Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Abstract

Biofilms bestaan ​​uit groepen van bacteriën ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. Zij spelen een belangrijke rol bij industriële vervuiling en in de ontwikkeling en persistentie van vele gezondheid gerelateerde infecties. Een van de meest goed beschreven en bestudeerd biofilms in menselijke ziekte voorkomt bij chronische longinfectie van cystische fibrose. Bij het bestuderen biofilms in het kader van de gastheer, een groot aantal factoren biofilm vorming en ontwikkeling beïnvloeden. Om te bepalen hoe gastheerfactoren biofilm vorming en ontwikkeling kunnen beïnvloeden gebruikten we een statische chambered dekglaasje methode biofilms groeien in aanwezigheid van gastheer afkomstig factoren in de vorm van sputum supernatanten. Bacteriën worden gezaaid in kamers en blootgesteld aan sputum filtraten. Na 48 uur groei worden biofilms gekleurd met een commerciële kit biofilm levensvatbaarheid vóór confocale microscopie en analyse. Volgende beeld acquisitie, kan biofilm eigenschappen worden beoordeeld met behulp van verschillende software platforms.Deze methode stelt ons in staat om de belangrijkste eigenschappen van de biofilm groei te visualiseren in aanwezigheid van verschillende stoffen, waaronder antibiotica.

Introduction

Bacteriële biofilms zijn groepen micro-organismen die zijn bevestigd aan elkaar en ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. ^1,2 klassiek, zij vertegenwoordigen bacteriën fysiek verbonden aan een abiotische of biotische oppervlak gevormd onder omstandigheden van flow. Biofilms zijn ook aangetoond dat ze groeien in statische toestand (zonder stroom) en distaal van oppervlakken, zoals bij de lucht-water grensvlak thermische zwembaden of pellicles gevormd in reageerbuizen. Deze biofilms zijn lang erkend in de omgeving en die een groot nadeel voor industriële processen zoals deze zich kunnen vormen in water reservoirs of leidingen, waardoor biofouling, corrosie en verstopping. ^3,4

Biofilms zijn ook kritisch in de gezondheidszorg, zoals ze zijn getoond worden bij kathetergerelateerde infecties, longinfecties bij cystische fibrose patiënten, alsmede in talrijke andere infecties. ^5,6 Een van de kenmerken van biofilm infecties is het degevouwen gevoeligheid van bacteriën tegen antibiotica en verminderde klaring van het aangeboren immuunsysteem. ^7-9 De meest bestudeerde, klinisch relevante scenario's van biofilm-gebaseerde infectie optreedt bij patiënten met cystic fibrosis (CF), die chronisch besmet zijn met Pseudomonas aeruginosa biofilms. P. aeruginosa kan bij instelling van chronische infectie die het zeer moeilijk te behandelen een aantal wijzigingen ondergaan. ^10,11 Biofilms kunnen differentieel activeren aangeboren immuniteit en rijden ontsteking. ^12-14 Al deze infecties leiden tot verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij CF-patiënten, is het cruciaal om factoren die invloed hebben biofilm ontwikkeling in dit verband verstaan.

Een recente studie suggereert dat gastheer-factoren zijn cruciaal bij de vorming van biofilm P. aeruginosa aggregaten. ¹⁵ Deze biofilms bijdragen tot verminderde gevoeligheid voor antibiotica en gastheer afweermechanismen. de presentie van gastheer afkomstig factoren, zoals neutrofiel elastase, alsook uitgescheiden producten van micro-organismen in de CF longen, het potentieel sterk moduleren vorming en ontwikkeling biofilm. ¹⁶ Daarnaast biofilms interactie met de gastheer voor expressie van een groot cascades en een ontstekingsproces. Terwijl hoge doorvoer werkwijzen, zoals de standaard kristalviolet assay kan enige informatie met betrekking tot de biofilm werkwijze, visualisatie van de biofilm in reactie op deze factoren zorgen voor meer gedetailleerde informatie.

