Protocol
Il protocollo deve essere effettuata in stretta conformità con le normative nazionali ed internazionali e le normative locali. Il sangue da donatori sani che hanno dato il loro consenso a donare il sangue per scopi di ricerca è stato ottenuto dal sangue centri trasfusionali con la quale le istituzioni hanno firmato un accordo. protezioni speciali devono essere prese quando si utilizza il sangue umano. Esperimenti con HIV-1 devono essere eseguite in un livello di biosicurezza 3 o 2 (BSL-3 o 2) di laboratorio in base alla legislazione locale.
1. Preparazione di macrofagi umani derivate da monociti (hMDMs) per gradiente di densità centrifugazione e selezione per adesione
- Inizia con sangue fresco da donatori sani (9 ml). Diluire l'intero volume di sangue fresco con 1x tampone fosfato sterile (PBS) senza Ca 2 + e Mg 2+ a ottenere un volume finale di 70 ml e aggiungere delicatamente il sangue diluito in due provette da 50 ml coniche (35 ml per provetta) , in cima a 15 ml di unaeutral, altamente ramificata, di massa elevata, polisaccaride idrofila in soluzione già in ciascun tubo.
- Centrifuga entrambi i tubi di sangue al 537 xg per 20 minuti a 20 ° C senza freno. Poi raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenuti nel ring cellule nuvoloso a livello di interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo da 50 ml contenente 15 ml di 1x PBS senza Ca 2+ e Mg 2+.
- Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 minuti a 20 ° C e risospendere il pellet in 45 ml di 1x PBS senza Ca 2+ e Mg 2+.
- Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C, risospendere il pellet in 10 ml di PBS 1x senza Ca 2 + e Mg 2+, e contare le cellule diluendo ad una diluizione finale di 1/200 in Trypan Blue.
- Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C e risospendere il pellet in RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 integrato con 2 mM L-glutammina e 100 ug / ml PenicIllin-streptomicina avere 7 x 10 6 PBMC per pozzetto in 2 ml di mezzo in ogni pozzetto di una piastra a pozzetti 6.
- Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 ore. Dopo 2 ore monociti avranno aderito alla plastica.
- Per consentire monociti appena isolati di differenziarsi in hMDMs, aspirare il terreno e sostituirlo con 2 ml hMDM media (RPMI 1640, il 10% decomplemented siero fetale di vitello (FCS), 2 mM L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina) integrato con ricombinante umano macrofagi fattore stimolante le colonie (RHM-CSF) ad una concentrazione finale di 10 ng / ml.
- Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 11 giorni (Figura 1).
- Al giorno 11 rimuovere il supporto e lavare 2 volte con 2 ml di terreno hMDM freddo per pozzetto. Successivo lavare i pozzetti 2 volte con 1 ml di freddo 1x PBS.
- Per staccare hMDMs completamente differenziate, lavare ogni tempo ben 1 con 1 ml di freddo 1x PBS con 2 mm di acido ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) e incubare le cellule in 2 ml di PBS freddo 1x con 2 mM EDTA per pozzetto per 15-60 minuti a 4 ° C.
NOTA: Metodi alternativi per staccare esistono le cellule (ad esempio, tripsina o attività tripsina-simile) che potrebbe dare buoni risultati 11. - Dopo il distacco (completato pipettando gentilmente su e giù nel pozzo), raccogliere le cellule e metterli in un tubo da 50 ml in ghiaccio contenente 10 ml di terreno hMDM freddo.
- Centrifugare le cellule a 218 xg per 5 min a 20 ° C, risospendere il pellet in 10 ml di terreno hMDM fredda, e contare le cellule diluendo 1/20 in Trypan Blue.
- Seme le cellule a 1 x 10 6 hMDMs a 35 millimetri di vetro microscopia grade piatto fondo e incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 1 giorni.
2. Produzione e quantificazione di HIV-1 Stocks virali
NOTA: NLR4.3 HIV-1 gag-iGFP (Green Fluorescent Protein) che trasportano una busta R5-tropico, dono di M. Schindler 10 viene utilizzato per infettare i macrofagi e le cellule infette vedere in tempo reale.
- Produrre stock virali mediante trasfezione delle cellule embrionali umane del rene 293T (2 x 10 6 in 100 millimetri piatto) con 6 ug del corrispondente DNA provirale utilizzando un reagente di trasfezione commerciale.
- Quantificare l'infettività delle riserve di virus utilizzando le cellule indicatore HeLa TZM-bl (recanti il gene beta-galattosidasi sotto il controllo di HIV-1 LTR) utilizzando diluizioni seriali dei titoli virali seguita da una colorazione ß-galattosidasi delle cellule e il conteggio le cellule di blu 12.
3. L'infezione di hMDMs con HIV-1
- Aggiungere il virus ad una molteplicità di infezione (MOI) 0,02-0,03 in 1 ml di terreno hMDM per hMDMs (cellule placcati in 1.13). Per controllare pozzetti aggiungere solo 1 ml di terreno hMDM e incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Figura 1).
- Al giorno 2 Lavare le cellule con hMDM medIUM 3 volte e aggiungere 1 ml di terreno hMDM fresco per ogni piatto. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 6 giorni (Figura 1).
4. Opsonizzazione di pecore Globuli rossi
- Per la preparazione di 7 x 10 6 GRP che per piatto, lavare i GRP che due volte con 100 ml di soluzione contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS 1x con centrifugazione a 600 xg per 4 min.
- Risospendere le GRP che lavata in 500 microlitri 1x PBS / BSA 0,1% con IgG di coniglio anti-GRP che ad una concentrazione sub-agglutinante per 5 ml di GRP che e incubare con rotazione a temperatura ambiente per 30 min.
NOTA: per determinare la concentrazione sub-agglutinante di anti-GRP che IgG, preparare diluizioni seriali di IgG (magazzino di concentramento di 13,1 mg / ml) da 1/50 a 1 / 25.600 in 20 microlitri in una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 2 x 10 6 GRP che in 20 microlitri di ogni bene e mettere il piatto in una stanza buia durante diverse ore. La concentrazione sub-agglutinante è ildiluizione del pozzo poco prima del bene con agglutinazione (IgG + GRP che formano una rete). - Dopo la rotazione, centrifugare le-GRP che IgG-opsonizzati a 600 xg per 4 minuti e lavare con 100 ml di 1x PBS / BSA 0,1% con centrifugazione a 600 xg per 4 minuti.
- Risospendere le-GRP che IgG-opsonizzati in media pre-riscaldato rosso fenolo-libero RPMI integrato con 2 mM L-glutammina e l'1% di penicillina-streptomicina (1 ml / piatto).
5. cellulare dal vivo microscopio video fagocitosi Assay
- Utilizzare un sistema di imaging confocale come un sistema disco rotante dotato di una camera di riscaldamento a 37 ° C con CO 2 passa attraverso una bottiglia con acqua per umidificazione.
- Accendere la camera di riscaldamento prima dell'esperimento di avere palco microscopio a 37 ° C prima dell'inizio del saggio fagocitosi. Accendere il microscopio e il computer, e caricare il software di imaging.
- Ottimizzare le impostazioni di imaging come la velocità di scansione, magnification, risoluzione, ecc avere almeno una cella per campo e all'immagine un fotogramma ogni minuto tra 60 a 120 min.
NOTA: Qui, il campione viene ripreso un fotogramma ogni minuto durante 60 minuti con 63X lente. - Porre la capsula di imaging sul palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e la posizione per trovare una sola intera HIV-1 macrofagi infettati nel campo. Utilizzare le impostazioni di eccitazione / emissione appropriate in base al sistema di imaging utilizzata e sonda. Includere un canale luminoso campo (BF) per osservare phagosomes (Figura 1ii). Ottimizzare l'aspetto delle diverse immagini del canale regolando la percentuale di tempo di luce e l'esposizione trasmessa.
