לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Abstract

Biofilms מורכב קבוצות של חיידקים עטופים מטריצה-מופרש עצמי. הם משחקים תפקיד חשוב זיהום תעשייתי כמו גם בפיתוח וההתמדה של זיהומים רבים הקשורים לבריאות. אחד biofilms תיאר הכי טוב ולמד מחלות אנושיות מתרחשת דלקת ריאות כרונית של חולי סיסטיק פיברוזיס. כאשר לומדים biofilms בהקשר של המארח, גורמים רבים יכולים להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. על מנת לזהות כיצד גורמי מארח עשויים להשפיע היווצרות ביופילם ופיתוח, השתמשנו בשיטת coverglass חדרים סטטי לגדול biofilms בנוכחות גורמים נגזרים מארחים בצורת supernatants ליחה. חיידקים הם זורעים לתוך תאי וחשוף filtrates ליחה. בעקבות 48 שעות של צמיחה, biofilms מגואלות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית לפני מיקרוסקופיה וניתוח confocal. בעקבות רכישת תמונה, תכונות biofilm ניתן להעריך באמצעות פלטפורמות תוכנה שונות.שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין תכונות מפתח של צמיחת biofilm בנוכחות של חומרים שונים כולל אנטיביוטיקה.

Introduction

biofilms חיידקים הם קבוצות של מיקרואורגניזמים מחוברים זה לזה עטוף מטריצה-מופרש עצמי. ^1,2 קלסי, הם מייצגים חיידקים מחוברים פיזי משטח אביוטי או ביוטיים שנוצר בתנאים של זרימה. Biofilms גם הוכח לגדול בתנאים סטטיים (העדר זרימה) ו דיסטלי ממשטחים, כגון בממשק הנוזל אוויר של ברכות תרמיות או pellicles נוצרו במבחנות. biofilms אלה כבר מזמן מוכר בסביבה והם לרעת משמעותיים בתהליכים תעשייתיים, כפי שהם יכולים להיווצר מאגרי מים או בצינורות, וכתוצאה מכך biofouling, קורוזיה חסימות. ^3,4

Biofilms הוא גם קריטי גדרות בריאות, כפי שהם הוכחו להיות מעורבי זיהומים הקשורים קטטר, דלקות ריאות בחולי סיסטיק פיברוזיס, כמו גם זיהומים רבים אחרים. ^5,6 אחד מסימני ההיכר של זיהומים ביופילם הוא דהמקומט רגישות של חיידקים לאנטיביוטיקה ולקוי אישור על ידי מערכת החיסון המולדת. ^7-9 למדו הכי טוב, תרחישים רלוונטיים קליני מעורבי זיהום מבוסס ביופילם מתרחשים בחולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), אשר נגועים באופן כרוני עם Pseudomonas aeruginosa biofilms. פ aeruginosa יכול לעבור מספר שינויים במהלך הקמת זיהום כרוני זה עושה את זה קשה מאוד לטיפול. ^10,11 Biofilms יכול להפעיל מולדת חסינה ולנסוע דלקת דיפרנציאלי. ^12-14 כמו זיהומים אלו מובילים לתחלואה ולתמותה מוגברות בחולי CF, חשוב להבין גורמים שיכולים להשפיע על התפתחות biofilm בהקשר זה.

מחקר שנערך לאחרונה עולה כי גורמי מארח הם קריטיים ההיווצרות של אגרגטים ביופילם פ aeruginosa. ¹⁵ biofilms אלה תורמים רגישים מופחתים אנטיביוטיקה ומנגנוני הגנה מארחת. preseNCE גורמים מארחים נגזר, כגון אלסטט נויטרופילים, כמו גם מוצרים מופרשים מיקרואורגניזמים נוכחות ריאות CF, יש פוטנציאל לווסת היווצרות והתפתחות ביופילם מאוד. ¹⁶ בנוסף, biofilms אינטראקציה עם המארח לווסת ביטוי של מסלולים רבים וליזום דלקת. בעוד שיטות תפוקה גבוהה, כגון assay סגול קריסטל רגיל, יכול לספק קצת מידע לגבי תהליך ביופילם, להדמיה של biofilm בתגובה הגורמים הללו לספק יותר מידע מעמיק.

בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לשימוש גורמים מן הליחה של חולי CF כדי ללמוד על ההתפתחות של biofilms במבחנה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה מהירה של biofilms חשופה לגורמי מארח המכיל כיח באמצעות ערכת כדאיות ביופילם מסחרית. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות ויזואלית שינויים המתרחשים במהלך צמיחת biofilm בנוכחות exogenoלנו מוצרים, ומייצג שיטה משופרת לנתח את השינויים בפיתוח ביופילם בתנאים שונים.