In dit manuscript beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van factoren uit het sputum van patiënten met CF biofilmvorming in vitro bestuderen. Deze methode zorgt voor een snelle visualisatie van biofilms blootgesteld aan sputum met gastheer factoren met behulp van een commercieel biofilm levensvatbaarheid kit. Deze techniek kan worden gebruikt om visueel veranderingen die optreden tijdens biofilmgroei te identificeren in de aanwezigheid van exogenoons producten, en vertegenwoordigt een verbeterde werkwijze voor de veranderingen in biofilm ontwikkeling onder verschillende omstandigheden te analyseren.

Protocol

Merk op dat Research Ethics Board (REB) moet verzamelen en opslaan sputum monsters uit proefpersonen. Deze studies werden goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB # 1000019444.

1. Voorbereiding CF sputum

1. Verzamel sputum monster van patiënten tijdens een routine bezoek aan de cystic fibrosis clinic en blijf op ijs.
2. Vervoeren sputum monster op het ijs binnen het eerste uur van de collectie, aan het onderzoekslaboratorium, de verwerking te ondergaan.

2. Sputum Processing

1. Noteer het volume van het sputum monster verkregen. Voeg fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om het volume van het monster (dat wil zeggen, 2 delen PBS, 1 deel van een monster) 2x.
2. Meng het monster goed met een transfer pipet. Vortex het monster op de hoogste stand gedurende 1 minuut om volledig te mengen.
3. Aliquot 1 ml van het bovenstaande mengsel in het juiste aantal 1,5 ml microcentrifugebuizen en spin neer bij 5000 xg gedurende20 min bij 4 ° C.
4. Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof en gooi de pellet.
5. Filter steriliseer het supernatant door een 0,22 urn filter en blijft dan op een schone microcentrifugebuis.
   OPMERKING: Steriliteit filtraat wordt getest door uitplaten op LB agar en enten vloeibare media.
6. WINKEL sputum supernatant bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
   LET OP: Sputum uit meerdere patiënten kunnen ook worden samengevoegd na filtratie.
7. Vóór gebruik verdund sputum filtraat 1/10 v / v (100 pl sputum, 900 ul medium) in de gewenste media.
   LET OP: Hier werd standaard lysogenie bouillon (LB) media gebruikt.

3. Chambered dekglaasje Methode voor Biofilm Formation

1. Grow bacteriële isolaat van belang 's nachts in de gewenste media bij 37 ° C onder schudden (200 rpm).
   Opmerking: Een aantal verschillende bacteriën werden gebruikt, met inbegrip van klinische isolaten Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia en Achromobacter xylosoxidans. Mediakeuze afhankelijk stammen en omstandigheden plaats, echter LB-medium kan worden gebruikt voor initiële experimenten.
2. Van overnachtcultuur Plaats 40 gl kweek in 4 ml vers medium en kweken gedurende 3-4 uur bij 37 ° C onder schudden (200 rpm) tot een kweek met een optische densiteit bij 600 nm (OD ₆₀₀₎ van ongeveer 0,5 -0,6.
3. Verdun de cultuur van stap 3,2 tot 1/5 in de gewenste media met 10% sputum filtraat of zonder sputum filtraat (als controle). Andere concentratie van sputum filtraat kan worden getest (dat wil zeggen, 50% of 100%).
4. Gebruik 200 ul van de verdunning tot putjes van dia kamers zaad.
5. De bacteriën te hechten 4 uur bij 37 ° C zonder schudden.
6. Na 4 uur, verwijder de media en voorzichtig te wassen de biofilm met 1x verse media. Vervangen door 200 ul vers medium.
   OPMERKING: Om het effect van sputum op de biofilm te bestuderen, de fresh media moeten sputum supernatant bevatten.
7. Biofilms laten groeien voor de gewenste tijd bij 37 ° C zonder schudden, vervangen media elke 12 uur, zonder te wassen tot de tijd voor microscopie.
   Opmerking: Om het effect van sputum op supernatanten biofilm antibioticagevoeligheid bestuderen antibiotica toegevoegd aan het medium na 24 uur groei van biofilm en worden gehandhaafd in de media tot kleuring en beeldvorming van biofilms.

