Visualisera effekterna av Sputum på Biofilm Development Använda en Chambered coverglass Model

Abstract

Biofilmer består av grupper av bakterier inneslutna i en själv utsöndras matris. De spelar en viktig roll i den industriella föroreningar samt i utvecklingen och uthållighet av många hälsorelaterade infektioner. En av de mest väl beskrivna och studerade biofilmer i mänskliga sjukdomar förekommer i kronisk lunginfektion av patienter med cystisk fibros. När man studerar biofilmer i samband med värden, kan många faktorer påverkar biofilm formation och utveckling. För att identifiera hur värdfaktorer kan påverka biofilm bildning och utveckling, använde vi en statisk kammarcoverglass metod för att växa biofilm i närvaro av värdhärledda faktorer i form av sputum supernatanter. Bakterier ympas in kammare och utsätts för sputum filtraten. Efter 48 timmar av tillväxt, är biofilmer färgades med en kommersiell biofilm lönsamhet kit innan konfokalmikroskopi och analys. Efter bildtagning, kan biofilm egenskaper bedömas med hjälp av olika mjukvaruplattformar.Denna metod gör det möjligt att visualisera de viktigaste egenskaperna hos biofilm tillväxt i närvaro av olika ämnen inklusive antibiotika.

Introduction

Bakteriella biofilmer är grupper av mikroorganismer som är kopplade till varandra och inneslutna i en själv utsöndras matris. ^1,2 Klassiskt, de representerar bakterier fysiskt bundna till en abiotisk eller biotiska yta som bildas under förhållanden med flöde. Biofilmer har också visat att växa under statiska förhållanden (avsaknad av flöde) och distalt från ytor, såsom vid luft-vätske-gränssnittet för termalbad eller pellicles bildats i provrör. Dessa biofilmer har länge varit känt i miljön och är en stor nackdel för industriella processer, eftersom de kan bildas i vattenmagasinen eller i rör, vilket resulterar i biobeväxning, korrosion och blockeringar. ^3,4

Biofilmer är också kritisk i vårdmiljöer, eftersom de har visats vara inblandade i kateterrelaterade infektioner, lunginfektioner hos patienter med cystisk fibros, liksom i många andra infektioner. ^5,6 Ett av kännetecknen för biofilminfektioner är deökad känslighet för bakterier mot antibiotika och försämrad clearance av det medfödda immunförsvaret. ^7-9 Den mest studerade, kliniskt relevanta scenarier med biofilm-baserad infektion uppstår hos patienter med cystisk fibros (CF), som är kroniskt infekterade med Pseudomonas aeruginosa biofilmer. P. aeruginosa kan genomgå ett antal förändringar under etablering av kronisk infektion som gör det mycket svårt att behandla. ^10,11 Biofilmer kan differentiellt aktivera medfödd immunitet och driva inflammation. ^12-14 Eftersom dessa infektioner leder till ökad sjuklighet och dödlighet i CF-patienter, är det viktigt att förstå faktorer som kan påverka biofilm utveckling i detta sammanhang.

En nyligen genomförd studie visar att värdfaktorer är kritiska i bildandet av P. aeruginosa biofilm aggregat. ¹⁵ Dessa biofilmer bidra till minskad känslighet för antibiotika och värd försvarsmekanismer. den preseiou av värdhärledda faktorer, såsom neutrofilelastas, såväl som utsöndrade produkter från mikroorganismer som finns i CF lungan, har potential att i hög grad modulera biofilmbildning och utveckling. ¹⁶ Dessutom biofilmer interagerar med värden för att modulera uttrycket av många vägar och initiera inflammation. Medan high throughput metoder, såsom standardkristallviolett analys kan ge viss information med avseende på biofilmsprocessen, visualisering av biofilm som svar på dessa faktorer ger mer detaljerad information.