Protocol

שים לב מועצת האתיקה מחקר (REB) נדרש לאסוף ולאחסן דגימות כיח מ בבני אדם. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים REB # 1000019444.

1. הכנת דוגמאות כיח CF

1. אסוף מדגם ליחה מחול במהלך ביקורים שיגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס ולשמור על קרח.
2. הובלת ליחה המדגם על הקרח במהלך השעה הראשונה של האוסף, למעבדת מחקר, לעבור עיבוד.

2. עיבוד כיח

1. רשום את עוצמת הקול של מדגם הליחה שהושג. להוסיף בופר פוספט (PBS) כדי 2x היקף המדגם (כלומר, 2 חלקים PBS, מדגם חלק 1).
2. מערבבים את המדגם היטב עם טפטפת ההעברה. וורטקס המדגם על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 1 דקות לערבב לחלוטין.
3. Aliquot 1 מ"ל של תערובת הנ"ל לתוך הצינורות מספר 1.5 מ"ל microcentrifuge המתאים ומסובב ב 5000 XG עבור20 דקות ב 4 ° C.
4. בעקבות צנטריפוגה, להסיר את supernatant וזורקים את הכדור.
5. סנן לעקר את supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולאסוף בתוך שפופרת microcentrifuge נקי.
   הערה: עקרות של תסנין נבחנות על ידי ציפוי על אגרת LB וכך גם ייחס תקשורת נוזלית.
6. אחסן supernatant כיח ב -80 ° C לשימוש עתידי.
   הערה: כיח מחולים רבים יכולים גם להיות ונקווה לאחר סינון.
7. לפני השימוש, לדלל כיח תסנין 1/10 V / V (100 μl של ליחה, 900 μl של תקשורת) בתקשורת רצויה.
   הערה: כאן, lysogeny מרק סטנדרטי (LB) בתקשורת היה בשימוש.

3. תאיים coverglass שיטה ליצירת biofilm

1. לגדול לבודד בקטריאלי של לילה עניין התקשורת הרצוי על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (200 סל"ד).
   הערה: מספר חיידקים שונים שימשו, כולל קליני מבודד Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia מורכבים cepacia ו Achromobacter xylosoxidans. בחירה של תקשורת תלוי זנים ותנאי ריבית, אולם תקשורת LB יכולה לשמש בניסויים ראשוניים.
2. מתרבים הלילה, להציב 40 μl של התרבות לתוך 4 מיליליטר של תקשורת הטריה לגדול במשך 3-4 שעות ב 37 ° C עם רועד (200 סל"ד) להשיג תרבות עם צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ של כ 0.5 -0.6.
3. לדלל את תרבות משלב 3.2 ל 1/5 במדיה הרצויים עם 10% כיח תסנין או ללא תסנין ליחה (כמו שליטה). ריכוז אחר של תסנין כיח ניתן לבדוק (כלומר, 50% או 100%).
4. השתמש 200 μl של דילול זרע בארות של תאי שקופיות.
5. אפשר לחיידקים לצרף במשך 4 שעות ב 37 ° C בלי לרעוד.
6. לאחר 4 שעות, להסיר את התקשורת לשטוף בעדינות את biofilm עם תקשורת הטריה 1x. חלף עם 200 μl תקשורת טריה.
   הערה: כדי לחקור את ההשפעות של ליחה על ביופילם, את fresh התקשורת צריכה לכלול supernatant ליחה.
7. אפשר biofilms לגדול במשך פרק הזמן הרצוי על 37 מעלות צלזיוס ללא רעד, החלפת התקשורת בכל 12 שעות, בלי לשטוף עד הפעם עבור במיקרוסקופ.
   הערה: כדי לחקור את ההשפעה של supernatants כיח על רגישות לאנטיביוטיקה ביופילם, אנטיביוטיקה מתווספת המדיה הבאות 24 שעות של צמיחת biofilm ומתוחזקים בתקשורת עד מכתים והדמיה של biofilms.