4. kleuring Biofilms en confocale microscopie

1. Naar aanleiding van de gewenste groei van de tijd (24-48 uur het beste werkt), verwijder media uit kamer putten en voorzichtig te wassen elke kamer tweemaal met 300 pl steriel PBS.
2. Bereid kleuring mengsel biofilm door mengen 1 pi van elke kleurstof (verschaft in de kit levensvatbaarheid) per ml oplossing nodig. Maak kleurstof in water of media-oplossing.
   OPMERKING: Water wordt aanbevolen door de fabrikant.
3. Voeg 200 ul van kleurstofmengsel elk putje van chambered coverglass en incuberen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 min.
4. Verwijderen Kleurend mengsel van kamers en was elk putje met 300 pl steriel PBS. Verwijder PBS en te vervangen door vers water of media.
5. Ga verder met visualisatie van biofilms via confocale microscopie.

5. Visualiseren Biofilms met confocale microscopie

1. Lees lood biofilms in raadkamer onmiddellijk na kleuring (binnen 1 uur). Minimaliseren vertraging visualisatie van de objectglaasjes door kleuring 1-2 augustus putjes kamers tegelijk.
2. Voer beeldvorming met behulp van confocale microscoop met lasers voor excitatie en filter sets voor de overname.
   OPMERKING: Hier, de draaiende schijf confocale systeem spectrale borealis lasers (Groen: 491nm, Red: 561 nm) werd gebruikt voor excitatie. Emissiefilter sets 515/40 en 624/40 werden gebruikt om de vlekken visualiseren van de biofilm levensvatbaarheid kit.
3. Maak opnamen met behulp van een 25X objectief water op confocale microscoop met camera.
4. Neem 3-5 beelden van elk putje.
   LET OP: Dus voor een 8 goed chambered dekglaasje, zal 24-40 beelden worden gegenereerd.
5. Bewaar afbeeldingen voor analyse.
   LET OP: Beelden worden opgeslagen als OME-TIFF-bestanden te analyseren met behulp van COMSTAT ^18,19. Instructies voor het biofilm analyse kan worden gevonden op http://www.comstat.dk/. Zodra beelden worden ingevoerd, kunnen parameters zoals gemiddelde dikte, biomassa en oppervlaktebedekking voor elk kanaal (rood en groen) geanalyseerd.

Representative Results

Het totale ontwerp van het experiment weergegeven in figuur 1. Het gebruik van dit protocol een handige methode om de wijzigingen in biofilms gekweekt voor verschillende tijdsperioden (bijvoorbeeld 24, 48 of 72 uur) zichtbaar. Belangrijker exogene signalen, zoals sputum filtraat kan worden toegevoegd aan de veranderingen in de biofilm ontwikkeling visualiseren. Zoals blijkt uit figuur 2, kan de aanwezigheid van 10% sputum filtraten de architectuur van de biofilm (figuur 2A, onderste panelen) wijzigen. ¹⁶ Deze beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp COMSTAT software sleutel biofilm matrices, zoals gemiddelde dikte van de biofilm, totale biomassa en oppervlaktebedekking verkrijgen. Dit komt tot uiting in een algemene toename van de biofilm dikte (Figuren 2B en 3). ¹⁶ De effecten van antibiotica op biofilms in aanwezigheid sputum wordt getoond in figuur 3. door visuali zing de veranderingen in biofilm ontwikkeling, kan men beter begrijpen hoe verschillende factoren kunnen biofilmgroei, een veel betere mate dan traditionele biofilm assays, zoals kristalviolet kleuring.

Figuur 1: Algemeen ontwerp van het experiment. Stroomschema van elementaire protocol. Een nacht (O / N) kweek wordt verdund 1/1000 en toegestaan te groeien tot een uiteindelijke _OD600 van 0,5. Dit wordt verder verdund 1 / 1.000 en 200 ui in put van chambered dekglaasje wordt gezaaid en toegestaan ​​te hechten gedurende 3-4 uur. Vervolgens wordt media verwijderd en vervangen door vers medium. Biofilms kunnen groeien voor de gewenste tijd. Media, kunnen exogene producten of antibiotica om de biofilms worden toegevoegd. Naar aanleiding van de groei, wordt media verwijderd, biofilms worden gekleurd en de confocale beeldvorming wordt uitgevoerd.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden van biofilm ontwikkeling na blootstelling aan sputum filtraten. (A) Representatieve beelden van Burkholderia cepacia (BCC) klinische isolaten na 48 uur van groei chambered dekglaasje met alleen (bovenste panelen) media of in aanwezigheid van 10% sputum filtraten (onderste panelen) gevolgd door kleuren met biofilm levensvatbaarheid kit. 1 schaal eenheid vertegenwoordigen 19,68 urn. (B - C) De gemiddelde dikte van isolaten (B) en dode: live-verhouding (C) van meerdere afbeeldingen van BCC-isolaten geteeld voor 48 uur in slide kamers in de afwezigheid (witte balken) of aanwezigheid (zwarte balken) van sputum filtraten. Elke staaf stelt het gemiddelde van 45 beelden geplotmet de standaard van het gemiddelde. ** P <0,001 vergeleken met de controle (medium alleen) via Kruskal-Wallis-test. Figuur aangepast van Kennedy et al. ¹⁶ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van antibiotische behandeling op biofilms blootgesteld aan sputum filtraat. (A) Foto's van Burkholderia vietnamiensis klinische isolaten na 48 uur van groei chambered dekglaasje met media alleen (links) of in aanwezigheid van 10% sputum filtraten (rechts) met of zonder 1000 ug / m tobramycine. Biofilms alleen werden gekweekt gedurende 24 uur in medium of medium aangevuld met 10% (v / v) sputum filtraten. Na 24 uur werd medium verwijderd en vervangen door medieen (+/- sputum) antibiotica. 1 schaal eenheid vertegenwoordigen 19,68 urn. (B - C) De gemiddelde dikte van isolaten (B) en dode: live-verhouding (C) van meerdere beelden (n = 9) van B. vietnamiensis isolaten geteeld voor 48 uur in slide kamers in de afwezigheid of aanwezigheid van sputum filtraten. Elke staaf stelt het gemiddelde van 45 beelden afgedrukt met de standaardfout van het gemiddelde. ** P <0,001 vergeleken met de controle (0 ug / ml) met behulp Kruskal-Wallis-test. Figuur aangepast van Kennedy et al. ¹⁶ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hierin beschreven werkwijzen maken voor visualisatie van bacteriële biofilms gekweekt in de aanwezigheid van exogeen producten. Niet verrassend, de productie van de exoproducts van belang bij gebruik van dit type systeem. Bijvoorbeeld, dithiothreitol (DTT), wordt vaak gebruikt op menselijke sputum monsters om vloeibaar monsters. Echter, het effect van DTT alleen biofilm ontwikkeling en levensvatbaarheid verlagen (gegevens niet getoond). Aldus juiste controles voor alle omstandigheden noodzakelijk. Verder is de toevoeging van menselijke sputum producten creëert inherente variabiliteit over het experiment vanwege het feit dat het sputum van elke patiënt uniek microbiome. Te corrigeren voor deze, hebben we gepoolde sputum monsters gebruikt om patiëntspecifieke resultaten te vermijden. Bovendien, de keuze van geschikte media is van belang bij gebruik van een modelsysteem. Standard media voor biofilm groei van het beoogde organisme worden aanbevolen voor de initiële configuratie van het systeem. Als het doel van het experiment is om identify hoe exogene producten biofilmvorming beïnvloeden, is een voedingsstof rich media dat er voldoende biofilmvorming biedt voorgesteld. Dit zal voldoende voeding voor groei mogelijk bij het bepalen hoe exogene factoren de biofilm kunnen beïnvloeden. Andere media zoals minimaal of gedefinieerd medium kan worden gebruikt om betere nabootser bepaalde voorwaarden. Andere media zijn gebruikt met goede resultaten in dit systeem (gegevens niet getoond). De bevestiging van de biofilms de chambered dekglaasje robuust is echter veel zorg moeten worden genomen bij het verwijderen / toevoegen medium of tijdens wasstappen van de biofilms te voorkomen dat het verstoren van de biofilms.

