活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

摘要

我们描述了一种利用旋转盘共聚焦荧光显微镜识别荧光标记的感染细胞，并结合明场显微镜检测吞噬体，以测量在感染或未感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的活细胞中向细胞中心移动的吞噬体速度的方法。

摘要

巨噬细胞是一类吞噬性细胞，在先天免疫与特异性免疫的交汇点发挥重要作用。巨噬细胞可被人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染，由于其对病毒的细胞病变效应具有抵抗性，因此可被视为持续存在的病毒储存库。此外，感染HIV的巨噬细胞表现出功能缺陷，这有助于机会性疾病的产生和发展。

HIV-1 损伤巨噬细胞吞噬反应的确切机制此前尚不清楚。我们先前已证明，当巨噬细胞感染 HIV-1 后，其对多种颗粒物质的摄取能力受到抑制。这种抑制仅为部分性，且在 HIV 感染的巨噬细胞中仍可形成吞噬体。因此，我们聚焦于分析这些吞噬体的命运。吞噬体成熟过程伴随着这些区室向细胞中心迁移，并与溶酶体融合，形成负责降解摄入物质的吞噬溶酶体。我们采用 IgG 包被的绵羊红细胞作为吞噬作用的靶标。为了测量单个 HIV 感染巨噬细胞中吞噬体向心运动的速度，我们结合使用了明场和荧光共聚焦显微镜技术。我们建立了一种方法，用于计算吞噬体与细胞核之间的距离，进而计算吞噬体的运动速度。HIV 感染细胞通过表达 GFP 的病毒进行识别，但该方法同样适用于未感染细胞或任何其他类型的感染或处理条件。

引言

巨噬细胞在先天免疫系统和机体稳态中发挥重要作用。它们是专职的吞噬细胞，通过一种称为吞噬作用的过程内化并清除病原体和细胞碎片^1,2。在颗粒物质被吞噬后形成的封闭结构称为吞噬体，其会与胞内体区室发生一系列融合和分裂事件，最终形成具有降解功能的吞噬溶酶体。该区室因获得质子泵v-ATPase而呈现酸性pH环境，含有水解酶，并富含溶酶体相关膜蛋白（LAMPs）。吞噬体的成熟过程伴随着其沿微管向细胞中心迁移^3,4，最终到达核周区域，此处聚集了大量溶酶体。

已有多种病原体被报道可劫持吞噬体成熟过程，包括一些具有胞内生活方式的细菌，它们会修饰自身所处的囊泡环境⁵。人类免疫缺陷病毒（HIV）-1除感染T细胞外，还可靶向巨噬细胞。与T细胞不同，巨噬细胞对病毒的细胞病变效应具有抗性，因此可被视为病毒的储存库。此外，感染HIV-1的巨噬细胞表现出吞噬功能缺陷，并促进机会性疾病的出现。特别是，由伤寒沙门菌鼠伤寒血清型ST313（Salmonella Typhimurium ST313）引起的严重侵袭性非伤寒沙门菌病，在过去三十年中在中国台湾撒哈拉以南非洲的HIV感染儿童和成人中广泛流行⁶。据估计，与未感染HIV的人群相比，HIV感染者患结核病的风险高出20倍以上。

基于上述所有原因，明确HIV感染巨噬细胞中吞噬功能缺陷的分子机制显得尤为重要。....

方案

该方案必须严格依照国家和国际法律法规以及当地规定执行。用于实验的健康献血者血液来自与各机构签署协议的血液中心，且献血者已知情同意将其血液用于科研目的。使用人血时必须采取特殊防护措施。根据当地法规，HIV-1相关实验必须在生物安全三级或二级（BSL-3 或 2）实验室中进行。

1. 通过密度梯度离心及贴壁筛选法准备人单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）

1. 从健康供体采集新鲜血液（9 ml），将全部体积的新鲜血液用无钙的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释²⁺ 和 Mg²⁺ 以获得终体积70 ml，将稀释后的血液轻柔加入两个50 ml锥形管中（每管35 ml），每管内已预先加入15 ml中性、高度支化、高分子量、亲水性多糖溶液。
2. 将两管血液在537 × g下离心20分钟，温度为 20 °C 不刹车。然后收集位于界面处浑浊细胞环中的外周血单个核细胞（PBMCs），并将其转移至含有15 ml不含Ca²⁺的1x PBS的新50 ml离心管中²⁺ 和 Mg²⁺.
3. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C 并将沉淀重悬于45 ml不含Ca的1x PBS中²⁺ 和 Mg²⁺.
4. 以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C，将沉淀重悬于10 ml不含Ca的1....

结果

本文描述了利用IgG包被的绵羊红细胞（SRBCs）作为模型靶标，检测HIV-1感染与未感染人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）中Fc受体介导的吞噬作用的方法（图1）。该实验方案的关键步骤包括hMDMs的制备以及HIV-1感染。事实上，不同供体来源的巨噬细胞分化产量和质量存在差异，且HIV-1感染效率通常在10–40%之间。此外，IgG包被SRBCs的制备也至关重要，需避免损伤红细胞，否则可能导致红细胞被识别为细胞碎片而被非特异性摄取，而非通过Fc受体介导的吞噬作用被摄取。充分的包被可确保高效的吞噬作用。

在生物安全三级实验室中，使用旋转盘共聚焦显微镜的明场通道对活体HIV感染巨噬细胞内吞噬体的运动进行实时分析。明场通道的设置对于观察细胞核（图2，蓝色圆圈）以及区分外部红细胞（图2，红色箭头）与已内化的SRBCs（图2，.......

讨论

该技术包含若干关键步骤。首先，人源单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）的制备及其感染HIV-1的过程至关重要，因为感染率依赖于供体差异。值得注意的是，我们选择使用未极化的巨噬细胞 体外 感染前，因为病毒可能遇到的巨噬细胞状态 体内 迄今为止尚未得到充分表征。我们检测了多种表面标志物的表达，结果表明这些巨噬细胞既不属于M1型也不属于M2型，并验证了CD4和CCR5的表达。感染率存在差异，范围在10%至40%之间，有时更低。这种可变的感染率导致在显微镜下难以找到HIV-1感染的荧光标记hMDM细胞。此外，在离心步骤后立即寻找HIV-1感染细胞所需的时间也可能导致成像采集的启动延迟。吞噬作用可在不依赖离心所引起的结合与内吞同步化的情况下启动。然而，该方案不适用于在到达细胞前会漂浮的SRBCs，但对于微珠则可能是一个可行的选择。为了最大限度缩短寻找感染细胞所需时间，可在进行吞噬实验前使用带网格的玻璃底培养皿来定位HIV-1感染的hMDM细胞。所选定的HIV感染细胞具有 "合理的" 其周围的SRBC数量将被迅速选定以开始采集。 "适量SRBC" 意味着每个细胞至少含有10个SRB.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Falcon 100 mm 细胞培养皿（经TC处理）	康宁	353003	用于病毒制备
35 mm 未包被玻璃底培养皿 1.5	MatTek 公司	P35G-1.5-14-C 型外壳	用于采集
Falcon 细胞培养板 6 孔	赛默飞世尔科技	Corning. Inc. 353934	人单核细胞来源的巨噬细胞
Ficoll-Plaque PLUS	Dominique Dutscher	17-1440-03	一种中性的、高度分支的、高分子量的亲水性多糖溶液，用于密度梯度离心
不含钙、镁的DPBS	赛默飞世尔科技	14190-094	RT
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）1×，液体（高葡萄糖）	GIBCO，Molecular Probes	31966-021	4℃ 保存 °C；用于HEK细胞培养
RPMI 1640 培养基 GLUTAMAX  补充材料	Life technologies	61870-010	4℃下保存 °C；用于hMDMs培养
Fœ胎牛血清（FCS）	Eurobio	CVFSVF0001	-20℃保存 °C ；去补体
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	赛默飞世尔科技	15140-122	-20℃保存 °C；用于hMDMs培养
RPMI 1640 培养基，无酚红（10×500 ml）	Life technologies	11835-105	37℃预热 °使用前将水浴预热至37°C；用于吞噬作用检测
FuGENE6 转染试剂	Promega	E2692	4℃下保存 °C；用于病毒生产
绵羊红细胞（SRBCs）	Eurobio	DSGMTN00-0Q	在4℃的Alsever缓冲液中保存 °使用前置于 C
抗绵羊红细胞IgG	MP Biomedicals	55806	4℃下保存 °C
牛血清白蛋白热激组分，pH 7 ≥98%	Sigma	A7906	-20℃保存 °C
倒置显微镜 DMI600	Leica
共聚焦旋转盘装置  CSU-X1M1	横河
491 nm 50 mW 激光器	COBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS 物镜	Leica		物镜；放大倍数 100X；数值孔径 1.40；浸油
CoolSnap HQ2（FireWire）相机	光度测量		像素大小 6.45 µm × 6.45 µ米；定义 1,392 x 1,040；以14位对图像进行编码
Metamorph 7.7.5 软件	Molecular Devices		显微镜的控制
GraphPad Prism 软件			用于统计分析