Protocol
protokol, ulusal ve uluslararası mevzuata ve yerel yönetmeliklere tam uyum içinde yapılmalıdır. araştırma amaçlı kan bağışı için rızalarını verdi sağlıklı donörlerden kan Kurumları anlaşma imzaladı hangi ile Kan Transfüzyon Merkezleri elde edilmiştir. İnsan kanı kullanılması özel bir koruma alınmalıdır. HIV-1 ile yapılan deneyler 3 veya 2 (BSL-3 veya 2) laboratuvar, yerel mevzuata uygun bir biyogüvenlik seviyesinde yapılmalıdır.
Yapışma yoğunluk gradyan santrifüjü ve seçim İnsan monosit türevli makrofajlar (hMDMs) hazırlanması 1.
- Sağlıklı vericilerden (9 mi) taze kan başla. 70 ml'lik bir son hacim elde etmek için Ca + 2 ve Mg + 2 olmaksızın, steril 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile taze kan tüm hacmi seyreltilir ve hafifçe iki 50 ml konik tüp içine seyreltilmiş kan eklemek (tüp başına 35 mi) bir 15 ml üstündekieutral, yüksek her bir tüp içinde daha önce çözelti içinde, yüksek kütle, hidrofilik polisakarit dallanmış.
- fren olmaksızın 20 ° C de 20 dakika boyunca 537 x g'de santrifüje kan her iki tüp. Daha sonra ara yüzeyde parçalı hücre halkasında bulunan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) toplamak ve Ca + 2 ve Mg + 2 olmadan 1x 15 ml PBS içeren yeni bir 50 mL tüp içine transfer edin.
- Santrifüj 20 ° C'de 5 dakika boyunca 218 x g'de hücreleri Ca + 2 ve Mg olmayan 1x PBS 45 ml pelet 2+.
- Santrifüj 20 ° C'de 5 dakika boyunca 218 xg'de hücreleri, Ca + 2 ve Mg + 2 olmadan 1x PBS, 10 ml pelet tekrar süspansiyon ve Tripan Mavisi 1/200 nihai seyreltme seyreltilerek hücreleri sayın.
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 218 x g'de hücreleri santrifüj ve 1640 ortamında 2 mM L-glutamin ve 100 ug / ml Penic ile desteklenmiş RPMI (Roswell Park Memorial Institute) peletillin-streptomisin, 6 gözlü bir plakanın her bir gözünde ortam 2 ml oyuk başına 7 x 10 6 PBMC'ler için.
- 2 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe edin. 2 saat sonra monositler plastik yapışmış olur.
- Taze izole edilmiş monositlerin, hMDMs içine ayırt orta aspire ile takviye edilmiş 2 ml hMDM ortamı (RPMI 1640, fetal buzağı serumu (FCS decomplemented% 10), 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin) ile değiştirmek için izin vermek için rekombinant insan makrofaj koloni uyarıcı faktör, 10 ng / ml'lik bir son konsantrasyonda (RHM-CSF) vardır.
- 11 gün sonra (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
- 11. günde de orta kaldırmak ve oyuk başına soğuk hMDM ortam, 2 ml ile 2 kez yıkanır. Sonraki soğuk 1 x PBS, 1 ml her bir çukura 2 kez yıkayın.
- (2 mM ethylenediaminetetraacetatic asit ile, soğuk 1 x PBS, 1 ml her bir 1 kez yıkama, tam olarak farklılaşmış hMDMs ayırmak içinEDTA) ve 4 ° C'de 15-60 dakika boyunca oyuk başına 2 mM EDTA, soğuk 1 x PBS, 2 ml hücreleri inkübe edin.
NOT: Hücreler var ayırmak için alternatif yöntemleri (örneğin, tripsin veya tripsin benzeri faaliyetler) iyi sonuçlar 11 verebilir. - (Yukarı ve aşağı kuyuda hafifçe pipetleme tamamlandı) ayrıldıktan sonra, hücreleri toplamak ve soğuk hMDM orta 10 ml içeren buz üzerinde bir 50 ml tüp koyun.
- Santrifüj 20 ° C'de 5 dakika boyunca 218 x g'de hücreler soğuk hMDM ortamı 10 ml pelet tekrar süspansiyon ve Tripan Mavisi 1/20 seyreltilerek hücreleri sayın.
- 35 mm mikroskopi dereceli cam alt tabak başına 1 x 10 6 hMDMs hücreleri tohum ve 1 gün için% 5 CO2 37 ° C'de inkübe edin.
HIV-1 viral Hisse Senedi 2. Üretim ve Niceleme
Not: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (yeşil floresan protein) M. SCHINDL bir R5-tropik zarf, hediye taşıyanER 10 makrofajlan enfekte etmek ve gerçek zamanlı olarak enfekte olan hücreleri görmek için kullanılmaktadır.
- Ticari bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak karşılık gelen proviral DNA 6 ug insan embriyonik böbrek 293T hücreleri (2 x 10 6, 100 mm çanak) transfeksiyonu ile viral stoklar üretir.
- hücreler ve sayılmasına yönelik bir beta-galaktosidaz renk ardından viral stoklar seri dilüsyonları kullanılarak (HIV-1 LTR kontrolü altında beta-galaktosidaz genini taşıyan) HeLa tzm-BL göstergesi hücreleri kullanılarak virüs stoklarının enfeksiyon niceliğini mavi hücreler 12.
HIV-1 ile hMDMs 3. Enfeksiyon
- hMDMs (1.13 kaplanmıştır hücreler) enfeksiyon (MOI) bir çokluğunda hMDM ortamının 0.02-0.03 1 ml virüs ekleyin. Kuyular hMDM ortamının sadece 1 ml ilave kontrol ve 2 gün (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C 'de yemekler kuluçkalanması.
- günde 2 hMDM Med hücreleri yıkayın3 kez amonyum ve tabak başına taze hMDM ortamının 1 ml. 6 gün (Şekil 1),% 5 CO2 ile 37 ° C 'de inkübe hücreleri.
Koyu kırmızı kan hücrelerine 4. Opsonizasyon
- Tabak başına 7 x 10 6 SRBClere hazırlanması için, 4 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ile 1x PBS içinde% 0.1 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden çözeltinin 100 ul SRBClere iki kez yıkayın.
- SRBClere 5 ul başına alt aglütinasyon konsantrasyonda tavşan IgG, anti-SRBClere PBS / BSA% 0.1 1 x 500 ul yıkandı SRBClere yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dönme ile inkübe edilir.
Not: anti-SRBC'ler IgG alt aglütinasyon konsantrasyonunu belirlemek 96 oyuklu bir plaka içerisinde 20 ul 1 / 25.600 1/50 arasında (13.1 mg / ml stok konsantrasyonunda) IgG seri dilüsyonları hazırlanması. Her oyuktaki 20 ul 2 x 10 6 SRBClere ekleyin ve birkaç saat boyunca, karanlık bir odada tabak koydu. alt aglütinasyon konsantrasyonudurhemen önce iyice aglütinasyon (IgG + SRBC'ler bir ağ oluşturan) ile kuyu seyreltme. - Dönme sonra 4 dakika boyunca 600 x g'de IgG opsonize-SRBClere santrifüj ve 4 dakika için 600 x g'de santrifüj ile 1X PBS / BSA% 0.1, 100 ul ile yıkayın.
- 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (1 ml / kutu) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış fenol kırmızısız RPMI ortamında IgG opsonize-SRBClere yeniden süspanse edin.
5. Canlı Hücre video Mikroskopi Fagositoz Assay
- Bu CO2 nemlendirme su ile bir şişe içinden geçen 37 ° C'de bir ısıtma odası ile donatılmış bir döner disk sistemi gibi bir konfokal görüntüleme sistemi kullanın.
- fagositoz testinde başlangıcından önce 37 ° C 'de mikroskop aşamasında için deney öncesinde ısıtma odasına açın. mikroskop ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımı yükleyin.
- Böyle tarama hızı, Magnificat gibi görüntüleme ayarlarını optimizeiyon, çözünürlük, vs 60 ila 120 dakika arasında her dakika sahada başına ve görüntü tek bir karede en az bir hücre var.
NOT: Burada, örnek 63X lens ile 60 dakika boyunca bir kare her dakika görüntülü. - Mikroskop sahnede görüntüleme çanak yerleştirin. Odağı ayarlamak ve konum alanına sadece bir bütün HIV-1 ile enfekte makrofaj bulmak için. kullanılan görüntüleme sistemi ve prob göre uygun uyarma / emisyon ayarlarını kullanın. Fagozomların gözlemlemek için parlak bir alan (BF) kanalı ekleyin (Şekil 1ii). iletilen ışık ve maruz kalma süresi yüzdesini ayarlayarak farklı kanal görüntülerin görünümünü optimize edin.