Het gebruik van de levende-dode vlek volgens protocol van de fabrikant heeft goede resultaten voor het beschreven systeem opgeleverd. Verschillende factoren kunnen de fluorescentieverhouding van de afbeeldingen (waaronder kleurstofopname bacteriën, relatieve dichtheid van biofilm en detector versterkingsinstellingen), maar deze methode betrekking tot wat wordt waargenomen in het beelds. Andere maatregelen kunnen worden gebruikt om de relatieve hoeveelheid dode / levende biofilm vertegenwoordigen zoals de biomassa uit de dode cellen in verhouding tot de totale aanwezige biomassa in de biofilm (ontleend COMSTAT). Middels bacteriële tellingen biofilm levensvatbaarheid herhaalde experimenten bevestigen wordt aanbevolen om de visuele waarnemingen van dit model bevestigt. Vanwege inherente heterogeniteit van biofilms moeten meerdere beelden van elke kamer en meerdere kamers worden gebruikt voor elke toestand in een experiment. Dit draagt ​​bij aan de kosten en duur van deze experimenten.

De beeldopname is belangrijk voor de analyse van gegevens van deze experimenten. Zorg moet worden genomen om niet meer dan beelden te verzadigen en bij het bepalen van de microscoop setup. Afhankelijk van de mate van detail en de beschikbare microscoop, kan een aantal verschillende doelstellingen (10X, 25X, 40X en 63X) worden gebruikt om beelden te verwerven, maar we vinden dat 25X doel geeft betere beelden. De dikte tsHij Z-stack kan ook invloed hebben op de algehele beeldkwaliteit en mate van detail. Het hebben van foto's genomen elke 0,5-1 urn lijkt heldere beelden te leveren tegen 25X objectief, terwijl de Z-stack beelden op een formaat dat door het COMSTAT kunnen worden geanalyseerd op standaard computersystemen.

Deze experimenten zijn duur en tijdrovend dan andere hechting assays, en kan niet worden uitgevoerd in een high throughput wijze. In deze procedure bacteriën hechten aan een borosilicaat oppervlak, dat geen reflectie van een in vivo toestand en kan biofilm vorming en ontwikkeling beïnvloeden. Echter, ze bieden aanvullende informatie en kunnen hypotheses voor het mechanisme in verband met resistentie tegen antibiotica en fysiologische respons op exogeen signaal biofilm te genereren. Als het doel van het experiment is te begrijpen hoe biofilms veranderen als reactie op verschillende factoren, in plaats van het identificeren anti-biofilm verbindingen met behulp van high-throughput methoden bijvoorbeeld de aanvullende informatie verkregen met tZijn techniek maakt de methode de moeite waard. Dus de huidige methode is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van eerdere beperkte hechting assays zoals kristalviolet assay, wordt het meest gebruikt om biofilms te bestuderen.

Kritische stappen om deze procedure omvatten: 1) Het verzekeren tijdige verwerking van sputum monsters om afbraak te voorkomen; 2) zachtaardig met media veranderingen op de biofilms om verstoring van de biofilm te voorkomen en 3) Doen herhaalde metingen van biofilm beeldvorming een juiste weergave van de biofilm dikte te verzekeren als gevolg van de heterogeniteit van biofilmvorming.

Zodra het systeem is opstelling voor een bepaalde bacteriesoort kan men een aantal verschillende omstandigheden, inclusief de effecten van exogene factoren op verscheidene klinische isolaten testen. Dit systeem is gebruikt om het effect van antibiotica studie over biofilms blootgesteld aan menselijke sputum ¹⁶ en zeer resistent en intermediair resistente klinische isolaten vergelijk. ¹⁷ Wijzigingen in de chambered dekglaasje, zoals het bekleden van de bodem met mucine of collageen micro-steiger (bijvoorbeeld puracol) verder het spectrum van de experimenten mogelijk. Het is mogelijk om deze aan te passen aan directe interacties, zoals die tussen epitheliale cellen en bacteriën of tussen verschillende bacteriële species te bestuderen. Dit is een uitbreiding van de door Jurcisek et al model. ²⁰ De werkwijze maakt gebruik schijfjeskamer groei vergelijkbaar met die beschreven en gebruikt formaline biofilms lossen voorafgaand aan visualisatie. Als alternatief, in deze werkwijze visualiseren we biofilms onmiddellijk na kleuring en geen fixeermiddel gebruiken. Bovendien voegen we exogene factoren om het effect van antibiotica op biofilms te testen. Dit model heeft dus de potentie om ons begrip van bacteriële biofilms in menselijke ziekte aanzienlijk bevorderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf