Protocol
이 프로토콜은 국내 및 국제 법규 및 지역 규정에 엄격한에 따라 수행되어야한다. 연구 목적으로 혈액을 기증 동의를 준 건강한 기증자로부터 혈액이 기관이 계약을 체결 한있는 수혈 센터에서 얻을 수있다. 인간의 혈액을 사용하는 경우 특별 보호는주의해야합니다. HIV-1과 실험은 3 또는 2 (BSL-3 또는 2) 연구소는 현지 법률에 따라 바이오 안전성 수준에서 수행해야합니다.
접착에 의한 밀도 구배 원심 분리 및 선택에 의해 인간 단핵구 유래 대 식세포 (hMDMs) 1. 준비
- 건강한 기증자 (9 ㎖)에서 신선한 혈액으로 시작합니다. 70 ml의 최종 용적을 수득 칼슘 및 마그네슘 2+없이 멸균 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 신선한 혈액의 전체 부피를 희석하고 부드럽게 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 희석 된 혈액을 추가 (튜브 당 35 mL) 중 , 15 ml의 상단에eutral가 높은 각 튜브 이미 용액에 높은 질량 친수성 다당류 지형.
- 브레이크없이 20 ° C에서 20 분 동안 537 XG에 혈액을 원심 분리기는 모두 튜브. 그런 계면 흐린 셀 링에 포함 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하고 칼슘 및 마그네슘 2+없이 1X PBS 15 ml를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브로 옮긴다.
- 원심 분리기 20 ° C에서 5 분 동안 218 XG에 세포와 칼슘 및 마그네슘없이 1X PBS 45 ml의에서 펠렛을 재현 탁 2+.
- 원심 분리는 20 ℃에서 5 분 동안 218 XG에서 세포는 칼슘 및 마그네슘 2+없이 1X PBS 10ml에 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루에 1/200의 최종 희석액으로 희석하여 세포 수를 계산.
- 20 ° C에서 5 분 동안 218 XG에 세포를 원심 분리기 1640 배지 2 mM의 L- 글루타민 및 100 μg의 / ㎖로 보충 된 RPMI penic (로스웰 파크 메모리얼 연구소)에 펠렛을 재현 탁illin - 스트렙토 6 웰 - 플레이트의 각 웰에서 배지 2 ㎖에 웰 당 7 × 106 PBMC를가하도록.
- 2 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어. 2 시간 후 단핵구는 플라스틱에 부착 된 것입니다.
- 갓 절연 단핵구가 hMDMs로 분화 배지를 흡인하고 보충 2ml의 hMDM 배지 (RPMI 1640, 태아 송아지 혈청 (FCS를 decomplemented 10 %), 2 mM L- 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신)로 교체 할 수 있도록하려면 재조합 인간 대 식세포 콜로니 자극 인자 10 ng를 / ml의 최종 농도 (RHM-CSF).
- 십일일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
- 하루에 11에서 매체를 제거하고 잘 따라 차가운 hMDM 매체의 2 ㎖로 2 회 씻는다. 다음 차가운 1X PBS 1 ml의 각 웰을 2 회 반복한다.
- (2 mM의 ethylenediaminetetraacetatic 산 차가운 1X PBS 1 ml의 각 웰에 1 시간을 씻어 완전히 차별화 된 hMDMs를 분리하려면EDTA) 및 4 ℃에서 15 내지 60 분 동안 잘 당 2 mM의 EDTA와 차가운 1X PBS 2 ㎖에 세포를 배양한다.
참고 : 세포가 존재 분리하는 다른 방법 (예를 들면, 트립신 또는 트립신 같은 활동) 좋은 결과 (11)을 줄 수 있습니다. - (상하 웰 부드럽게 피펫 완료) 분리 후, 세포를 수집하고 차가운 hMDM 배지 10 ㎖를 함유하는 얼음에 50 ㎖ 튜브에 넣어.