NOT: Burada, NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP lazer% 20 (Şekil 1i) ile zaman maruz kalma 50 ms ile 491 nm lazer kullanarak heyecanlıydı. - Görüntüleme tabağı çıkarın ve çanağın 7 x 10 6 SRBC'ler / ml (Şekil 1) SRBC süspansiyonu 1 ml.
- 500 xg'de santrifüjOda sıcaklığında 2 dakika, fagositozu senkronize bu santrifüj sonunda zamanını kaydetmek ve sahneye çanak dönün.
- en az 1 saat süreyle her dakika - (genellikle 20 uçakları 0.3 mikron adım mesafe ile hücre kalınlığı boyunca) Z-yığınlarının içinde odaklama ve çekim GFP ve BF görüntüleri optimize. kullanılan görüntüleme sisteminin yerel dosya formatında zaman atlamalı video kaydetmek.
NOT: Burada, zaman atlamalı filmleri yerli formatında kaydedilen, * .stk dosyaları.
Time-lapse Filmler 6. Analizi
- video düzenleme için, menü "Uygulamalar" aşağı ve video düzenleme yazılımı sekmesi "Değerlendirme Çok Boyutlu Veriler" konulu damla tıklayın.
- Dosyayı açmak için, ardından "Dizin Seç" "Select Bankası Dosyası" üzerine tıklayın. "Veri setleri" kutusuna, (Kara Delikler formatında) analiz ve "Görünüm" tıklayın edinimi seçin. veri sütunu An zamanla bir tablo temsil edilmektedirdoğrultusunda d Z-planı.
- Z-projeksiyon (Şekil 2, sol panel) enfeksiyonu temsil etmek, "Dalgaboyları" kutusuna 491 nm dalga boyu seçmek ve "tüm uçakları" ile "Z projeksiyon" sekmesine tıklayın.
- (Bir zaman dizisini analiz "Dalgaboyları" kutusuna BF dalga boyunu seçin ve dış SRBClere (Şekil 2, kırmızı ok ucu), iç SRBC'ler (Şekil 2, kırmızı daire) ve çekirdeği ayırt etmek için Z-ekseni üzerinde optimum düzlemi seçmek için Şekil 2, mavi daire).
- video montajı kaydetmek için, "Seçim [X]" sekmesini ve ardından "Load Image (lar)" üzerine tıklayın. Son olarak, .tif formatta yüklü görüntüleri kaydetmek ve ImageJ yazılım sonraki açın.
- Çekirdeğin konumunu ve BF kanalda gözlenen farklı fagozomların (Şekil 3) ölçmek için ImageJ yazılım üzerinde eklenti "Manuel İzleme" kullanın.
- DowImageJ sitesinde "Manuel İzleme" eklentisi nload. ImageJ üzerinde (Şekil 3, aşama 1 ve 2) eklentisi ve görüntü dizisi analiz edilecek açın.
- Böyle komşu kareler arasındaki süreyi temsil eden "Zaman Aralığı", ve piksel başına mesafeyi temsil eden "x / y kalibrasyon" (Şekil 3, adım 3) gibi ayarları girin.
NOT: 63X zoom ve 6.45 x 6.45 mikron 2 piksel boyutunda bir kamera kullanıldığı için Burada, her kare ve 0.205 mikron x / y kalibrasyon arasında 1 dakikalık bir zaman aralığı ile görüntü dizisi kaydedin. - Izleme başlatmak için, (Şekil 3, adım 4) "Add track" üzerine tıklayın ve içselleştirildiği zaman ilk kez bir SRBC merkezinde tıklayın. Bir sonraki kare otomatik olarak görüntülenir.
- Süre içinde farklı pozisyonlarda (Şekil 3, kırmızı kutu içinde adım 6) sahip tüm karelerde SRBC merkeze tıklayın devam edin.
- kendi merkezinde tıklayarak bütün karelerde konumunu var çekirdeği izlemek için başlayın. Sonraki zaman SRBClere fonksiyonu farklı onların içselleştirme (kare), en tek tek (kendi merkezine tıklayarak) fagozomların izleyebilirsiniz. Kolaylık BF kanalda SRBC görmek için, izleme (Şekil 3, adım 5) sırasında "Parlaklık ve kontrast" penceresini kullanın.
- Her SRBC izleme arasında, yeni bir parça var (Şekil 3, adım 4) "Add track" üzerine tıklayın. Izleme sayısı ikinci sütunda değişmiş olacak, sonuç tablonun "Parça n °" (Şekil 3, adım 6).
- Analizin bir sonraki adıma devam etmek için bir e-tablodaki verileri kaydetmek.
- (Çekirdek ve SRBClere içselleştirilmesi sonra ilk 5 dakika boyunca fagozomların hızı doğru SRBClere içeren fagozomların bir seyahat mesafe hesaplamak için Fi tablo yazılımını kullanınşekil 4).
- tablo tablo ve yeni bir tablo dosyasını açın. Bu yeni Aşağıdaki parametreler sadece dosyaya, zaman, x-içine aktarın ve çekirdek ve tüm SRBClere (Şekil 4A) koordinatı y.
- Sadece kendi koordinatlar ile SRBClere ve çekirdek arasındaki mesafeyi hesaplamak XY koordinat düzleminde (Şekil 4B) çekirdeği ve SRBC dikkate alın.
Not: iki nokta arasındaki mesafe onları bağlayan yolun uzunluğudur. düzlemde, SRBC ve çekirdek arasındaki mesafe Pisagor teoremi ile verilir.- C (nukleus ve SRBC arasındaki mesafe) hipotenüs ve a uzunluğunu gösterir b diğer iki tarafın uzunluklarını göstermek durumunda, Pisagor denklemi olarak Pisagor teoremini ifade:
Not: Aynı zamanda, Ortonormal üzerinde yatay mesafe(x çekirdeği -x SRBC) ve dikey mesafe b (SRBC -y y çekirdeği) 'dir. - Böylece, çekirdek ve SRBC (Şekil 4A, mor kutu) ile arasındaki mesafeyi hesaplamak:
NOT: mikron mesafe olması x / y kalibrasyon (piksel) elde mesafe değeri çarpın. Burada, x / y kalibrasyon 0.205 mm. - Her zaman, çekirdek ve başlangıç mesafesi (Şekil 4C) için SRBC arasındaki mesafeyi çıkarın.
- İlk 5 dakika için zamana karşı ölçüm çizilir. Arsa doğrusal eğilim çizgisi (Şekil 5A) uygulayın ve SRBC içselleştirme sonra ilk 5 dakika boyunca çekirdeğin doğru fagosom hızını temsil doğrusal trend çizgisinin eğimini belirler.
- ortalama ve istatistiki hatayı hesaplamak için veri harmanlamakhız değerleri uygun yazılımı (Şekil 5B) kullanılarak uygun bir biçimde bunları çizmek ve.
- C (nukleus ve SRBC arasındaki mesafe) hipotenüs ve a uzunluğunu gösterir b diğer iki tarafın uzunluklarını göstermek durumunda, Pisagor denklemi olarak Pisagor teoremini ifade:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HIV-1 ile enfekte edilmiş ve enfekte olmayan hMDMs ile fagositozu FcR aracılı modeli hedefleri olarak IgG opsonize SRBClere (Şekil 1) kullanılarak burada tarif edilmektedir. Bu protokol kritik adım hMDMs hazırlanması ve HIV-1 enfeksiyonu bulunmaktadır. Gerçekten de, farklı makrofaj verim ve kalite donörler arasında değişir, ve% 10-40 aralığında verimliliği ile enfeksiyon oranı. Buna ek olarak, IgG-opsonize-SRBClere hazırlanması Bu, tanıma neden ve artık olarak yerine FcR aracılı fagositoz alım prosesini çünkü, eritrositler zarar görmesini engellemek için önemlidir. Optimal opsonizasyon verimli fagositoz sağlayacaktır.
HIV ile enfekte makrofajlar yaşayan fagosom hareketi BSL-3 laboratuvar dönen bir disk konfokal mikroskop BF kanalı ile gerçek zamanlı olarak analiz edilir. BF kanalının ayarları kritik t vardıro çekirdeği (Şekil 2, mavi daire) ve içselleştirilmiş SRBClere (Şekil 2, kırmızı daireler) harici (Şekil 2, kırmızı ok başları) ayrımcılık için bkz. BF mikroskopisi dış SRBClere daha az refringent olan fagozomların, görmek için yeterli basit optik mikroskop aydınlatma tekniği olarak kabul edilir.
