Protocol
Protokollen må utføres i henhold til nasjonale og internasjonale lovgivning og lokale forskrifter. Blod fra friske givere som ga sitt samtykke til å donere blod til forskningsformål er innhentet fra blodgiversentre som institusjonene har undertegnet avtalen. Spesielle beskyttelse må tas ved bruk av menneskeblod. Eksperimenter med HIV-1 må utføres i et biosikkerhetsnivå 3 eller 2 (BSL-3 eller 2) laboratorium i henhold til lokal lovgivning.
1. Utarbeidelse av menneskelig Monocyte makrofager (hMDMs) ved Densitetsgradientsentrifugering og utvelgelse av Limingen
- Start med friskt blod fra friske donorer (9 ml). Fortynn hele volumet av friskt blod med steril 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca2 + og Mg2 + for å oppnå et sluttvolum på 70 ml og tilsett det fortynnede blodet inn i to 50 ml koniske rør (35 ml per rør) , på toppen av 15 ml av eneutral, sterkt forgrenede, med høy masse, hydrofilt polysakkarid i oppløsning allerede i hvert rør.
- Sentrifugerør begge rør av blod ved 537 xg i 20 min ved 20 ° C uten brems. Deretter samle de perifere mononukleære blodceller (PBMC) som inneholdes i overskyet cellen ring ved grenseflaten og overføre dem til et nytt 50 ml rør inneholdende 15 ml 1 x PBS uten Ca2 + og Mg2 +.
- Sentrifuger cellene ved 218 xg i 5 minutter ved 20 ° C og resuspender pelleten i 45 ml av 1 x PBS uten Ca2 + og Mg2 +.
- Sentrifuger cellene ved 218 xg i 5 minutter ved 20 ° C, resuspender pelleten i 10 ml 1 x PBS uten Ca2 + og Mg2 +, og telle cellene ved fortynning til en endelig fortynning på 1/200 i trypanblått.
- Sentrifuger cellene ved 218 xg i 5 minutter ved 20 ° C og resuspender pelleten i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium supplert med 2 mM L-glutamin og 100 ug / ml penicillin-streptomycin å ha 7 x 10 6 PBMC per brønn i 2 ml medium i hver brønn av en 6 brønners plate.
- Inkuber platene ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 timer. Etter 2 timer monocyttene vil ha klebet til plast.
- Å tillate ferskt isolerte monocytter til å differensiere i hMDMs, aspirer medium og erstatte den med 2 ml hMDM medium (RPMI 1640, 10% dekomplementert føtalt kalveserum (FCS), 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin) supplert med rekombinant humant makrofag-kolonistimulerende faktor (RHM-CSF) ved en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ml.
- Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO2 i 11 dager (figur 1).
- På dag 11 fjernes mediet og vask 2 ganger med 2 ml kald hMDM medium per brønn. Neste vask hver brønn 2 ganger med 1 ml kald 1 x PBS.
- Slik kobler fullt differensierte hMDMs, vask hver brønn en gang med 1 ml kald 1x PBS med 2 mm ethylenediaminetetraacetatic syre (EDTA) og inkuberes cellene i 2 ml kald PBS 1x med 2 mM EDTA per brønn i 15-60 minutter ved 4 ° C.
MERK: Alternative metoder for å løsne cellene eksisterer (for eksempel trypsin eller trypsin-lignende aktiviteter) som kan gi gode resultater 11. - Etter avløsning (fullført ved å pipettere forsiktig opp og ned i brønnen), samle cellene og legg dem i en 50 ml tube på is som inneholder 10 ml kaldt hMDM medium.
- Sentrifuger cellene ved 218 xg i 5 minutter ved 20 ° C, resuspender pelleten i 10 ml kald hMDM medium og tell cellene ved å fortynne 1/20 i trypanblått.
- Seed cellene ved 1 x 10 6 hMDMs per 35 mm mikros klasse glassbunn fatet og inkuber platene ved 37 ° C med 5% CO 2 for en dag.
2. Produksjon og Kvantifisering av HIV-1 viral Stocks
MERK: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (grønt fluorescerende protein) bærer en R5-tropisk konvolutt, gave fra M. Schindler 10 blir brukt til å infisere og makrofager for å se infiserte celler i sanntid.
- Produsere virale bestander ved transfeksjon av humane embryonale nyreceller 293T (2 x 10 6 i 100 mm skål) med 6 ug av den tilsvarende proviralt DNA ved å bruke et kommersielt transfeksjon reagens.
- Kvantifisere smittsomhet av virusforråd ved hjelp av indikatorcellene HeLa TZM-Bl (bærer ß-galaktosidase-genet under kontroll av HIV-1 LTR) ved å anvende seriefortynninger av de virale aksjer fulgt av en P-galaktosidase farging av cellene og telling av blå celler 12.
3. Infeksjon av hMDMs med HIV-1
- Tilsett virus ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) 0,02 til 0,03 i 1 ml hMDM medium til hMDMs (celler belagt på 1,13). For å kontrollere brønner legge bare ett ml hMDM medium og inkuber rettene ved 37 ° C med 5% CO 2 for 2 dager (figur 1).
- På dag to vaske cellene med hMDM MedIUM 3 ganger og tilsett 1 ml frisk hMDM medium per parabolen. Inkuber cellene ved 37 ° C med 5% CO2 i 6 dager (figur 1).
4. opsonization av sauerødblodceller
- For fremstilling av 7 x 10 6 SRBCs pr fatet, vaske SRBCs to ganger i 100 pl løsning som inneholdt 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS med sentrifugering ved 600 x g i 4 minutter.
- Resuspender de vaskede SRBCs i 500 pl 1 x PBS / BSA 0,1% med kanin IgG anti-SRBCs ved et sub-agglutinerende konsentrasjon pr 5 ul SRBCs og inkuber med rotasjon ved RT i 30 min.
MERK: For å bestemme under agglutinating konsentrasjon av anti-SRBCs IgG, forberede serielle fortynninger av IgG (lager konsentrasjon på 13,1 mg / ml) fra 1/50 til 1/25 600 i 20 mL i en 96-brønns plate. Tilsett 2 x 10 6 SRBCs i 20 mL i hver brønn og sette platen i et mørkt rom i løpet av flere timer. Under agglutiner-konsentrasjonen erfortynning av brønnen før brønnen med agglutinasjon (IgG + SRBCs danner et nettverk). - Etter rotasjon, sentrifuger IgG-opsoniserte-SRBCs ved 600 xg i 4 minutter og vask med 100 ul av 1 x PBS / BSA 0,1% med sentrifugering ved 600 x g i 4 minutter.
- Resuspender IgG-opsoniserte-SRBCs i forvarmet fenolrødt-fritt RPMI-medium supplert med 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin (1 ml / skål).
5. Levende Cell Video Mikros Fagocytose analysen
- Bruke et konfokalt avbildningssystem som for eksempel en roterende platesystemet er utstyrt med et varmekammer ved 37 ° C med CO2 som passerer gjennom en flaske med vann for fukting.
- Slå på varmekammeret før forsøket for å ha den objektbord ved 37 ° C før begynnelsen av fagocytose analysen. Slå på mikroskopet og datamaskinen, og laste bildebehandlingsprogrammer.
- Optimalisere bildeinnstillinger som skanning hastighet, Magnification, oppløsning, etc. for å ha i det minste én celle i hvert felt, og å avbilde en ramme hvert minutt mellom 60 til 120 min.
MERK: Her blir prøven avbildes en ramme hvert minutt under 60 min med 63x objektiv. - Plasser bilde fatet på mikroskopet scenen. Juster fokus og stedet å finne bare en hel HIV-1 infiserte makrofagen i feltet. Bruk passende eksitasjon / utslipps innstillinger basert på den brukte bildebehandlingssystem og sonde. Inkluder en lys feltet (BF) kanal for å observere phagosomes (figur 1ii). Optimal utseendet av de forskjellige kanal bildene ved å justere andelen av overført lys og eksponeringstid.
MERK: Her NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP var spent ved hjelp av en 491 nm laser med 50 ms tidseksponering med 20% av laser (figur 1i). - Fjern bilde fatet og tilsett 1 ml SRBC suspensjon på 7 x 10 6 SRBCs / ml til parabolen (figur 1).
- Sentrifuger ved 500 xg for2 minutter ved romtemperatur for å synkronisere fagocytose, notere tiden ved slutten av denne sentrifugering, og returnere parabolen til scenen.
- Optimalisere fokus og fangst GFP og BF bilder i Z-stabler (hele tykkelsen av cellen med en step-avstand på 0,3 mikrometer - vanligvis 20 flyene) hvert minutt i minst en time. Lagre time-lapse video på mors fil-formatet brukt bildebehandlingssystemet.
MERK: Her ble time-lapse filmer lagret i opprinnelig format, * .stk filer.
6. Analyse av Time-lapse filmer
- For videoredigering, klikk på rullegardinmenyen "Apps" og på fanen "omtale Multi Dimensional data" i programvare for videoredigering.
- For å åpne filen, klikk på "Select Base File" og deretter på "Velg Directory". I "datasett" boksen velger oppkjøpet å analysere (i .nd format) og klikk på "View". De data som er representert i en tabell med tid i kolonne en id Z-plan i linjen.
- Å representere infeksjon i en Z-projeksjon (figur 2, venstre panel), velger du 491 nm bølgelengde i "bølgelengder" boksen og klikk på "Z projeksjon" fanen med "alle plan".
- Å analysere en tidssekvens, velger BF bølgelengde i "bølgelengder" boksen og velge den optimale plan på Z-aksen for å skille eksterne SRBCs (figur 2, rød pilspiss), interne SRBCs (figur 2, rød sirkel) og kjernen ( Figur 2, blå sirkel).
- Hvis du vil lagre video montasjer, klikk på "Selection [Xs]" -fanen og deretter på "Load Image (s)". Endelig lagre lastet bilder i tif-format og åpne dem neste på ImageJ programvare.
- Bruk plugin "manuell tracking" på ImageJ programvare for å måle posisjonen til kjernen og de ulike phagosomes observert i BF kanal (figur 3).
- Download "Manuell Tracking" plugin på ImageJ nettstedet. På ImageJ, åpne plugin og bildesekvensen som skal analyseres (Figur 3, trinn 1 og 2).
- Angi innstillinger som "Tidsintervall" som representerer tid mellom tilstøtende rammer, og "x / y kalibrering" som representerer avstanden per piksel (Figur 3, trinn 3).
MERK: Her lagrer bildesekvensen med et tidsintervall på 1 min mellom hvert bilde og x / y kalibrering av 0,205 mikrometer fordi 63X zoom og et kamera med pikselstørrelse på 6,45 x 6,45 mikrometer 2 brukes. - For å starte sporing, klikk på "Legg track" (Figur 3, trinn 4) og klikk på en SRBC senter på første gang når det er internalisert. Den neste ramme vises automatisk.
- Fortsett å klikke på SRBC senter i alle rammer for å ha forskjellige posisjoner i løpet av tiden (Figur 3, trinn 6 i rød boks).
- Begynn å spore kjernen til å ha sin posisjon i alle rammer ved å klikke på midten. Neste spore phagosomes (ved å klikke på midten) en etter en på den tiden (ramme) av deres intern, forskjellig i funksjon av SRBCs. For enkelhets skyld å se SRBC på BF kanal, bruke "Lysstyrke og kontrast" vinduet under sporing (Figur 3, trinn 5).
- Mellom hver SRBC sporing, klikk på "Legg track" (Figur 3, trinn 4) for å ha et nytt spor. Antallet sporings vil bli endret i den andre kolonnen, "Track n °" i resultattabellen (Figur 3, trinn 6).
- Lagre dataene i et regneark for å fortsette til neste trinn av analysen.
- Bruk regneark programvare for å beregne den distanse av phagosomes innehold SRBCs mot kjernen og hastigheten av de phagosomes i løpet av de første 5 minutter etter internalisering av SRBCs (Fifigur 4).
- Åpne regnearket bord og et nytt regneark-fil. Overføre til denne nye fil følgende parametere bare, tid, x- og y-koordinat for kjernen og alle SRBCs (Figur 4A).
- For å beregne avstanden mellom SRBCs og kjernen med bare sine koordinater, vurdere kjernen og en SRBC i en XY-koordinatsystem plan (figur 4B).
MERK: Avstanden mellom to punkter er lengden av banen som forbinder dem. I flyet, er avstanden mellom SRBC og kjernen gitt av Pythagoras 'læresetning.- Dersom c (avstanden mellom kjernen og den SRBC) angir lengden av hypotenusen og a og b betegner lengdene av de to andre sider, uttrykker Pythagoras 'teorem som den pytagoreiske ligning:
MERK: På samme tid, på den ortonormale, den horisontale avstanden er (x kjernen -x SRBC) og den vertikale avstanden b er (y kjernen y SRBC). - Således, beregne avstanden mellom kjernen og den SRBC (figur 4A, lilla ruten) ved å:
MERK: Multipliser innhentet avstandsverdien (i piksler) med x / y kalibrering for å få avstand i mikrometer. Her er x / y kalibrering 0,205 mikrometer. - Ved hver gang, trekke avstanden mellom kjernen og den SRBC til den første avstand (figur 4C).
- Plott måling mot tiden for de første 5 min. Anvende en lineær trend-linje (figur 5A) for å plottet og bestemme helningen av den lineære trendlinjen som representerer den phagosome hastighet mot kjernen i løpet av de første 5 minutter etter SRBC-internalisering.
- Sammenstille data for å beregne gjennomsnittlig og statistisk feil avhastighets verdier og plotte dem i en passende form ved hjelp av den aktuelle programvaren (figur 5B).
- Dersom c (avstanden mellom kjernen og den SRBC) angir lengden av hypotenusen og a og b betegner lengdene av de to andre sider, uttrykker Pythagoras 'teorem som den pytagoreiske ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FcR-mediert fagocytose av HIV-1-infiserte og ikke-infiserte hMDMs er beskrevet her ved hjelp av IgG-opsoniserte SRBCs som modell mål (figur 1). De kritiske trinnene i denne protokollen er utarbeidelsen av hMDMs og infeksjon med HIV-1. Faktisk varierer utbyttet og kvaliteten av differensierte makrofager blant givere, samt infeksjonsraten med virkningsgrader i området 10-40%. I tillegg er fremstillingen av IgG-opsonisert-SRBCs også viktig for å unngå skade på erytrocytter, fordi dette kan forårsake deres gjenkjennelse og opptak som avfall i stedet for ved FcR-mediert fagocytose. Optimal opsonization vil sikre effektiv fagocytose.
Phagosome bevegelse i levende HIV-infiserte makrofager blir analysert i sanntid med BF kanal på en roterende disk konfokalmikroskop i BSL-3 laboratorium. Innstillingene for BF-kanalen er kritiske to se kjernen (figur 2, blå sirkel) og for å skille den eksterne (figur 2, røde pilspisser) fra intern SRBCs (Figur 2, røde sirkler). BF mikroskopi er betraktet som den enkleste optisk mikroskopi belysning teknikk er tilstrekkelig til å se phagosomes, som er mindre enn lysbrytende de ytre SRBCs.
Det første trinnet etter oppkjøpet av bildesekvenser er manuell tracking på ImageJ programvare (figur 3). Dette punktet kan være særlig lang og kjedelig, fordi det er foretrukket å spore hvert phagosome, en etter en for alle bildesekvenser, og det anses at eksperimenter må gjentas med minst 3 donorer pr betingelse for å oppnå en stor nok prøvestørrelse for statistisk analyse (minst 30 phagosomes med 3 forskjellige donorer).
Det andre trinnet er analyseni regneark programvare for å beregne phagosome hastighet i løpet av de første 5 minutter etter internalisering for hver internalisert SRBCs (figur 4). For dette, plotte vi for hver phagosome distanse i løpet av første 5 min mot tiden. Et representativt eksempel er vist i ikke-infiserte hMDMs på figur 5A. Neste får vi hastigheten av phagosome, som er helningen av den lineære regresjonskurve. En hastighet på 0,5384 um / min ble funnet for dette phagosome.
Av notatet, er det mulig å analysere phagosome hastighet i løpet av de første minuttene etter at internalisering, som beskrevet her eller i Dumas et al. 8, eller senere ved å analysere hastigheten over lengre tidsskalaer. I vår studie, observerte vi at phagosome hastighet i løpet av første 5 min etter intern hos HIV-infiserte hMDMs er lavere sammenlignet med ikke-infiserte hMDMs (figur 5B).
Figur 1. Fremstilling av kontroll og HIV-infiserte hMDMs for fagocytose avbildning. Monocytter blir renset ved adhesjon (1) og differensiert til makrofager i 11 dager med M-CSF (2). Deretter blir hMDMs infisert med HIV-NLR4.3 1Gag-iGFP i) ved en MOI mellom 0,02 og 0,03 i 8 dager med vasking på dag 2 (3). (4) IgG-opsoniserte SRBCs er lagt inn på hMDMs for fagocytose under en time. De phagosomes inneholder SRBCs kan påvises på BF bilder (rød sirkel, ii). Bildene er fra Servier bilder database. Bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sanntids oppkjøp i løpet avfagocytose av representative kontroll og HIV-infiserte hMDMs. hMDMs fremstilles og infisert som beskrevet i figur 1. De NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infiserte celler blir detektert med 491 nm laser. Z-stabler av spinnende disk confocal bilder er kjøpt og analysert ved hjelp av både mikroskop oppkjøpet programvare og ImageJ (venstre panel). Gallerier av BF bildene representerer en ikke-infisert (øverst paneler tilsvarer Movie 1) og en NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP infiserte (bunnplater som tilsvarer Movie 2) celle i løpet av en 45 min oppkjøp (46 bilder med tid angitt som hh : mm). Cellemembranen (stiplet svart linje), kjernen (blå sirkel), de eksterne SRBCs (noen av dem merket med røde pilspisser) og de interne SRBCs (noen av dem merket med røde sirkler) kan påvises på BF bilder. Bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Instruksjons trinnene for bildeanalyse med manuell tracking plugin på ImageJ. Etter åpning av "Manual Tracking" plugin (1) og lasting av time-lapse video i BF kanal (2), skriv parametrene av transaksjonen (3). Klikk på "Legg track" (4) og starte målingen av sporings ved å klikke på en phagosome (5) for å få et nytt vindu med X og Y-posisjonene til den valgte phagosome (6, rød boks). Å følge phagosome på tidsplanen for enkelhets skyld, varierer lysstyrken og kontrasten (5 '). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Instruksjons trinn for dataanalyse av phagosome migreringshastighet i regnearkprogram. (A) sammen de X- og Y-posisjonen til kjernen og hver phagosome (rød boks) i et regneark tabell. I en annen kolonne (lilla boks), beregne avstanden mellom phagosome og kjernen med Pythagoras 'læresetning, hvor c representerer lengde mellom kjernen og den SRBC og a og b lengdene av de to andre sidene av en rettvinklet trekant ( B). (C) Endelig beregne avstanden som de phagosomes på hver gang (grønn boks) ved å trekke avstanden mellom SRBC og kjernen på et gitt tidspunkt fra den første distanse på tidspunktet 0. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
p_upload / 54568 / 54568fig5.jpg "/>
Figur 5. Kvantifisering av phagosome migreringshastighet i kontroll og HIV-infiserte hMDMs. (A) For hver SRBC og like etter SRBC internalisering, er tilbakelagt distanse mot kjernen målt og plottet mot tiden. Dens hastighet i løpet av første 5 min er beregnet ved bruk av lineær regresjon i regneark programvare. Et representativt forsøk er vist (den indre SRBC på figur 3-4). (B) Alle hastigheter i løpet av første 5 min er målt for 66 phagosomes i ikke-infiserte (5 donorer) og 60 phagosomes i HIV-infiserte celler (4 donorer). Data representerer gjennomsnitt ± SEM (unpaired Student t-test med Welch korreksjon; **, p <0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: Phagosome bevegelse i et representativt ikke-infiserte makrofag. . (Høyreklikk for å laste ned) Bevegelsen av opsoniserte røde blodceller ble oppdaget i BF kanal under 45 min av fagocytose med ett bilde per minutt (46 bilder med tid angitt som tt: mm). Bar = 10 mikrometer.
Movie 2: Phagosome bevegelse i et representativt HIV-smittet makrofag. (Høyreklikk for å laste ned). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) -infected makrofager ble identifisert etter belysning med 491 laser. Bevegelsen av opsoniserte røde blodceller ble påvist i BF kanal i løpet av 45min av fagocytose med ett bilde per minutt (46 bilder med tid angitt som tt: mm). Bar = 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken har flere kritiske trinn. For det første er fremstillingen av hMDMs og deres infeksjon med HIV-1 kritisk fordi prosentandelen av infeksjonen er donor avhengig. Av notatet, har vi besluttet å bruke makrofager som ikke er polarisert in vitro før infeksjon, fordi statusen til makrofager potensielt støtt av viruset in vivo ikke har blitt godt preget så langt. Vi kontrollert ekspresjon av flere overflatemarkører, noe som indikerer at makrofagene er verken M1 eller M2, og bekreftet ekspresjon av CD4 og CCR5. Infeksjonen priser er variabel og varierer fra 10 til 40%, og noen ganger lavere. Denne variabelen infeksjonsraten er grunnen til at det kan være vanskelig å finne en HIV-1 infiserte fluorescerende hMDM under mikroskopet. I tillegg kan den tiden som trengs for å finne en HIV-1 infiserte cellen umiddelbart etter sentrifugeringstrinnet også føre til en forsinkelse i å starte oppkjøpet. Fagocytose kan iverksettes uten synchronization av binding og opptak generert ved sentrifugering. Men dette alternativet ble ikke valgt for SRBCs som flyter før de når cellene. Det kan være et godt alternativ med perler. For å minimere tiden det tar å finne infiserte celler, kunne gitterglassbunn retter anvendes for å identifisere HIV-1-infiserte hMDMs før fortsetter å starte fagocytose analysen. De valgte HIV-infiserte celler som har en "rimelig" antall SRBCs rundt dem vil da bli valgt raskt å starte oppkjøp. "Rimelig SRBC mengde" nok til å ha minst 10 SRBCs per celle og ikke for mange å hindre at eksterne SRBCs fra maskering phagosomes.
I tillegg er det viktig å optimalisere opsonisering forhold for å sikre at det vil være effektiv gjenkjennelse og opptak av cellene. FCR-mediert fagocytose er konstituerende og hMDMs er rutinemessig svært effektiv i FcR-mediert opptak. I tillegg, for riktig fagocytose, forholdene måtte be optimalt med varmekammer ved 37 ° C og 5% CO2. Det er nødvendig å kontrollere gass og temperaturen før den fagocytose analysen.
Endelig diskriminering av eksterne SRBCs fra interne phagosomes og identifisering av kjernen i den BF kanal er viktige for analyse på ImageJ programvare. Dette er grunnen til innstillingene for denne kanal er viktige. Gitt at fokus kan gå tapt under oppkjøpet, anbefaler vi å kjøpe stabler av bilder i Z-aksen for å være sikker på å ha den optimale plan for å analysere phagosome hastighet. Det er å foretrekke å ha en enkelt celle i et felt for å analysere alle internalisert SRBCs for hver celle. Det er derfor linsen valget er viktig, og her har vi brukt 2 objektiver som en funksjon av cellestørrelsen. Det var lettere for oss å spore phagosomes med 100X objektiv, men noen ganger cellene var for stor, så vi måtte bytte til en 63X objektiv. Valget av objektivet er også viktig når du tenker på imalder analyse ved hjelp ImageJ og et regneark bord fordi begge objektivene implisere ulike X / Y-kalibreringer.
Den første begrensning av denne teknikken er det antall sampler som må anskaffes for å ha statistisk signifikante resultater. Vi kan registrere flere filmer per donor, men vanligvis ikke mer enn to celler per tilstand, per parabolen. Løsninger på denne begrensningen for å øke antall prøver er å gjenta eksperimentene med flere givere, eller for å gjøre flere punkter XY avbildning avhengig av mikroskop. Ulempe av den siste metoden er det potensielle tapet av fokus under motorisert XYZ skanning. En annen begrensning er at den manuelle kvantifisering av hastighet er lang og kjedelig sammenlignet med en automatisert analyse. For fullstendig automatisert analyse, er det nødvendig å bruke fluorescerende merkede partikler, som rapportert i banebrytende studier 4 med latekskuler koplet til fiskeskinn gelatin som ble fulgt med en sporingsalgoritme på Matlab programvare. Fluorescensmerkede opsonizing antistoffer eller perler kan være et alternativ, men de er utsatt for bleking, noe som er et problem ved opptak av fagocytose i 1 time. Andre studier rapporterer bruk av latekskuler 13,14. Vi bemerket imidlertid at internalisering av latexkuler er mindre lett oppdages enn opptaket av SRBCs. Faktisk startpunktet av kinetikken ved intracellulær migrasjon er viktig å vite for å påvise tidlige feil i phagosomal bevegelse.
Hovedfordelen ved fremgangsmåten som er beskrevet her er dens enkelhet og anvendelse av en fri-programvare. For å utføre manuell sporing ved hjelp av ImageJ programvare, må vi bruke posisjonen til phagosome og kjernen, og dermed må vi bruke Pythagoras 'teorem til å beregne avstanden mellom phagosome og kjernen, og å ha hastigheten etter en lineær regresjon i regneark programvare. Dette 3 trinn analysen kan reduseres til ett trinn, sporings, på isete programvare med & #34;. Manual Sporing "plugin Utgangs data blir deretter direkte hastigheten av partikkelen til å følge, og mer spesielt den relative hastighet mellom 2 grupper (for eksempel phagosomes og nucleus) Endelig tillater beregning oss til å måle den relative hastighet av. en partikkel forhold til en annen partikkel som kan være på vei.
Potensialet fremtidig bruk av denne levende time-lapse analyse kan være for synlige partikler i sterkt felt, som bakterier, sopp eller celleavfall. Forskjellige behandlinger eller infeksjon betingelser som er tilstrekkelig til å endre phagosomal modning og aktiverings egenskapene til makrofager vil dra nytte av en slik raffinert analyse av phagosomal bevegelse mot cellen sentrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
- Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
- Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
- Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
- Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
- Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
- Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
- Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).