I detta manuskript beskriver vi en metod för att använda faktorer från sputum från patienter med CF för att studera utvecklingen av biofilmer in vitro. Denna metod möjliggör snabb visualisering av biofilmer som utsätts för sputum innehållande värdfaktorer med hjälp av en kommersiell biofilm lönsamhet kit. Denna teknik kan användas för att visuellt identifiera förändringar som sker under biofilm tillväxt i närvaro av exogenooss produkter, och representerar en förbättrad metod för att analysera förändringar i biofilm utveckling under olika förhållanden.

Protocol

Observera att forskningsetik Board (REB) krävs för att samla in och lagra sputumprov från människor. Dessa studier har godkänts av sjukhuset för sjuka barn REB # 1000019444.

1. Förbereda CF sputumprov

1. Samla sputumprov från patienter under rutinbesök till cystisk fibros klinik och hålla på is.
2. Transportera slem provet på is inom den första timmen av insamling, till forskningslaboratoriet, att genomgå behandling.

2. Sputum Processing

1. Registrera volymen av upphostningsprovet erhålls. Lägga fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 2x volymen av provet (dvs, 2 delar PBS, 1 del prov).
2. Blanda provet väl med en pipett. Vortex provet på den högsta inställningen under 1 minut för att blanda helt.
3. Alikvotera 1 ml av ovanstående blandning i lämpliga antal 1,5 ml mikrocentrifugrör och spinn ner vid 5000 xg under20 min vid 4 ° C.
4. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och kasta pelleten.
5. Filtersterilisera supernatanten genom ett 0,22 pm filter och samla i ett rent mikrocentrifugrör.
   OBS: Sterilitet filtrat testas genom utstrykning på LB-agar och ympa flytande medier.
6. Förvara slem supernatanten vid -80 ° C för framtida bruk.
   OBS: Sputum från flera patienter kan också slås samman efter filtrering.
7. Före användning, späd slem filtrat 1/10 v / v (100 pl av slem, 900 ul av media) i önskat media.
   OBS: Här var standard lysogeni buljong (LB) media som används.

3. Chambered coverglass Metod för biofilm bildning

1. Växa bakteriellt isolat av intresse över natten i önskat media vid 37 ° C med skakning (200 rpm).
   Obs: Ett antal olika bakterier användas, innefattande kliniska isolat av Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Burkholderia cepacia komplex och Achromobacter xylosoxidans. Val av media beror på stammar och villkor av intresse, men LB media kan användas för inledande experiment.
2. Från odling över natten, placera 40 pl kultur i 4 ml färskt medium och växa under 3-4 h vid 37 ° C med skakning (200 rpm) för att erhålla en kultur med en optisk densitet vid 600 nm (OD ₆₀₀₎ om cirka 0,5 -0,6.
3. Späd kulturen från steg 3,2 till 1/5 i önskat media med 10% slem filtrat eller utan sputum filtrat (som kontroll). Annan koncentration av sputum filtrat kan testas (dvs., 50% eller 100%).
4. Använd 200 pl av utspädning till utsäde brunnar i glidkamrar.
5. Låta bakterier fästa under 4 h vid 37 ° C utan skakning.
6. Efter 4 timmar, ta bort media och försiktigt tvätta biofilmen med 1x färskt medium. Ersätt med 200 pl färsk media.
   OBS: För att studera effekterna av slem på biofilmen, de fresh medier bör innehålla slem vätskan.
7. Låt biofilmer att växa för önskad tid vid 37 ° C utan skakning, ersätta media varje 12 timmar, utan tvättning tills tiden för mikroskopi.
   OBS: För att studera effekten av sputum supernatanter på biofilm antibiotikakänslighet, antibiotika till mediet efter 24 h av biofilm tillväxt och upprätthålls i media tills färgning och avbildning av biofilmer.