Biofilms מכתים 4. מיקרוסקופית Confocal

1. בעקבות זמן צמיחה רצוי (HR 24-48 עובד הכי טוב), להסיר תקשורת מבארת קאמרי לשטוף בעדינות כל תא פעמים עם 300 μl של PBS סטרילית.
2. הכין תערובת מכתימה עבור ביופילם על ידי ערבוב 1 μl של כל צבע (המסופק בערכה הכדאית) עבור כל מיליליטר של פתרון הנדרש. הפוך צבע בתמיסת מים או תקשורת.
   הערה: מים מומלצים על ידי היצרן.
3. הוסף 200 μl של תערובת לצבוע היטב כל תאיים coverglass דגירה בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 45 דקות.
4. סור תערובת מכתימה מהלשכה ולשטוף היטב עם כל 300 μl של PBS סטרילית. הסר PBS ולהחליף עם מים או תקשורת טריים.
5. המשך עם ויזואליזציה של biofilms באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

5. חזותי Biofilms עם מיקרוסקופית Confocal

1. קרא biofilms מוכתם בתאי מיד לאחר מכתים (בתוך שעה 1). מזער את העיכוב להדמיה של השקופיות על ידי צביעת 1 עד 2 תאים 8-גם בכל פעם.
2. בצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם לייזרים לערכות עירור מסנן עבור הרכישה.
   הערה: כאן, confocal הדיסק מסתובב המערכת עם לייזרים זוהרים ספקטרלי (גרין: 491nm, אדום: 561 ננומטר) שמשה עירור. סינוני פליטת 515/40 ו 624/40 שמשו כדי להמחיש את הכתמים מתוך ההערכה הכדאית ביופילם.
3. צלם תמונות באמצעות מטרת מי 25x על מיקרוסקופ confocal עם מצלמה.
4. קח 3-5 תמונות מכל טוב.
   הערה: כך עבור 8 גם מחולק לתאי coverglass, 24-40 תמונות תופקנה.
5. שמור תמונות לניתוח.
   הערה: התמונה צריכה להיות נשמר כמו שת-TIFF קבצים לנתח באמצעות לסטטמ"מ ^18,19. הוראות לניתוח תמונה biofilm ניתן למצוא בכתובת http://www.comstat.dk/. ברגע תמונות מיובאות, פרמטרים כגון עובי ממוצע, ביומסה כיסוי שטח לכל ערוץ (אדום וירוק) ניתן לנתח.

Representative Results

העיצוב הכללי של הניסוי מיוצג באיור 1. השימוש בפרוטוקול זה מספק שיטה נוחה כדי להמחיש את השינויים biofilms גדל במשך תקופות זמן שונות (למשל, 24, 48 או 72 שעות). חשוב לציין, אותות אקסוגניים, כגון ליחה filtrates, ניתן להוסיף כדי להמחיש את השינויים בפיתוח ביופילם. כפי שניתן לראות באיור 2, בנוכחות filtrates כיח 10% יכול לשנות את הארכיטקטורה של ביופילם (איור 2A, לוחות נמוך). ¹⁶ תמונות אלה ניתן לנתח באמצעות תוכנה לסטטמ"מ להשיג מטריצות biofilm מפתח, כולל עובי ממוצע של ביופילם, ביומסה סך כיסוי השטח. הדבר בא לידי הביטוי לעליה במספר עובי ביופילם (2B הדמוי, ו -3). ¹⁶ ההשפעות של אנטיביוטיקה על biofilms ב כיח הנוכחות מוצגות באיור 3. על ידי visuali זיע השינויים בפיתוח ביופילם, אפשר להעריך טוב יותר כיצד גורמים שונים יכולים להשפיע על הצמיחה ביופילם, במידה הרבה יותר טובה מאשר מבחני ביופילם מסורתיים, כגון מכתים סגול קריסטל.

איור 1: עיצוב כללי של ניסוי. זרימת תרשים של פרוטוקול בסיסי. לכל הלילה (O / N) תרבות הוא מדולל 1 / 1,000 ואיפשר לגדול עד OD הסופי ₆₀₀ של 0.5. זה מדולל יותר 1 / 1,000 ו -200 μl הוא זורע לתוך היטב של coverglass חדרים ואפשרנו לצרף עבור 3-4 שעות. בעקבות זאת, התקשורת להסיר ומחליפה עם תקשורת טריה. Biofilms מותר לגדול במשך הזמן הרצוי. Media, ניתן להוסיף מוצרים או אנטיביוטיקה אקסוגנית biofilms. בעקבות צמיחה, מדיה מוסרת, biofilms מגואלות והדמית confocal מתבצעת.ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תמונות נציג של פיתוח biofilm בעקבות חשיפת filtrates ליחה. (א) נציג תמונות של מורכבות cepacia Burkholderia (BCC) שבודד קליני הבא 48 שעות של צמיחה ב coverglass חדרים עם תקשורת לבדה (פנלים למעלה) או בנוכחות filtrates כיח 10% (לוחות נמוכים) ואחריו מכתים עם ערכת כדאיות ביופילם. יחידת מידה 1 לייצג 19.68 מיקרומטר. (ב - ג) העובי הממוצע של בידודים (ב ') מת: יחס חי (C) של מספר רב של תמונות של BCC מבודד גדל במשך 48 שעות בתאי שקופיות בהעדר (פסים לבנים) או נוכחות (פסים שחורים) של ליחת filtrates. כל עמודה מייצגת ממוצע של 45 תמונות זממועם סטיית תקן של הממוצע. ** P <0.001 לעומת קבוצת ביקורת (מדיה לבד) באמצעות בדיקת Kruskal-Wallis. האיור מותאם ואח קנדי. ¹⁶ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: נציג תמונות של טיפול אנטיביוטי על biofilms חשוף תסנין ליחה. תמונות (א) של הבידודים קליניים vietnamiensis Burkholderia הבאים 48 שעות של צמיחה ב coverglass החדרים עם התקשורת לבדה (משמאל) או בנוכחות filtrates כיח 10% (מימין) עם או בלי 1,000 מיקרוגרם / מ 'של tobramycin. Biofilms גדלו במשך 24 שעות בתקשורת לבד או מדיה בתוספת 10% (v / v) כיח filtrates. לאחר 24 שעות, תקשורת הוסרה והוחלפה Medi(ליחה +/-) א המכיל אנטיביוטיקה. יחידת מידה 1 לייצג 19.68 מיקרומטר. (ב - ג) עובי ממוצע של הבידודים (ב ') מת: יחס חי (C) של מספר רב של תמונות (n = 9) של vietnamiensis ב מבודד גדלו במשך 48 שעות בתאי שקופיות בהעדר או נוכחות של ליחה filtrates. כל עמודה מייצגת ממוצע של 45 תמונות זממו עם סטיית התקן של הממוצע. ** P <0.001 לעומת קבוצת ביקורת (0 מיקרוגרם / מ"ל) באמצעות הבדיקה Kruskal-Wallis. האיור מותאם ואח קנדי. ¹⁶ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השיטות שתוארו במסמך זה לאפשר להדמיה של biofilms החיידקים גדל בנוכחות מוצרים אקסוגניים. באופן לא מפתיע, את הייצור של exoproducts הוא בעל חשיבות בעת שימוש בסוג זה של המערכת. למשל, Dithiothreitol (DTT), משמש לעתים קרובות על דגימות כיח אדם לעזור למוסס את הדגימות. עם זאת, ההשפעה של DTT לבדו יכול להקטין פיתוח biofilm ואת הכדאיות (מידע לא מוצג). לפיכך, בקרות נאותות עבור כל התנאים הדרושים. יתר על כן, התוספת של מוצרי ליחה אנושיים יוצרת את שוני פנימי על הניסוי בשל העובדה כי הליחה של כל מטופל יש Microbiome ייחודי. כדי להתאים לכך, השתמשנו דגימות כיח נקוו להימנע תוצאות מטופל ספציפיות. בנוסף, הבחירה של חומרי הדפסה מתאימות חשובה בעת שימוש בכל מערכת מודל. חומרי הדפסה רגילות לצמיחה ביופילם של האורגניזם המיועד מומלצות התקנה ראשונית של המערכת. אם מטרת הניסוי היא זיהויify כיצד מוצרים אקסוגניים המשפיעים היווצרות ביופילם, מדיה עשירה מזינה מספקת מוצעת היווצרות ביופילם נאותה. זה יאפשר מספיק תזונה לצמיחה תוך קביעת כיצד גורמים אקסוגניים עשויים להשפיע על ביופילם. תקשורת נוספת, כגון תקשורת מינימאלית או מוגדר, ניתן להשתמש לתנאים מסוימים לחקות טוב יותר. מדיה אחרת שמשה עם תוצאות טובות במערכת זו (מידע לא מוצג). הקובץ המצורף של biofilms כדי coverglass החדרים הוא איתן, אולם בזהירות רבה יש לנקוט בעת הסרה / הוספת מדיה או במהלך שלבי כביסה של biofilms למנוע שיבוש biofilms.

שימוש הכתם החי-מת לפי הפרוטוקול של יצרן ניב תוצאות טובות עבור המערכת המתוארת. מספר גורמים יכולים להשפיע על היחס הקרינה של תמונות (כולל ספיגת צבע של חיידקים, הצפיפות היחסית של הגדרות רווח ביופילם גלאי), לעומת זאת, שיטה זו צריכה להתייחס למה שרואים בתמונהים. אמצעים אחרים עשויים לשמש לייצג את הכמות היחסית של ביופילם מת / חי, כגון ביומסה מן התאים המתים כיחס של ההווה ביומסה סך ביופילם (כפי שנגזר לסטטמ"מ). באמצעות ספירת חיידקים כדי לאשר כדאיות ביופילם בניסויים חוזרים מומלץ לאשר את התצפיות החזותיות של המודל הזה. בשל ההטרוגניות טבועה של biofilms, מספר רב של תמונות מכל תא ותא מרובה אמורות לשמש עבור כל תנאי בניסוי. זה מוסיף לעלות ומשך ניסויים אלה.

רכישת התמונות חשובה לפני ניתוח נתונים מניסויים אלה. יש להקפיד לא מעל להרוות תמונות בקביעת התקנת מיקרוסקופ. בהתאם לרמת הפירוט הנדרשת ואת מיקרוסקופ זמין, מספר מטרות שונות (10X, 25x, 40X ו 63X) ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות, אם כי אנו מוצאים כי המטרה 25x נותן תמונות טובות יותר. העובי של tהוא מחסנית Z יכול להשפיע גם על איכות התמונה הכוללת ואת רמת הפירוט. לאחר תמונות שצולמו בכל 0.5-1 מיקרומטר נראה לספק תמונות ברורות ב 25x אובייקטיבי, תוך שמירה על תמונות מחסנית Z בגודל שיכול להיות מנותח על ידי סטטמ"מ על מערכות מחשב רגילות.

ניסויים אלה הם יקרים יותר וזמן רב יותר מאשר מבחני תוספת אחרים, ולא ניתן לעשות זאת באופן תפוקה גבוה. בהליך זה, חיידקים לצרף משטח בורוסיליקט, אשר אינו משקף מצב in vivo ועלול להשפיע היווצרות והתפתחות ביופילם. עם זאת, הם מספקים מידע נוסף ניתן להפיק השערות עבור מנגנון הקשורים biofilm עמידות לאנטיביוטיקה ותגובה פיזיולוגית אות אקסוגני. אם מטרת הניסוי היא להבין כיצד biofilms להשתנות בתגובה לגורמים שונים, ולא בזיהוי תרכובות אנטי biofilm באמצעות שיטות תפוקה גבוהה למשל, המידע הנוסף מתבצע באמצעות tהטכניקה שלו הופכת את השיטה כדאית. לכן השיטה הנוכחית היא התקדמות משמעותית על מבחנים מצורפים מוגבלים קודמים כגון assay הסגול קריסטל, אשר הוא נפוץ ביותר ללמוד biofilms.

צעדים קריטיים נוהל זה כוללים: 1) הבטיח עיבוד בזמן של דגימות כיח כדי למנוע שפלה; 2) להיות עדין עם שינויי תקשורת על biofilms כדי למנוע שיבוש של ביופילם ו -3) עושים מדידות חוזרות של הדמיה ביופילם כדי להבטיח ייצוג מדויק של עובי ביופילם בשל ההטרוגניות של היווצרות ביופילם.

ברגע שמערכת הגדרה עבור זן חיידקים מסוים, אפשר לבדוק מספר תנאים שונים, לרבות שפעת גורמים חיצוניים על בידודים קליניים מרובים. מערכת זו נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של אנטיביוטיקה על biofilms חשופים כיח אדם ¹⁶ ולהשוות עמיד מאוד ועמיד intermediately מבודד קליניים. ¹⁷ שינויים כדי coverglass החדרים, כגון ציפוי תחתון עם פיגום-מייקרו mucin או קולגן (למשל, puracol), יכולים להרחיב את הטווח של ניסויים אפשריים. ייתכן שניתן יהיה להתאים מערכת זו כדי לחקור אינטראקציות ישירות, כמו אלה שבין תאי אפיתל וחיידקים, או בין סוגי חיידקים שונים. זוהי הרחבה של המודל שתואר על ידי אל Jurcisek et. ²⁰ השיטה משתמשת צמיחה קאמרית שקופיות דומה לזה שתואר כאן ומשתמש פורמלין לתקן biofilms לפני להדמיה. לחלופין, בשיטה זו אנו לחזות biofilms מייד לאחר מכתים ואל תשתמשו מקבע. בנוסף, אנו מוסיפים גורמים אקסוגניים כדי לבדוק את ההשפעה של אנטיביוטיקה על biofilms. מודל זה ולכן יש פוטנציאל לקדם את ההבנה שלנו באופן משמעותי של biofilms חיידקי מחלות אנושיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf