinneendotelet Cryoinjury Modell og Intracameral Injection

1. Bedøve 12 uker gamle Sprague-Dawley hannrotter med intramuskulære injeksjoner av 2% xylazin (5,6 mg / kg) og tiletamin pluss zolazepam (18 mg / kg). Forsiktig klemme huden på dyrene for å bekrefte riktig anestesi i fravær av huden rykninger.
2. Innpode en dråpe 0,5% proparacaine hydrochloride til høyre øyet av hver rotte for å redusere smerter i øyet og blunkerefleksen. innpodetetracyklin salve til venstre øyet for å hindre hornhinnen tørrhet.
3. Avkjøl en rustfri stålsonde (diameter = 3 mm) i flytende nitrogen. Anvende rustfritt stål proben til den sentrale hornhinnen i høyre øye i 30 sek. Vanlige innpode PBS til høyre øyet under prosedyren for å hindre hornhinnen tørrhet.
4. Innpode 0,1% atropin og 0,3% gentamicin sulfate umiddelbart etter cryoinjury og én gang daglig for å lindre øyesmerter som følge av stråle krampe og for å hindre smitte.
   1. Etter prosedyren holde rottene varme ved hjelp av en varmelampe, og observere deres utvinning hvert 15 min etter anestesi inntil de gjenvinne motorisk kontroll. I tillegg gjelder tetracyklin salve til høyre øyet å hindre hornhinnen tørrhet under utvinning perioden.
5. Gjenta hornhinnen cryoinjury i 3 påfølgende dager.
6. For å levere marimastat eller bFGF inn i det fremre kammer av rotte-øynene, bedøve rottene som beskrevet tidligere. Innpode en dråpe0,5% proparacaine hydroklorid inn i høyre øye for å minimere øyesmerter og blunkerefleksen.
7. Skyll den okulær overflate med sterilt PBS. Utføre fremre kammer paracentesis under en operasjonsmikroskop ved å sette inn en 30 G nål festet til en 1 ml sprøyte ved paralimbal klart hornhinnen i et plan over og parallelt med iris.
8. Snu nålen bevel opp, og litt trykk hornhinnen såret for å drenere litt kammer og redusere intraokulært trykk. Injisere 0,02 ml av stoffet intracamerally. Forsiktig komprimere nålen kanalen med en bomullspinne under nålen trekning.
9. Fotografere den eksterne øye på en indikert tidspunkt under drifts mikroskop.

3. Høsting Rat Hornhinnen Button og Farging

1. Å avlive rottene, plassere dem i en dødshjelp kammer og sette 100% CO ₂ ved en fylle rate på 10-30% av kammervolum per minutt. Oppretthold CO ₂ infusjon for enekstra minutt etter mangel på respirasjon og falmet øyenfarge.
2. Trenge rotte øye på limbus med en skarp kniv. Skjær hornhinner med hornhinnen saks langs limbus. Flat ut hornhinner på et lysbilde. Foreta ytterligere radial snitt hvis hornhinner krølle opp.
3. Fest hornhinner med 250 pl av 4% paraformaldehyd, pH 7,4, i 30 minutter ved romtemperatur. Permeabilize med 250 mL av 0,5% Triton X-100 i 5 min, og blokker med 10% bovint serumalbumin i 30 min.
4. Inkuber hornhinner med primære antistoffer mot ABC over natten ved 4 ° C med en fortynning på 1: 200 i antistoff-fortynningsmiddel. Vask hornhinner to ganger med PBS i 15 min, og inkuber dem med det sekundære antistoff (1: 100 i antistoff-fortynningsmiddel) ved romtemperatur i 1 time. Counterstain cellekjernen ved å dekke cellene med 2 ug / ml av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol, og vaske cellene to ganger med PBS i 15 min.
5. Monter hornhinner i anti-falming monteringsløsning. obholde de Immunofluorescent bilder på eksitasjonsbølgelengdene av 405 og 561 nm med en laser scanning konfokalmikroskop på 20X objektiv forstørrelse.

Representative Results

Etter isolering av bovin CECs, ble cellene dyrket in vitro. Figur 1 presenterer fasekontrastbilder av storfe CECs. Den heksagonale formen på cellene ved konfluens indikerte at cellene ikke var forurenset av hornhinnen i løpet av stromal fibroblast celleisolasjon. Figur 2 viser immunfarging ble utført ved bruk av antistoffer mot ABC, snegl, og slug ved en indikert tidspunkt. Bortsett fra fenotypiske endringer i in vitro-kulturen, ble det observert en tilsvarende atomtranslokasjon av ABC og EMT-regulatorer. Figur 3 illustrerer effekten av marimastat, et bredspektret MMP-inhibitor, på den EnMT prosessen med in vitro-dyrkede bovine CECs. Figur 4 omfatter ytre øye fotografier av rotter etter cryoinjury fulgt av intracameral injeksjon. Figur 5 viser immunfarging av r på hornhinnen knapp som ble utført ved hjelp av antistoffer mot ABC etter cryoinjury fulgt av intracameral injeksjon. Den nukleære translokasjon av ABC ble observert i PBS-gruppen og var signifikant økt i bFGF-gruppen, noe som indikerer aktivering av Wnt / β-catenin signalering og EnMT prosess. Etter intracameral injeksjon av bFGF fulgt av marimastat injeksjon, ble den kjernefysiske farging av ABC redusert, noe som tyder på EnMT hemmende effekten av marimastat.

Fig. 1: fasekontrastbilder av in vitro dyrkede bovine CECs Etter å være podet på kulturplaten, den bovine CECs først dukket fibroblast-lignende på dagene 3 og 6. De ble mer heksagonal ved oppnåelse av fullstendig konfluens på dag 9. Skala bar = 50 um. Representative bilder av 3 gjentak.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Farging av in vitro dyrkede bovine CECs Under in vitro dyrking av det bovine CECs, den nukleære translokasjonen av ABC, snegl, og slug ble detektert ved dag 14. ABC.: Aktiv β-catenin. Scale bar = 100 mikrometer. Representative bilder av 3 gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3:. Farging av in vitro dyrkede storfe CECs med eller uten marimastat på ulike celle Confluence nivåer farging demonertrated at ABC, snegle, og slug var tydelig i kjernen av storfe CECs med eller uten 10 mm av marimastat på dag 3. Men marimastat betydelig redusert atom farging av ABC, sneglen, og slug på dag 9 når storfe CECs ble fullstendig sammenflytende. Scale bar = 100 mikrometer. Representative bilder av 3 gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 4: ytre øye fotografier av rotter ved angitte tidspunkter etter cryoinjury Etter cryoinjury i 3 påfølgende dager, ble rotter underkastet intracameral injeksjon av 0,02 ml PBS eller 50 ng / ml bFGF på dag 3. På dag 6, 0,02 ml 10 mikrometer marimastat ble injisert intracamerally i bFGF / Mari gruppe, mens PBS ble injisert i den andre to Groups (n = 9 i hver gruppe). Eksterne øye bilder avslørte redusert hornhinneødem etter bFGF injeksjon, mens marimastat ytterligere redusert hornhinneødem sammenlignet med bFGF alene. N = 9 i hver gruppe. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5:. Farging av rottehornhinnen knapper Farging av rottehornhinnen knapper som ble høstet på dag 9 avslørte lite kjernefysiske farging av ABC i PBS-gruppen. I bFGF gruppen, det var omfattende kjernefysisk farging av ABC, som ble betydelig redusert i bFGF / Mari gruppe. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av this figuren.

Discussion

CECs er kjent for deres tilbøyelighet til å gjennomgå EnMT i løpet av celleproliferasjon. Å utvikle strategier for å undertrykke EnMT fremgangsmåte for terapeutiske formål, er det nødvendig med en grundig forståelse av den EnMT mekanismen. Vi beskrev 2 modeller for å undersøke EnMT, nemlig storfe CEC in vitro kultur modell og rotte hornhinneendotelet cryoinjury modell. Våre resultater viste EnMT prosessen i begge modellene. Videre ble EnMT hemmende effekten av marimastat gjengitt i begge modellene, noe som tyder på at disse 2 modellene har samme mekanisme.

Storfe CEC in vitro kultur modellen tilbyr enkel manipulasjon. I tillegg sammenlignet med den menneskelige eller primat CEC in vitro kultur modeller ansatt i tidligere studier ^17,18, storfe øyne er større og lettere å skaffe seg, og dermed har flere CECs tilgjengelig. I vår studie, kjøpte vi den utskrapte storfe øyne fra en lokal slakteri. På grunn av fres h natur storfe øyne, er det nøyaktige antallet storfe CECs høstet gjenstand for variasjon, på ca 1 x 10 ⁵ celler per øye. I motsetning til dette er det flere humane CECs i en normal hornhinne ca. 3 x 10 ⁵ per øye. Dette tallet er lavere i studie-grade hornhinner og er enda lavere i resthornhinnen felger etter transplantasjon. Manipulasjoner under høsteprosedyren vil ytterligere redusere antall celler oppnådd. Videre kan storfe CECs spre og gjennomgå EnMT spontant; Derfor, den bovine CEC in vitro kulturmodell er nyttig i å undersøke den EnMT mekanismen og screening EnMT-undertrykkende kjemikalier, slik som marimastat. Selv om det fortsatt bekymring for artsrelaterte forskjeller, slik som den proliferative kapasiteten til CECs Våre resultater viste at de EnMT signalveien fra bovin CECs er lik den til humane CECs, deriblant aktivering av Wnt / β-catenin ^18,19.

telt "> Under isolering av bovint CECs, peeling den Descemefs membran er kritisk. I noen bovine øynene kan Descemefs membran ha tett adhesjon til det corneale stroma, som fører til overdreven stromale vev på skrelles Descemefs membran. Videre trypsinering kan medføre utgivelsen av stromale keratocytter som forvandler inn i hornhinnen fibroblaster, som påvirker celle renhet og derfor de eksperimentelle resultatene. i vår studie har vi skrelt den descemets membran nøye under et mikroskop. for å sikre celle renhet videre, må vi først dyrket de høstede celler i en 6 cm tallerken inntil celle konfluens. Bare når cellene var heksagonal i form var de som brukes i ytterligere forsøk.

For ytterligere å underbygge funnene av storfe CEC in vitro kultur modell, vi brukte rotte hornhinneendotelet cryoinjury modellen vedtatt i tidligere studier ^20,21. Etter cryoinjury, rotte CECs gikk EnMT under regenerering, manifeSTED etter den kjernefysiske translokasjon av aktive β-catenin, noe som indikerer at aktivering av Wnt / β-catenin signale konservert blant artene under CEC regenerering. I tillegg er denne modellen nyttig i å undersøke funksjonen av CECs fordi lav CEC funksjon fører til innlysende hornhinneødem. Kombinert med annet utstyr, som for eksempel ultralyd biomicroscope, fremre segment optisk koherens tomografi, og konfokalmikroskopi, kan hornhinnetykkelse kvantitativt evaluert og dermed reflektere CEC-funksjonen.

For å stimulere regenerering av CECs og undertrykke EnMT etter sårheling, vi administreres intracameral injeksjoner av bFGF fulgt av marimastat injeksjon. Behandlingen reduserte signifikant omfanget av hornhinneødem. Tidligere studier har brukt topisk påføring av CEC vekststimulerende midler, så som ROCK-inhibitor, og EnMT-undertrykkende midler, så som hakk inhibitor ^21,22. Imidlertid er penetrering av medikamenter i CEC leggeer begrenset av det corneale epitelium og stroma, noe som kan innvirke på behandlingseffekten ^23. I motsetning til topisk applikasjon, gjør det mulig for intracameral injeksjon direkte adgang til hornhinneendotelet ved innføring av legemidler direkte inn i det fremre kammer. Derfor kan den vekststimulerende og EnMT-undertrykkende virkning av kjemikalier vurderes unbiasedly følgende cryoinjury. I vår studie, utførte vi forkammer paracentesis å senke intraokulært trykk før intracameral injeksjon. Uten paracentesis, en brå økning i intraokulært trykk fører til hornhinneødem eller prolaps av iris gjennom nålen kanalen. Forsiktig sammenpressing av kanalen i løpet av nålen uttaks hjelpemidler i tettende såret og forhindrer intraokulært infeksjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trypsin	ThermoFisher Scientific	12604-013
Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium	ThermoFisher Scientific	11330
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	26140-079
dimethyl sulfoxide	Sigma	D2650
human epidermal growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0311
insulin, transferrin, selenium	ThermoFisher Scientific	41400-045
cholera toxin	Sigma	C8052-1MG
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750-060
amphotericin B	ThermoFisher Scientific	15290-026
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	111219
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
marimastat	Sigma	M2699-25MG
anti-active beta-catenin antibody	Millpore	05-665
anti-snail antibody	Santa cruz	sc28199
anti-slug antibody	Santa cruz	sc15391
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11001	for staining of ABC of bovine CECs
goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11003	for staining of ABC of rat corneal endothelium
goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008	for staining of snail and slug of bovine CECs
antibody diluent	Genemed Biotechnologies	10-0001
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306
mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
laser scanning confocal microscope	ZEISS	LSM510
xylazine	Bayer	N/A
tiletamine plus zolazepam	Virbac	N/A	veterinary drug
proparacaine hydrochloride ophthalmic solution	Alcon	N/A	veterinary drug
0.1% atropine	Wu-Fu Laboratories Co., Ltd	N/A	clinical drug
0.3% gentamicin sulfate	Sinphar Group	N/A	clinical drug
basic fibroblast growth factor	ThermoFisher Scientific	PHG0024	clinical drug