NOTA: Qui, NLR4.3 HIV-1 gag-iGFP è stato eccitato con un laser a 491 nm con 50 msec di tempo di esposizione con il 20% di laser (Figura 1i). - Rimuovere il piatto di imaging e aggiungere 1 ml di sospensione SRBC a 7 x 10 6 / ml GRP che al piatto (Figura 1).
- Centrifugare a 500 xg per2 min a RT per sincronizzare fagocitosi, registrare il tempo alla fine di questa centrifugazione e tornare il piatto allo stadio.
- Ottimizzare la messa a fuoco e cattura GFP e immagini BF in Z-stack (tutto lo spessore della cella con un passo distanza di 0,3 micron - solitamente 20 aerei) ogni minuto per almeno 1 ora. Salvare il video time-lapse nel file-formato nativo del sistema di imaging utilizzato.
NOTA: Qui, filmati time-lapse sono stati salvati nel formato nativo, i file * .stk.
6. L'analisi dei filmati time-lapse
- Per l'editing video, fare clic sul menu a discesa "Apps" e nella scheda "Review Multi Dimensional Data" nel software di editing video.
- Per aprire il file, cliccare su "Seleziona file base" e poi su "Seleziona Directory". Nella casella "Set di dati", selezionare l'acquisizione da analizzare (in formato .nd) e cliccare su "Visualizza". I dati sono rappresentati in una tabella nel tempo in una colonnad Z-piano in linea.
- Per rappresentare l'infezione in un Z-proiezione (Figura 2, i pannelli di sinistra), selezionare 491 nm di lunghezza d'onda nella casella "lunghezze d'onda" e fare clic sulla scheda "proiezione Z" con "tutti i piani".
- Per analizzare una sequenza temporale, selezionare la lunghezza d'onda BF nella casella "lunghezze d'onda" e scegliere il piano ottimale su l'asse Z per distinguere GRP che esterni (Figura 2, punta di freccia rossa), GRP che interni (Figura 2, cerchio rosso) e il nucleo ( Figura 2, cerchio blu).
- Per salvare i montaggi video, cliccare su "Selezione [di X] scheda" e poi su "Load Image (s)". Infine, salvare le immagini caricate in formato tif e aprirli prossima sul software ImageJ.
- Utilizzare il plug "Manual Tracking" sul software ImageJ per misurare la posizione del nucleo e le diverse phagosomes osservate nel canale BF (Figura 3).
- Download il plugin "Allineamento manuale" sul sito web ImageJ. Su ImageJ, aprire il plugin e la sequenza di immagini da analizzare (Figura 3, punti 1 e 2).
- Inserire le impostazioni quali "Intervallo di tempo", che rappresenta quantità di tempo tra i fotogrammi adiacenti, e la "taratura x / y", che rappresenta la distanza per pixel (Figura 3, punto 3).
NOTA: Qui, salvare la sequenza di immagini con un intervallo di tempo di 1 min tra ogni fotogramma e x / y calibrazione di 0,205 micron perché lo zoom 63X e una fotocamera con dimensioni pixel di 6,45 x 6,45 micron 2 vengono utilizzati. - Per avviare il monitoraggio, cliccare su "Add Track" (Figura 3, punto 4) e fare clic su un centro di SRBC a la prima volta quando viene interiorizzato. Il fotogramma successivo appare automaticamente.
- Continuare a fare clic sul centro SRBC in tutti i fotogrammi di avere posizioni diverse nel corso del tempo (figura 3, passo 6 nel riquadro rosso).
- Iniziare a monitorare il nucleo che la sua posizione in tutti i fotogrammi facendo clic sul suo centro. Traccia successiva le phagosomes (cliccando sul suo centro) uno per uno, al momento (frame) della loro internalizzazione, diversa in funzione della GRP che. Per comodità di vedere SRBC sul canale BF, utilizzare la finestra "Luminosità e contrasto" durante l'inseguimento (Figura 3, punto 5).