Görüntü dizilerinin kazanılmasından sonra ilk adım ImageJ yazılım üzerinde manuel izleme (Şekil 3). deneyler için yeterince büyük bir örneklem büyüklüğüne ulaşmak için durum başına en az 3 donörler ile tekrar edilmesi gereken tüm görüntü dizileri için tek her phagosome, bir tane izlemek için tercih edilir ve kabul edilir, çünkü bu nokta, özellikle uzun ve sıkıcı olabilir istatistiksel analiz (3 farklı donörler ile en az 30 fagozomların).
İkinci adım analiztablo yazılımı her içselleştirilmiş SRBClere (Şekil 4) için içselleştirilmesi sonra ilk 5 dakika boyunca fagosom hızını hesaplamak için. Bunun için, biz mesafe zamana karşı ilk 5 dakika boyunca seyahat her fagozomun için arsa. Temsili bir örneği, Şekil 5A enfekte olmayan hMDMs gösterilmiştir. Sonraki biz lineer regresyon eğrisinin eğimi fagozomun, hızını edinin. 0,5384 mm / dak bir hız bu fagozomun için bulunmuştur.
Dikkat çekici bir şekilde, burada ya Dumas ve ark., 8 de tarif edildiği gibi, ya da daha sonra daha uzun zaman ölçeği üzerindeki hız analiz ederek, internalizasyon sonraki ilk birkaç dakika boyunca fagosom hız analiz etmek mümkündür. Bu çalışmada, HIV ile enfekte olmuş hMDMs olarak içselleştirme sonra ilk 5 dakika boyunca fagosom hızı enfekte olmayan hMDMs (Şekil 5B) alt karşılaştırılır görülmektedir.
Kontrol ve fagositoz görüntüleme için HIV ile enfekte hMDMs Şekil 1. hazırlanması. Monositler yapışma ile saflaştırılır (1) ve M-CSF ile 11 gün boyunca makrofajlar ayrışmıştır (2). Daha sonra, hMDMs günde 2 yıkama ile 8 gün boyunca 0.02 ile 0.03 arasında bir MOI'da NLR4.3 HIV 1Gag-iGFP I) ile enfekte edilmiştir (3). (4) IgG-opsonize SRBC'ler, 1 saat boyunca fagositosis için hMDMs üzerine ilave edilir. SRBClere içeren fagozomların BF görüntüleri saptanabilir (kırmızı çember, ii). Görüntüler Servier görüntüleri veritabanından vardır. Bar = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Sırasında Şekil 2. Gerçek zamanlı edinimiŞekil 1 'de tarif edildiği gibi Örnek kontrol ve HIV ile enfekte hMDMs tarafından fagositoz. hMDMs hazırlanmış ve enfekte edilir. NLR4.3 HIV 1Gag-iGFP enfekte edilmiş hücreler 491 nm lazer ile tespit edilir. dönen disk konfokal görüntü Z yığınlarının alınan ve mikroskop toplama yazılımı ve ImageJ (sol paneller) her ikisini de kullanarak analiz edilir. BF görüntüleriyle SS olarak gösterilen bir enfekte olmayan (Film 1 'e karşılık gelen en üst panel) ve (45 dakika devir esnasında hücre kez 46 görüntü, bir NLR4.3 HIV 1Gag-iGFP enfekte (Film 2 karşılık gelen taban panelleri) temsil eder : mm). Hücre zarı (noktalı siyah çizgi), çekirdeği (mavi daire), dış SRBC'ler (bazıları kırmızı ok uçları ile gösterilir) ve iç SRBC'ler (bazıları kırmızı daireler ile gösterilir) BF görüntülerde saptanabilir. Bar = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ImageJ Manuel İzleme eklentisi ile görüntü analizi için Şekil 3. Talimat adımları. BF kanalı (2) 'de time-lapse videoyu "Manuel İzleme" eklentisi (1) açılması ve yükledikten sonra, satın alma (3) parametrelerini girin. "Add track" (4) ve seçilen fagozomun (6 kırmızı kutu) X ve Y pozisyonları ile yeni bir pencere elde etmek için bir fagozomun (5) tıklayarak izlemenin ölçümü başlatın tıklayın. Parlaklığı ve kontrastı (5 ') değişebilir, kolaylık için zaman dizisi üzerinde phagosome izleyin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