- 원심 분리는 20 ℃에서 5 분 동안 218 XG에 세포를 차가운 hMDM 배지 10ml에 펠렛을 재현 탁하고 트리 판 블루로 1/20 희석하여 세포 수를 계산.
- 35mm 현미경 수준의 유리 바닥 접시 당 1 × 10 6 hMDMs에서 세포를 시드 및 1 일 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 품어.
HIV-1 바이러스 성 주식의 2. 생산 및 정량화
참고 : NLR4.3 HIV-1 개그 - iGFP (녹색 형광 단백질) M. Schindl에서 R5-열대 봉투, 선물을 들고ER 10 마크로파지를 감염 실시간으로 감염된 세포를 참조하는 데 사용된다.
- 상업 형질 전환 시약을 사용하여 해당 프로 바이러스 DNA의 6 μg의 인간 배아 신장 293T 세포 (2 × 106에서 100mm 요리)의 형질 전환에 의해 바이러스 주식을 생성합니다.
- 세포 및 계수의 베타 갈 락토시다 착색 이어 바이러스 주식의 희석액을 사용하여 (HIV-1 LTR의 제어하에 베타 갈 락토시다 제 유전자를 함유) 헬라 TZM-BL 인디케이터 세포를 사용하여 바이러스 주식의 감염성 정량화 의 파란색 셀 (12)는.
HIV-1 hMDMs 3. 감염
- hMDMs (1.13 도금 세포)에 감염 (MOI)의 다양성에 hMDM 매체의 0.02-0.03 1 ml에 바이러스를 추가합니다. 우물 hMDM 매체의 1ml를 추가 제어하고 이일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 요리를 부화합니다.
- 하루에 2 hMDM 의대로 세포를 씻어3 회 IUM과 접시 당 신선한 hMDM 매체의 1ml를 추가합니다. 육일 (그림 1)에 대한 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어.
양 적혈구 4. 옵 소닌
- 접시 당 7 × 106 SRBCs의 제조를위한 4 분 동안 600 × g으로 원심 분리로 1X PBS에 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 용액 100 ㎕에 SRBCs 두 번 세척 하였다.
- SRBCs 5 μL 당 서브 응집 농도 토끼 IgG 형 SRBCs와 PBS / 0.1 % BSA 500 ㎕의 1X에서 세정 SRBCs을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 회전 배양한다.
주 : 안티 SRBCs의 IgG 서브 응집 농도를 측정 96 웰 플레이트에 20 ㎕의 1 / 25,600로 1/50에서 (13.1 ㎎ / ㎖ 농도에서 스톡)의 IgG의 희석액을 제조 하였다. 각 웰에 20 μl를 2 × 10 6 SRBCs을 추가하고 몇 시간 동안 어두운 방에서 접시를 넣어. 서브 응집 농도 인직전 잘 응집 (IgG를 + SRBCs 네트워크를 형성)로 잘 희석. - 회전 후 4 분 동안 600 XG에서의 IgG-옵 소닌 - SRBCs을 원심 분리하고 4 분 동안 600 XG에서 원심 분리하여 1X PBS / BSA 0.1 % 100 ㎕로 씻는다.
- 2 mM의 L- 글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 ㎖ / 접시)이 보충 된 예비 가온 된 페놀 레드없는 RPMI 배지에서의 IgG - 옵 소닌-SRBCs를 재현 탁.
5. 라이브 셀 비디오 현미경 탐식의 분석
- 이러한 CO 2의 가습을위한 물이 병을 통과하여 37 ℃의 가열 챔버를 구비 한 회전 디스크 시스템과 같은 촛점 이미징 시스템을 사용한다.
- 식세포 분석의 시작 전에 37 ℃에서 현미경 스테이지를 가지고 실험 전에 가열 실 켜기. 현미경과 컴퓨터를 켜고, 및 이미징 소프트웨어를로드합니다.
- 이러한 주사 속도 MAGNIFICAT로서 촬상 설정을 최적화이온, 해상도 등은 60 ~ 120 분 사이에 매 분마다 필드 당 이미지 한 프레임에 적어도 하나의 셀을 가지고 있습니다.
참고 : 여기에, 샘플 63X 렌즈와 함께 60 분 동안 하나의 프레임 분마다 이미징된다. - 현미경 무대에 영상 접시를 놓습니다. 초점을 조정하고 위치는 필드에 하나의 전체 HIV-1에 감염된 대 식세포를 찾을 수 있습니다. 사용 된 영상 시스템 및 프로브에 따라 적합한 여기 / 방출 설정을 사용합니다. phagosomes을 관찰 밝은 필드 (BF) 채널을 포함합니다 (그림 1II). 투과광 노광 시간의 비율을 조정함으로써, 상이한 채널 이미지의 모양을 최적화한다.
참고 : 여기에, NLR4.3 HIV-1 개그 - iGFP 레이저의 20 % (그림 1I)와 노출 시간의 50 밀리 초와 491 nm의 레이저를 사용하여 흥분했다. - 이미징 접시를 제거하고 접시에 7 × 10 6 SRBCs / ㎖ (그림 1)에서 SRBC 현탁액 1 ㎖를 추가합니다.
- 500 XG에 원심 분리기RT에서 2 분, 식균 작용이 동기화 원심의 끝 시간을 기록하고, 상기 스테이지에 접시를 반환한다.
- 적어도 1 시간 동안 매분 - (통상 20 평면 0.3 ㎛의 스텝 거리, 셀의 두께에 걸쳐) Z-스택의 초점 캡처 GFP 및 BF 이미지를 최적화한다. 사용 된 영상 시스템의 기본 파일 형식으로 시간 경과 비디오를 저장합니다.
참고 : 여기에, 시간 경과 영화가 네이티브 형식으로 저장된 * .stk 파일.
시간 경과 영화 6. 분석
- 비디오 편집 메뉴 '앱'다운 비디오 편집 소프트웨어의 탭에 "검토 다중 차원 데이터"에 드롭을 클릭합니다.
- 파일을 열려면 다음 "디렉토리 선택"에서 "선택 자료 파일"을 클릭합니다. "데이터가 설정"상자에서 (.nd 형식)을 분석하고 '보기'를 클릭 인수를 선택합니다. 데이터는 열 경시 표로 표현라인에서 D의 Z-계획.
- A ~ Z 프로젝션 (그림 2, 왼쪽 패널)에 감염을 표현하려면 "파장"상자에 491 nm 파장을 선택하고 "모든면"와 "Z 투사"탭을 클릭합니다.
- (시간 순서 분석은 "파장"상자에 BF 파장을 선택하고 외부 SRBCs (그림 2, 빨간색 화살표), 내부 SRBCs (그림 2, 빨간색 원)과 핵을 구별하기 위해 Z 축에 최적의 평면을 선택합니다 그림 2, 파란색 원).
- 비디오 몽타주을 저장하려면, "선택 [X]의"탭을 누른 다음 "로드 이미지 (들)"을 클릭합니다. 마지막으로,이 .tif 형식으로로드 된 이미지를 저장하고 ImageJ에 소프트웨어에 다음을 엽니 다.
- 핵의 위치와 BF 채널에서 관찰 된 다른 phagosomes (그림 3)을 측정하기 위해 ImageJ에 소프트웨어를 플러그인 "수동 추적"를 사용합니다.
- 다우ImageJ에 웹 사이트의 "수동 추적"플러그인을 nload. ImageJ에에서 (그림 3, 1 단계 및 2) 플러그인 및 이미지 시퀀스를 분석 할 엽니 다.
- 이러한 인접 프레임 사이의 시간의 양을 나타낸다 "시간 간격", 픽셀 당 거리를 나타내는 "X / Y 보정"(그림 3, 3 단계)로 설정을 입력합니다.