- Tra ogni monitoraggio SRBC, cliccare su "Add Track" (Figura 3, punto 4) per avere una nuova traccia. Il numero di inseguimento sarà cambiata nella seconda colonna, "Track n °" della tabella dei risultati (Figura 3, punto 6).
- Salvare i dati in un foglio di continuare alla fase successiva dell'analisi.
- Utilizzare il software foglio di calcolo per calcolare la distanza percorsa di fagosomi contenenti GRP che verso il nucleo e la velocità dei phagosomes durante i primi 5 minuti dopo l'internalizzazione di GRP che (Fifigura 4).
- Aprire la tabella foglio di calcolo e un nuovo file di foglio di calcolo. Trasferire in questo nuovo file solo i seguenti parametri, il tempo, gli assi X e Y coordinate del nucleo e tutti i GRP che (figura 4a).
- Per calcolare la distanza tra GRP che il nucleo e con solo loro coordinate, considerare il nucleo e un SRBC in un piano XY coordinata (Figura 4B).
NOTA: La distanza tra due punti è la lunghezza del percorso che li collega. Nel piano, la distanza tra SRBC e il nucleo è dato dal teorema di Pitagora.- Se c (la distanza tra il nucleo e il SRBC) indica la lunghezza dell'ipotenusa e ae b indicano le lunghezze degli altri due lati, esprimere teorema di Pitagora 'come equazione di Pitagora:
NOTA: Allo stesso tempo, il ortonormale, la distanza orizzontalea è (x nucleo -x SRBC) e la distanza verticale b è (y nucleo -y SRBC). - Così, calcolare la distanza tra il nucleo e il SRBC (Figura 4A, scatola viola) da:
NOTA: Moltiplicare il valore della distanza ottenuto (in pixel) mediante calibrazione x / y di avere distanza in micron. Qui, la calibrazione x / y è 0,205 micron. - Ad ogni volta, sottrarre la distanza tra il nucleo e il SRBC alla distanza iniziale (Figura 4C).
- Tracciare la misura contro il tempo per il primo 5 min. Applicare un trend-line lineare (Figura 5A) per la trama e determinare la pendenza della linea di tendenza lineare che rappresenta la velocità phagosome verso il nucleo durante i primi 5 minuti dopo l'internalizzazione SRBC.
- Collazionare i dati per calcolare l'errore medio e statistica dii valori di velocità e li trama in forma adeguata utilizzando il software appropriato (Figura 5B).
- Se c (la distanza tra il nucleo e il SRBC) indica la lunghezza dell'ipotenusa e ae b indicano le lunghezze degli altri due lati, esprimere teorema di Pitagora 'come equazione di Pitagora:
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Representative Results
FCR-mediata fagocitosi da parte hMDMs HIV-1-infetti e non infetti è descritto qui utilizzando GRP che IgG-opsonizzati come bersagli modello (Figura 1). I passaggi critici di questo protocollo sono la preparazione del hMDMs e l'infezione da HIV-1. Infatti, la resa e la qualità dei macrofagi differenziati varia tra i donatori, così come il tasso di infezione con efficienze nell'intervallo 10-40%. Inoltre, la preparazione di IgG-opsonizzati-GRP che è anche importante per evitare di danneggiare gli eritrociti, poiché ciò potrebbe indurre il loro riconoscimento e assorbimento come detriti anziché da fagocitosi FCR-mediata. opsonizzazione ottimale garantirà fagocitosi efficiente.
movimento phagosome nel vivere macrofagi infettati da HIV viene analizzato in tempo reale con il canale BF su un disco rotante microscopio confocale in laboratorio BSL-3. Le impostazioni del canale BF sono t criticheo consultare il nucleo (Figura 2, blu cerchio) e per discriminare l'esterno (figura 2, frecce rosse) dalle GRP che internalizzate (Figura 2, cerchi rossi). La microscopia BF è considerato come il più semplice tecnica di illuminazione microscopia ottica sufficiente per vedere i fagosomi, meno refringent quelli GRP che esterne.
Il primo passo dopo acquisizione di sequenze di immagini è tracking manuale sul software ImageJ (Figura 3). Questo punto può essere particolarmente lungo e tedioso, perché è preferibile monitorare ciascuna phagosome, uno per uno per tutte le sequenze di immagini e si ritiene che gli esperimenti devono essere ripetute con almeno 3 donatori ogni condizione di raggiungere una grande dimensione del campione sufficiente per analisi statistica (almeno 30 phagosomes con 3 differenti donatori).
Il secondo passo è l'analisiin un foglio elettronico per calcolare la velocità phagosome durante i primi 5 minuti dopo internalizzazione per ogni GRP che interiorizzato (Figura 4). Per questo, abbiamo trama di ogni phagosome la distanza percorsa durante i primi 5 minuti contro il tempo. Un esempio rappresentativo è mostrato in hMDMs non infetti Figura 5A. Poi si ottiene la velocità del phagosome, che è la pendenza della curva di regressione lineare. Una velocità di 0,5384 micron / min è stato trovato per questo phagosome.
Di nota, è possibile analizzare la velocità phagosome durante i primi minuti dopo interiorizzazione, come descritto qui o in Dumas et al. 8, o successivamente analizzando la velocità su scale temporali più lunghi. Nel nostro studio, abbiamo osservato che la velocità phagosome durante i primi 5 minuti dopo internalizzazione in hMDMs con infezione da HIV è inferiore rispetto a hMDMs non infette (Figura 5B).
Figura 1. Preparazione di controllo e hMDMs con infezione da HIV per l'imaging fagocitosi. I monociti sono purificato per l'adesione (1) e differenziate in macrofagi per 11 giorni con M-CSF (2). Successivamente, hMDMs sono infettati con HIV-NLR4.3 1Gag-iGFP i) ad un MOI tra il 0,02 e il 0,03 per 8 giorni con il lavaggio il giorno 2 (3). (4) GRP che IgG-opsonizzati vengono aggiunti sul hMDMs per fagocitosi durante 1 ora. I fagosomi contenenti GRP che sono rilevabili sulle immagini BF (cerchio rosso, ii). Le immagini sono dal database di immagini Servier. Bar = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. acquisizione in tempo reale durante lafagocitosi da parte di controllo rappresentante e hMDMs con infezione da HIV. hMDMs sono preparati e infettati come descritto nella Figura 1. Le cellule NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infetti vengono rilevati con il laser 491 nm. Z-pile di disco rotante immagini confocale vengono acquisiti e analizzati utilizzando sia il software di acquisizione microscopio e ImageJ (pannelli a sinistra). Gallerie di immagini BF rappresentano un (pannelli superiori corrispondenti a Film 1) non infetti e un NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infetti (pannelli inferiori corrispondenti a Movie 2) cella nel corso di una acquisizione di 45 minuti (46 immagini con il tempo indicati come hh : mm). La membrana cellulare (punteggiata linea nera), il nucleo (cerchio blu), i GRP che esterni (alcuni dei quali indicati con frecce rosse) e le GRP che interni (alcuni dei quali indicati con cerchi rossi) sono rilevabili sulle immagini BF. Bar = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. passaggi di istruzioni per l'analisi delle immagini con plug-in di monitoraggio manuale a ImageJ. Dopo aver aperto il plugin "Allineamento manuale" (1) e caricando il video time-lapse nel canale di BF (2), inserire i parametri di acquisizione (3). Clicca su "Add Track" (4) e avviare la misurazione del tracciamento cliccando su una phagosome (5) per ottenere una nuova finestra con le posizioni X e Y del phagosome scelta (6, riquadro rosso). Per seguire il phagosome sulla sequenza temporale per comodità, variare la luminosità e il contrasto (5 '). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
figura 4. passaggi di istruzioni per l'analisi dei dati di velocità di migrazione phagosome in un foglio elettronico. (A) Montare la posizione X e Y del nucleo e ogni phagosome (scatola rossa) in una tabella di foglio di calcolo. In un'altra colonna (scatola viola), calcolare la distanza tra phagosome e il nucleo con il teorema di Pitagora 'dove c rappresenta la lunghezza tra il nucleo e il SRBC e ae b le lunghezze degli altri due lati di un triangolo rettangolo ( B). (C) Infine, calcolare la distanza percorsa dai phagosomes in ogni momento (riquadro verde) sottraendo la distanza tra il SRBC e il nucleo in un dato momento dalla distanza iniziale al tempo 0. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande questa figura.
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Figura 5. Quantificazione di velocità di migrazione phagosome in controllo e hMDMs con infezione da HIV. (A) Per ogni SRBC e subito dopo internalizzazione SRBC, la distanza percorsa verso il nucleo è misurata e tracciata contro il tempo. La sua velocità durante i primi 5 minuti è calcolata utilizzando la regressione lineare in un foglio elettronico. Un esperimento rappresentativo è mostrato (il SRBC interna della figura 3-4). (B) tutte le velocità durante i primi 5 minuti sono misurati per 66 phagosomes a non infetti (5 donatori) e 60 phagosomes nelle cellule con infezione da HIV (4 donatori). I dati rappresentano la media ± SEM (test t di Student con correzione di Welch, **, P <0,01). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1: il movimento phagosome in un macrofago non infetta rappresentante. . (Tasto destro del mouse per scaricare) Il movimento dei globuli rossi opsonizzati è stato rilevato nel canale BF durante 45 min di fagocitosi con un'immagine per minuto (46 immagini con il tempo indicati come hh: mm). Bar = 10 micron.
Movie 2: movimento phagosome in un macrofago rappresentante sieropositivo. (Clic destro per il download). HIV-1 (HIV-1 NLR4.3 Gag iGFP) -infected macrofagi sono stati identificati dopo l'illuminazione con il laser 491. Il movimento dei globuli rossi opsonizzati stato rilevato nel canale BF durante 45min di fagocitosi con un'immagine per minuto (46 immagini con il tempo indicati come hh: mm). Bar = 10 micron.
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Discussion
Questa tecnica ha diversi passaggi critici. In primo luogo, la preparazione di hMDMs e l'infezione da HIV-1 è critico poiché la percentuale di infezione è donatore dipendente. Da notare, abbiamo deciso di utilizzare macrofagi che non sono polarizzati in vitro prima dell'infezione, perché lo stato macrofagi potenzialmente incontrate dal virus in vivo non è stata ben caratterizzata finora. Abbiamo controllato l'espressione di diversi marcatori di superficie, il che indica che i macrofagi M1 non sono né né M2, e verificato l'espressione di CD4 e CCR5. I tassi di infezione sono variabili e vanno dal 10 al 40%, e talvolta inferiori. Questo tasso di infezione variabile è il motivo per cui può essere difficile trovare un hMDM fluorescente infetta da HIV-1 sotto il microscopio. Inoltre, il tempo necessario per trovare una cellula infettata da HIV-1 subito dopo la fase di centrifugazione può anche portare ad un ritardo nell'inizio l'acquisizione. La fagocitosi potrebbe essere avviata senza il synchronization di legare e assorbimento generato mediante centrifugazione. Tuttavia, questa opzione non è stata selezionata per la GRP che che galleggiano prima di raggiungere le cellule. Potrebbe essere una buona opzione con perline. Per ridurre al minimo il tempo necessario per trovare cellule infette, piatti peggiori vetro reticolata potrebbero essere utilizzati per identificare HIV-1 hMDMs infetti prima di procedere ad iniziare il test fagocitosi. Le cellule infettate da HIV-selezionati che hanno un numero "ragionevole" di GRP che intorno a loro saranno poi scelti rapidamente per avviare acquisizioni. "Importo SRBC ragionevole" indica abbastanza per avere almeno 10 GRP che per cella e non troppi per evitare che le GRP che esterni da mascherare i phagosomes.
Inoltre, è importante per ottimizzare le condizioni Opsonizzazione garantire ci sarà il riconoscimento e l'assorbimento efficiente dalle cellule. La fagocitosi FCR-mediata è costitutiva e hMDMs sono abitualmente molto efficiente nel assorbimento FCR-mediata. Inoltre, per una corretta fagocitosi, le condizioni devono be ottimale con la camera di riscaldamento a 37 ° C e 5% CO 2. È necessario controllare il gas e la temperatura prima di iniziare il test fagocitosi.
Infine, la discriminazione di GRP che esterni da phagosomes interni e l'identificazione del nucleo nel canale BF sono importanti per l'analisi sul software ImageJ. Questo è il motivo per cui le impostazioni di questo canale sono importanti. Dato che il fuoco può essere persa durante l'acquisizione, si consiglia di acquisire pile di immagini in l'asse Z per essere sicuri di avere l'aereo ottimale per analizzare la velocità phagosome. E 'preferibile avere una singola cella in un campo analizzare tutti GRP che internalizzati per ogni cella. Ecco perché la scelta dell'obiettivo è importante e qui abbiamo usato 2 lenti in funzione della dimensione della cella. E 'stato più facile per noi di tenere traccia phagosomes con una lente 100X, ma a volte le cellule sono state troppo grande, così abbiamo dovuto passare ad una lente 63X. La scelta della lente è anche fondamentale quando si parla di imAnalisi età utilizzando ImageJ e una tabella di foglio di calcolo, perché entrambi gli obiettivi implicano diversi x / y tarature.
La prima limitazione di questa tecnica è il numero di campioni che devono essere acquisiti per avere risultati statisticamente significativi. Siamo in grado di registrare diversi film per donatore, ma di solito non più di 2 cellule per condizione, per il piatto. Le soluzioni a questa limitazione per aumentare il numero di campioni devono ripetere esperimenti con più donatori o per fare immagini XY multi-punto a seconda del microscopio. L'inconveniente dell'ultimo metodo è la potenziale perdita di messa a fuoco durante la scansione XYZ motorizzato. Un'altra limitazione è che la quantificazione manuale della velocità è lungo e tedioso rispetto ad una analisi automatizzata. Per l'analisi completa automatizzata, è necessario utilizzare particelle fluorescente, come riportato in studi pionieristici 4 con perle di lattice accoppiati alla gelatina pelle di pesce che sono stati seguiti con un algoritmo di inseguimento su software MatLab. Fluorescente opsonizzare anticorpi o perline potrebbe essere un'alternativa, ma sono soggette a imbianchimento, che è un problema quando si registra fagocitosi per 1 ora. Altri studi riportano l'uso di perle di lattice 13,14. Abbiamo notato, tuttavia, che l'internalizzazione di sfere di lattice è meno facilmente rilevato che l'assorbimento di GRP che. Infatti il punto di partenza della cinetica della migrazione intracellulare è importante sapere per rilevare i primi difetti di circolazione phagosomal.
Il principale vantaggio del metodo qui descritto è la sua semplicità e l'utilizzo di un software gratuito. Per eseguire il tracking manuale utilizzando il software ImageJ, dobbiamo utilizzare la posizione del phagosome e il nucleo, dunque, dobbiamo usare il teorema di Pitagora 'per calcolare la distanza tra il phagosome e il nucleo, e di avere la velocità dopo un regressione lineare in un foglio elettronico. Questa analisi 3 passi può essere ridotto a un passo, il monitoraggio, il software ICY con il & #34;. Manual Tracking "plug I dati in uscita sono quindi direttamente la velocità della particella di seguire, e più in particolare la velocità relativa tra i 2 gruppi (come phagosomes e nucleo) Infine, il calcolo permette di misurare la velocità relativa di. una particella rispetto a un'altra particella che può anche essere in movimento.
L'applicazione potenziale futuro di questa vita analisi time-lapse può essere per particelle visibili in campo chiaro, come batteri, funghi o detriti cellulari. diversi trattamenti o condizioni di infezione sufficienti per modificare phagosomal maturazione e le proprietà di attivazione dei macrofagi trarrebbero beneficio da una tale analisi raffinata di movimento phagosomal verso il centro delle cellule.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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