şekil Tablo yazılımı fagosom göç hızı veri analizi için 4. Talimat adımları. (A) tablo tablo X ve çekirdeğin Y konumunu ve her fagosom (kırmızı kutu) birleştirin. Başka bir sütuna (mor kutu), c çekirdek ve SRBC ile a arasında bir dik üçgenin diğer iki tarafın uzunlukları b uzunluğunu (temsil fagozomun ve Pisagor teoremi ile çekirdeği arasındaki mesafe hesaplamak B). (C) Son olarak, zaman 0. başlangıç mesafeden belirli bir zamanda SRBC ve çekirdek arasındaki mesafeyi çıkarılarak her zaman (yeşil kutu) de fagozomların tarafından katedilen mesafe hesaplamak büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Kontrol ve HIV ile infekte olmuş hMDMs olarak fagosom taşıma hızının Şekil 5. belirlenmesi. (A) 'SRBC sadece SRBC içselleştirme sonra için, çekirdeğin doğru kat edilen mesafe ölçülerek zamana karşı grafiği çizilir. İlk 5 dakika boyunca kendi hız tablo yazılımı lineer regresyon kullanılarak hesaplanır. Temsili bir deney (Şekil 3-4 iç SRBC) gösterilir. (B) birinci 5 dakika boyunca tüm hızlar, HIV ile enfekte olmuş hücrelerde enfekte edilmemiş (5 donör) 'de 66 fagozomların 60 fagozomların (4 donörler) için ölçülmüştür. (Welch düzeltme ile eşleştirilmemiş Student t testi, ** p <0,01) Veri ± SEM ortalamasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1: temsili olmayan enfekte makrofajında fagozomun hareketi. . (Sağ indirmek için tıklayın) opsonize kırmızı kan hücrelerinin hareket dakikada bir görüntü (: mm ss olarak gösterilen zaman 46 fotoğraf) ile fagositoz 45 dakika boyunca BF kanalında tespit edildi. Çubuk = 10 um.
Film 2: temsilcisi HIV ile enfekte makrofajında fagozomun hareketi. (Sağ indirmek için tıklayın). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) makrofajlar 491 lazer ile aydınlatma sonrasında tespit edilmiştir ile enfekte. opsonize kırmızı kan hücrelerinin hareketi 45 boyunca BF kanalında tespit edildiDakikada bir görüntü (: mm ss olarak gösterilen zaman 46 fotoğraf) ile fagositoz dak. Çubuk = 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu teknik pek çok kritik adımlar vardır. enfeksiyon yüzdesi donör bağımlı olduğundan İlk olarak, HİV-1 ile hMDMs hazırlanması ve enfeksiyon önemlidir. Potansiyel in vivo virüs tarafından karşılaşılan makrofajlar durumu iyi şimdiye kadar karakterize edilmemiştir, çünkü notun, biz, enfeksiyon öncesinde in vitro polarize olmayan makrofajlar kullanmaya karar verdik. Bu makrofajlar de M1 veya M2 olduğunu gösteren çok sayıda yüzey markerlerinin ifadesiyle kontrol ve CD4 ve CCR5 ifade sunmaktadır. enfeksiyon oranları değişkendir ve 10 ila% 40 ve bazen daha değişir. mikroskop altında bir HIV-1 enfekte floresan hMDM bulmak zor olabilir bu yüzden değişken enfeksiyon oranıdır. Buna ek olarak, bir santrifüj aşamasında sonra hemen, bir HIV-1 enfekte hücresi bulmak için gereken süre, aynı zamanda toplama başlamadan bir gecikme olabilir. Fagositoz synchronizatio olmadan başlatılan olabilirbağlanması ve santrifüj ile üretilen alım n. Ancak, bu seçenek hücreleri ulaşmadan önce yüzer SRBClere için seçilmiş değildi. Bu boncuklar ile iyi bir seçenek olabilir. enfekte hücreleri bulmak için gerekli olan zamanı en aza indirmek için, ızgara cam alt yemekler fagositoz testinde başlatmaya devam etmeden önce, HIV-1 ile enfekte hMDMs tanımlamak için kullanılabilir. çevrelerindeki SRBClere bir "makul" numarasına sahip Seçilen HIV ile enfekte hücreler daha sonra hızlı bir şekilde satın almalar başlatmak için seçilecektir. "Makul SRBC miktar" fagozomların maskeleme harici SRBClere önlemek için çok en az 10 hücre başına SRBClere ve olması için yeterli demektir.
Buna ek olarak, verimli tanıma ve alım hücreleri tarafından olacak sağlamak için opsonizasyon koşullarını optimize etmek önemlidir. FcR aracılı fagositoz yapısal ve hMDMs rutin FcR aracılı alınmasının, çok etkili bulunmaktadır. Buna ek olarak, doğru fagositoz için, Koşullar b zorunda37 ° C'de ısıtma odası optimum E ve% 5 CO2. Fagositoz tahlil başlamadan önce gaz ve sıcaklığı kontrol etmek gereklidir.
Nihayet, iç fagozomların dış SRBClere ayrımcılık ve BF kanalda çekirdeğin kimlik ImageJ yazılım üzerinde analiz için önemlidir. Bu kanalın ayarları önemli nedeni budur. Odak satın alma sırasında kaybetmiş olabilir göz önüne alındığında, biz fagosom hızı analiz için en uygun uçak var emin olmak için Z ekseninde görüntülerin yığınları kazanmak için önerilir. Her hücre için, tüm içsel SRBClere analiz etmek için tek bir alanda tek bir hücre olması tercih edilir. Lens seçimi önemlidir ve burada hücre boyutunda bir fonksiyonu olarak 2 lens kullanmış nedeni budur. bize 100X lens ile fagozomların izlemek için, ama bazen hücreler bu yüzden 63X lens geçmek zorunda çok büyük olduğu için daha kolay oldu. im hakkında düşünmeye zaman lensin seçimi de önemlidirHer iki lensler farklı x / y kalibrasyon ima çünkü ImageJ ve bir elektronik tablo tablosunu kullanarak yaş analizi.
Bu tekniğin ilk sınırlama istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar edinilen gereken numune sayısı. Biz çanak başına birkaç donör başına film ancak şu şartla başına genellikle en fazla 2 hücreleri, kayıt yaptırabilirler. Numuneler daha donörler ile deneyler tekrarlamak ya da mikroskop bağlı çok noktalı XY görüntüleme yapmak için vardır, bu sınırlamaya çözüm sayısını artırmak için. son yöntem rahatsızlık motorlu XYZ tarama sırasında odak potansiyel kaybıdır. Diğer bir sınırlama, hız el ölçümü otomatik analizine göre, uzun ve sıkıcı olmasıdır. Öncü çalışmalar MATLAB yazılımını bir izleme algoritması ile takip edildi balık derisi jelatin bağlanmış lateks boncuk 4'te tarif edilen şekilde, tam otomatik analizi için, floresan etiketli partikülleri kullanmak için gerekli olan. Floresan bir alternatif olabilir antikorlar veya boncuk opsonizasyon etiketli, ama onlar 1 saat fagositoz kaydederken bir sorun ağartma, tabidir. Diğer çalışmalar lateks boncuklar 13,14 kullandığını rapor etmiştir. Biz lateks boncuk içselleştirilmesi daha az kolaylıkla SRBClere alımı daha algılandığını ancak fark ettim. Gerçekten de, hücre içi geçiş kinetiğinin başlangıç noktası phagosomal hareket erken hataları tespit bilmek önemlidir.
Burada açıklanan yöntemin temel avantajı, basitliği ve serbest yazılım kullanılmasıdır. ImageJ yazılımı kullanarak manuel izleme gerçekleştirmek için, biz böylece biz fagozomun ve çekirdek arasındaki mesafe hesaplamak için Pisagor teoremini kullanmak ve sonra hız olması gerekir, fagozomun ve çekirdeğin konumunu kullanmak zorunda tablo yazılımı lineer regresyon. Bu 3 adım analiz & # ile ICY yazılımına, bir adım, izleme indirgenebilir34;. Manuel İzleme "eklentisi çıkış verileri daha sonra, doğrudan parçacık hızı takip ve daha özel olarak (örneğin, fagozomların ve çekirdeği olarak) 2 grupları arasındaki nispi hız Son olarak, hesaplama göreceli hızını ölçmek için imkan tanımaktadır. bir parçacık da hareketli olabilir başka bir parçacığa karşılaştırdı.
Bu yaşam time-lapse analiz gelecekteki potansiyel uygulama bakteriler, mantarlar, ya da hücre artıkları gibi parlak alanda görünür parçacıklar, için olabilir. Farklı tedaviler veya hücre merkezine doğru phagosomal hareketinin böyle bir rafine analizi yararlanacak phagosomal olgunlaşmasını ve makrofajların aktivasyonu özelliklerini değiştirmek için yeterli enfeksiyon koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