주 : 63X 크게하고 6.45 X 6.45 μm의 (2)의 화소 크기를 갖는 카메라를 사용하기 때문에 여기서, 각 프레임 및 0.205 ㎛, X / Y의 교정과 1 분의 시간 간격으로 화상 시퀀스를 저장한다. - 추적을 시작하려면 (그림 3, 4 단계) "트랙 추가"를 클릭하고이 내면화 될 때 제 시간에 SRBC 센터를 클릭합니다. 다음 프레임이 자동으로 나타납니다.
- 시간 동안 다른 위치 (그림 3, 빨간색 상자에 6 단계)가 모든 프레임에서 SRBC 센터를 클릭하여 계속합니다.
- 그 중심을 클릭하여 모든 프레임에서의 위치를 가지고 핵을 추적하기 시작합니다. 다음 시간 SRBCs의 기능에서 다른 자신의 내면화의 (프레임)에서 하나 하나 (중심을 클릭하여) phagosomes를 추적 할 수 있습니다. 편의 BF 채널에 SRBC를 참조하려면, 추적 (그림 3, 5 단계) 동안 "밝기 및 명암 대비"창을 사용합니다.
- 각 SRBC 추적 사이에 새로운 트랙을 가지고 (그림 3, 4 단계) "트랙 추가"를 클릭합니다. 추적의 수는 두 번째 열에서 변경되며, 그 결과 테이블의 "트랙 N °"(도 3, 단계 6).
- 분석의 다음 단계를 계속하기 위해 스프레드 시트의 데이터를 저장합니다.
- (핵 및 SRBCs의 국제화 후 첫 5 분 동안 phagosomes의 속도를 향해 SRBCs를 포함하는 phagosomes의 이동 거리를 계산하기 위해 인터넷을 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여gure 4).
- 스프레드 시트 테이블과 새 스프레드 시트 파일을 엽니 다. 이 새로운 다음 매개 변수 전용 파일, 시간, x 축에 전송하고 핵 및 모든 SRBCs (그림 4A)의 좌표 Y-.
- , 그들의 좌표 SRBCs과 핵 사이의 거리를 계산 XY 좌표 평면 (그림 4B)에서 핵 및 SRBC을 고려합니다.
주 : 두 점 사이의 거리를 연결 경로의 길이이다. 평면에서 SRBC과 핵 사이의 거리는 피타고라스의 정리에 의해 주어진다.- C (핵과 SRBC 사이의 거리) 및 빗변의 길이를 나타내고, (B) 다른 두 변의 길이를 나타내는 경우, 피타고라스 식은 피타고라스 정리를 표현 :
주 : 동시에, 직교에서 수평 거리A는 (X 핵 -x SRBC)는 수직 거리 (B)는 (SRBC -y Y 핵)이다. - 따라서, 핵 및 SRBC (도 4a, 퍼플 박스)에 의해 사이의 거리를 계산한다 :
주 : μm의의 거리를 갖고, X / Y 교정하여 픽셀 단위로 획득 된 거리 값을 곱한다. 여기서, X / Y의 교정은 0.205 μm의 것이다. - 각 시간에서, 핵 초기 위치 (도 4C)에 SRBC 사이의 거리를 뺀다.
- 처음 5 분 동안 측정 시간에 대하여 플롯. 플롯에 선형 트렌드 라인 (그림 5A)를 적용하고 SRBC 국제화 후 첫 5 분 동안 핵을 향해 phagosome 속도를 나타내는 선형 트렌드 라인의 기울기를 결정한다.
- 평균 오차 통계를 계산하는 데이터를 대조속도 값을 적절한 소프트웨어 (도 5B)를 사용하여 적절한 형태로 이들을 플롯 및.
- C (핵과 SRBC 사이의 거리) 및 빗변의 길이를 나타내고, (B) 다른 두 변의 길이를 나타내는 경우, 피타고라스 식은 피타고라스 정리를 표현 :
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Representative Results
HIV-1 감염과 감염되지 않은 hMDMs 의해 식세포 작용의 FcR 매개 초상권 타겟으로의 IgG - 옵 소닌 SRBCs (도 1)를 사용하여 여기에서 설명된다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 hMDMs의 준비 및 HIV-1 감염이다. 실제로, 차별화 된 대 식세포의 수율과 품질은 도너 사이 변화뿐만 아니라 10~40% 범위의 효율성과 감염율. 또한, IgG의-옵 소닌 - SRBCs의 준비는 이것이 그들의 인식을 유도하고 파편으로 대신 FcRγ 쇄 매개 식균 작용에 의해 통풍 관 수 있기 때문에, 적혈구의 손상을 방지하는 것이 중요하다. 최적의 옵 소닌은 효율적으로 식균 작용을 보장합니다.
HIV에 감염된 대 식세포 거주 Phagosome 운동은 BSL -3- 실험실 회전 디스크 공 초점 현미경에 BF 채널을 실시간으로 분석한다. BF 채널의 설정이 중요하다 t오 핵 (그림 2, 파란색 원)과 내면화 SRBCs (그림 2, 빨간색 원)에서 외부 (그림 2, 빨간색 화살촉)를 식별하기위한 참조하십시오. BF 현미경은 외부 SRBCs보다 refringent있는 phagosomes를 참조하기에 충분한 간단한 광학 현미경의 조명 기술로 간주됩니다.
이미지 시퀀스의 취득 후 첫 단계는 ImageJ에 소프트웨어에 서, 트래킹을 (도 3)이다. 이 실험을 위해 충분히 큰 샘플 크기에 도달하는 조건 당 적어도 3 도너 반복해야하는 모든 이미지 시퀀스에 대해 하나의 각 phagosome 하나를 추적하는 것이 바람직하고 고려하기 때문에이 점은 특히, 길고 지루한 일 수 통계 분석 (3 여러 기증자와 적어도 30 phagosomes).
두 번째 단계는 분석이다스프레드 시트 소프트웨어의 각 내면화 SRBCs (그림 4)에 대한 내재화 후 처음 5 분 동안 phagosome 속도를 계산합니다. 이를 위해, 우리는 거리가 시간에 대하여 상기 제 5 분 동안 각 이동 phagosome 플롯. 대표적인 예는도 5a에 감염되지 않은 hMDMs에 나타낸다. 다음으로, 선형 회귀 곡선의 기울기이며 phagosome의 속도를 얻었다. 0.5384 μm의 / 분의 속도는이 phagosome에 대한 발견되었다.
참고로, 여기 또는 듀마 등. (8)에 기재된 바와 같이, 또는 그 이후의 긴 시간 척도상에서 속도를 분석하여, 내재화 후 처음 몇 분 동안 phagosome 속도를 분석 할 수있다. 우리의 연구에서는 HIV에 감염된 hMDMs의 국제화 후 첫 5 분 동안 phagosome 속도가 아닌 감염 hMDMs (그림 5B)에 낮은 비교되는 것을 관찰했다.
제어 및 식균 작용 이미징 HIV에 감염된 hMDMs 그림 1. 준비는. 단핵구는 접착에 의해 정제 (1) 및 M-CSF 11 일 식세포로 분화 (2). 다음으로, hMDMs 하루 2 세척 8 일 0.02과 0.03 사이의 MOI에서 NLR4.3 HIV-1Gag - iGFP 전)에 감염된다 (3). (4)의 IgG-옵 소닌 SRBCs 1 시간 동안 식균 작용에 대한 hMDMs에 추가됩니다. SRBCs를 포함하는 phagosomes는 BF 이미지에 감지 할 수 있습니다 (빨간색 원, ⅱ). 이미지는 Servier에 이미지 데이터베이스에서입니다. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동안 그림 2. 실시간 수집그림 1에 설명 된대로 대표 제어 및 HIV에 감염된 hMDMs에 의한 식세포 작용. hMDMs 준비 및 감염된다. NLR4.3 HIV-1Gag - iGFP 감염된 세포는 491 nm의 레이저로 감지됩니다. 회전 디스크 공 초점 화상의 Z-스택 인수 현미경 수집 소프트웨어 및 ImageJ에 (왼쪽 패널) 모두를 사용하여 분석한다. BF 이미지 갤러리 HH로 표시되지 않은 감염 (동영상 1에 해당하는 상단 패널) 및 (45 분 수집하는 동안 셀 시간 46 이미지를 NLR4.3 HIV-1Gag - iGFP 감염 (동영상 2에 해당하는 바닥 패널) 대표 : mm). 세포막 (점선 검은 선), 핵 (파란색 원), 외부 SRBCs (그들 중 일부는 빨간색 화살촉으로 표시) 및 내부 SRBCs은 (그들 중 일부는 빨간색 동그라미로 표시) BF 이미지에 감지 할 수 있습니다. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ImageJ에의 수동 추적 플러그인 이미지 분석을위한 그림 3. 명령 단계. BF 채널 (2)의 시간 경과 비디오를 "수동 추적"플러그인 (1)를 열고로드 한 후, 수집 (3)의 매개 변수를 입력합니다. "트랙 추가"(4)와 선택 phagosome (6, 빨간색 상자)의 X 및 Y 위치로 새 창을 얻기 위해 하나 phagosome (5)을 클릭하여 추적의 측정을 시작을 클릭합니다. 밝기 및 대비 (5 ')을 다양 편의를 위해 시간 순서에 phagosome를 따르십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 스프레드 시트 소프트웨어에 phagosome 이동 속도의 데이터 분석 4. 명령어 단계. (A) 스프레드 테이블의 X 및 Y 핵의 위치와 각 phagosome (빨간색 박스)를 조립한다. 다른 열 (퍼플 박스)에서, C는 핵 및 SRBC와 내지 직각 삼각형의 나머지 두 변의 길이 (B)의 길이를 (나타내는 phagosome 및 피타고라스 정리와 원자핵 사이의 거리를 계산할 B). (C) 마지막으로, 시간 0에서 초기 거리에서 주어진 시간에 SRBC와 핵 사이의 거리를 빼서 때마다 (녹색 상자)에서 phagosomes에 의해 이동 거리를 계산 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
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제어 및 HIV에 감염된 hMDMs에서 phagosome 이동 속도의 그림 5. 정량화. (A) 각 SRBC 단지 SRBC 국제화 후 용은 핵을 향해 이동 거리를 측정하여 시간에 그려집니다. 처음 5 분 동안 그 속도는 스프레드 시트 소프트웨어에 선형 회귀를 사용하여 계산된다. 대표적인 실험 (그림 3-4의 내부 SRBC) 표시됩니다. (B) 처음 5 분 동안 모든 속도는 HIV에 감염된 세포에서 감염되지 않은 (5 기증자) 66 phagosomes 60 phagosomes (4 기증자)을 측정한다. (웰치의 보정 페어로 학생 t 시험 **, P <0.01) 데이터는 SEM ± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 대표적인 비 감염된 대 식세포에서 Phagosome 운동. . (오른쪽 다운로드 클릭) 옵 소닌 적혈구의 움직임은 분당 하나의 이미지 (HH : MM로 표시 시간 46 이미지)와 탐식의 45 분 동안 BF 채널에서 검출되었다. 바 = 10 μm의.
영화 2 : 대표 HIV에 감염된 대 식세포에서 Phagosome 운동. (오른쪽 다운로드 클릭). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 개그 iGFP)는 대 식세포가 491 레이저 조사 후 확인되었다 -infected. 옵 소닌 적혈구의 이동 중에 45 BF 채널에서 검출되었다분당 하나의 이미지 (HH : MM로 표시 시간 46 이미지)와 식균 작용의 분. 바 = 10 μm의.
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Discussion
이 기술은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 감염의 백분율 도너 의존하기 때문에 우선, HIV-1에 의한 hMDMs의 제조 및 감염은 매우 중요하다. 잠재적으로 생체 내에서 바이러스에 의해 발생하는 대 식세포의 상태가 아니라 지금까지 특징되지 않았기 때문에 참고로, 우리는 이전에 감염 체외에서 편광되지 않은 대 식세포를 사용하기로 결정했습니다. 우리는 대 식세포는도없고 M1 M2임을 나타내는 여러 표면 마커의 발현을 확인하고, CD4 및 CCR5의 발현을 확인 하였다. 감염 속도는 변수이며, 10 ~ 40 %, 그리고 때로는 이하로 다양합니다. 이 현미경 하에서 HIV-1 감염의 형광 hMDM를 찾는 것은 어려울 수있다 이유 가변 감염률이다. 또한, 원심 분리 공정 후에 즉시 HIV-1 감염 세포를 발견하는 데 필요한 시간도 취득 개시까지의 지연을 초래할 수있다. 식균 작용은 synchronizatio없이 개시 될 수있다바인딩 및 원심 분리에 의해 생성 된 흡수 n은. 그러나이 옵션은 세포에 도달하기 전에 떠 SRBCs 선택되지 않았습니다. 그것은 구슬 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 감염된 세포를 발견하는 데 필요한 시간을 최소화하여 격자 유리 바닥 요리를 식세포 작용 분석을 시작하기 위해 진행하기 전에 HIV-1 감염 hMDMs를 식별하는데 사용될 수있다. 주변 SRBCs의 "합리적인"번호가 선택한 HIV에 감염된 세포를 신속하게 인수를 시작하기 위해 선택됩니다. "합리적인 SRBC 금액"은 phagosomes 마스킹에서 외부 SRBCs을 방지하기 위해 너무 많은 적어도 10 셀 당 SRBCs하지가 충분히 의미한다.
또한, 효율적인 인식 및 이해는 세포있을 것이다되도록하여 옵 소닌 화 조건을 최적화하는 것이 중요하다. 호적부 매개 식균 작용은 구성 적이며 hMDMs 정기적으로 FcRγ 쇄 매개 흡수에 매우 효율적이다. 또한, 정확한 식세포를 들어, 조건 b에있을37 ℃에서 가열 챔버 최적 E 및 5 % CO 2. 식세포 분석을 시작하기 전에 가스의 온도를 확인하는 것이 필요하다.
마지막으로, 내부로부터 외부 phagosomes SRBCs의 식별 및 BF 채널에서 핵의 식별은 ImageJ에 소프트웨어에 대한 분석을 위해 중요하다. 이 채널의 설정이 중요한 이유이다. 초점이 수집 중에 손실 될 수 있음을 감안할 때, 우리는 phagosome 속도를 분석 할 수있는 최적의 평면을해야하는 Z 축에서 이미지의 스택을 취득하는 것이 좋습니다. 이는 각 셀에 대한 모든 SRBCs 내재화를 분석하는 하나의 필드에서 하나의 셀을 갖는 것이 바람직하다. 렌즈 선택이 중요하며, 다음은 셀 크기의 함수로서 2 렌즈를 사용한 이유이다. 우리가 100X 렌즈 phagosomes을 추적 할 수 있지만, 때로는 세포가 우리가 63X 렌즈로 전환했다가 너무 크다고 것은 쉬웠다. 메신저에 대해 생각 할 때 렌즈의 선택도 중요하다두 렌즈는 다른 X / Y 교정을 연루 때문에 ImageJ에 스프레드 시트 테이블을 사용 연령 분석.
이 기술의 제 한계는 통계적으로 유의 한 결과를 가지고 획득 할 필요가 샘플의 수이다. 우리는 접시에 여러 기증자 당 영화하지만 조건 당이 통상 2 이상 세포를 등록 할 수 있습니다. 샘플보다 도너로 실험을 반복 또는 현미경에 따라 멀티 포인트 XY 촬상을 수행한다의 이러한 제한에 대한 해결책 수가 증가. 최근에있어서의 불편 전동 XYZ 스캐닝 동안 포커스의 전위 손실이다. 또 다른 제한 속도의 설명서를 정량화가 자동 분석에 비해 길고 지루한 것입니다. 선구적인 연구 매트랩 소프트웨어에 대한 추적 알고리즘으로 관찰 하였다 고기 피부 젤라틴 결합 라텍스 비즈 4에보고 된 완전 자동화 된 분석을 위해,이 형광 표지 된 입자를 사용하는 것이 필요. 찬란의 대안이 될 수있는 항체 또는 구슬을 opsonizing 표시하지만, 1 시간 동안 식균 작용을 기록 할 때 문제가 표백 될 수 있습니다. 다른 연구 라텍스 비드 (13, 14)의 사용을보고한다. 우리는 라텍스 구슬의 국제화가 덜 쉽게 SRBCs의 흡수보다 검출 된 것으로 그러나 나타났습니다. 실제로 세포 이동의 운동학의 시작점 phagosomal 운동의 초기 결함을 검출 아는 것이 중요하다.
여기 기재된 방법의 주요 장점은 단순함과 프리 소프트웨어의 사용이다. ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 수동으로 추적을 수행하기 위해, 우리는 따라서, 우리는 phagosome과 핵 사이의 거리를 계산하는 피타고라스 정리를 사용하고, 이후의 속도를 가질 필요는 phagosome 및 핵의 위치를 사용해야 스프레드 시트 소프트웨어에서 선형 회귀. 이 3 단계 분석은 & # 함께 얼음 소프트웨어 한 단계 트랙킹을 감소시킬 수있다(34). 수동 트래킹 "플러그인 출력 데이터는 다음이다 직접 입자의 속도를 따르도록, 특히 (예 phagosomes 및 핵으로서) 두 그룹 사이의 상대 속도는 마지막으로 계산의 상대적 속도를 측정 할 수있게 해준다. 한 입자도 이동 될 수있는 다른 입자에 비해.
이 생활 시간 경과 분석의 잠재적 인 미래의 응용 프로그램은 박테리아, 곰팡이, 또는 세포 파편처럼 시야에 보이는 입자이 될 수 있습니다. 다른 치료 또는 셀의 중심을 향해 phagosomal 운동의 이러한 정제 된 분석에서 도움이 될 phagosomal 성숙과 대 식세포의 활성화 속성을 수정하기에 충분한 감염 상태.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | For viral production |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | For acquisition |
| Falcon Tissue Culture Plates 6-well | Thermo Fischer Scientific | Corning. Inc. 353934 | For human monocyte-derived macrophages |
| Ficoll-Plaque PLUS | Dominique Dutscher | 17-1440-03 | a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide in solution for density centrifugation |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | RT |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, liquid (High Glucose) | GIBCO, Molecular probes | 31966-021 | Conserved at 4 °C ; for HEK cells culture |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | Conserved at 4 °C; for hMDMs culture |
| Fœtal Calf Serum (FCS) | Eurobio | CVFSVF0001 | Conserved at -20 °C ; decomplemented |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | Conserved at -20 °C ; for hMDMs culture |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10x 500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37 °C water bath before use ; for phagocytosis assay |
| FuGENE6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Conserved at 4 °C ; for viral production |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4 °C before use |
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | Conserved at 4 °C |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | Conserved at -20 °C |
| Inverted microscope DMI600 | Leica | ||
| Confocal Spinning Disk Unit CSU-X1M1 | Yokogawa | ||
| 491 nm 50 mW laser | COBOLT CALYPSO | ||
| HCX PL APO CS Objectif | Leica | Objective lens ; Magnification 100X ; Numerical aperture 1.40 ; Immersion oil | |
| CoolSnap HQ2 (FireWire) Camera | Photometrics | Pixel size 6.45 µm x 6.45 µm ; Definition 1,392 x 1,040 ; Encoding the image in 14 Bit | |
| Metamorph 7.7.5 software | Molecular Devices | For the control of the microscope | |
| GraphPad Prism software | For the statistics analysis |
References
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