4. Färgning Biofilmer och konfokalmikroskopi

1. Efter önskad tillväxt tid (24-48 timmar fungerar bäst), ta bort media från kammarbrunnar och försiktigt tvätta varje kammare två gånger med 300 pl steril PBS.
2. Förbered färgning blandning för biofilm genom att blanda 1 pl av varje färgämne (förutsatt i livskraft kit) för varje ml lösning behövs. Gör färgämne i vatten eller media lösning.
   OBS: Vatten rekommenderas av tillverkaren.
3. Tillsätt 200 ul av färgämnesblandning till varje brunn i kammar coverglass och inkubera vid rumstemperatur i mörker under 45 min.
4. Ta bort fläckar blandning av kamrarna och tvätta varje brunn med 300 pl steril PBS. Ta bort PBS och ersätta med färskvatten eller media.
5. Fortsätt med visualisering av biofilmer via konfokalmikroskopi.

5. visualisera Biofilmer med konfokalmikroskopi

1. Läs färgade biofilmer i kammare omedelbart efter färgning (inom 1 timme). Minimera fördröjning i visualisering av bilderna genom färgning 1 till 2 8-brunnars kammare i taget.
2. Utför avbildning med konfokalmikroskop med lasrar för excitation och filteruppsättningar för förvärv.
   OBS: Här, den snurrande skiva konfokala systemet med spektrala borealis lasrar (Grön: 491nm, Red: 561 nm) användes för excitering. Emissionsfilter uppsättningar av 515/40 och 624/40 användes för att visualisera de fläckar från biofilmen viabilitet kit.
3. Ta bilder med hjälp av en 25X vatten objektiv på konfokalmikroskop med kamera.
4. Ta 3-5 bilder från varje brunn.
   OBS: Så för en 8 väl chambered coverglass, kommer 24-40 bilder skapas.
5. Spara bilder för analys.
   OBS: Bilderna ska sparas som OME-TIFF-filer som ska analyseras med hjälp av COMSTAT ^18,19. Instruktioner för biofilm bildanalys kan hittas på http://www.comstat.dk/. När bilderna har importerats kan parametrar såsom genomsnittliga tjockleken, biomassa och yttäckning för varje kanal (röd och grön) analyseras.

Representative Results

Den övergripande utformningen av experimentet representeras i figur 1. Användningen av detta protokoll ger en bekväm metod för att synliggöra förändringar i biofilmer odlas för olika tidsperioder (t.ex. 24, 48 eller 72 timmar). Viktigare, exogena signaler, såsom sputum filtraten, tillsättas för att visualisera förändringar i biofilmutveckling. Såsom framgår av fig 2, kan förekomsten av 10% sputum filtraten ändra arkitekturen i biofilmen (Figur 2A, lägre panelerna). ¹⁶ Dessa bilder kan analyseras med hjälp av COMSTAT programvara för att erhålla viktiga biofilm matriser, inklusive genomsnittliga tjockleken av biofilmen, totala biomassan och yttäckning. Detta återspeglas i en total ökning av biofilm tjocklek (fig 2B, och 3). ¹⁶ Effekterna av antibiotika på biofilm i närvaro sputum visas i figur 3. genom visuali zing förändringar i biofilm utveckling, kan man bättre förstå hur olika faktorer kan påverka biofilm tillväxt, till en mycket bättre utsträckning än traditionella biofilm analyser, såsom kristallviolett färgning.

Figur 1: Total försöksplanering. Flödesdiagram av grundprotokollet. En över natten (O / N) kulturen späds 1/1000 och fick växa till en slutlig OD ₆₀₀ av 0,5. Detta spädes ytterligare 1/1000 och 200 ^ ympas in i brunn av chambered coverglass och fick fästa i 3 till 4 timmar. Efter detta avlägsnades mediet och ersattes med färskt medium. Biofilmer tillåts växa för önskad tid. Media kan exogena eller antibiotika tillsättas till biofilmer. Efter tillväxt, är media avlägsnas, biofilmer är färgade och konfokal avbildning utförs.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Representant bilder av biofilm utveckling efter exponering för sputum filtraten. (A) Representativa bilder av Burkholderia cepacia komplex (BCC) kliniska isolat efter 48 h tillväxt i chambered coverglass med enbart (krönskivor) media eller i närvaro av 10% sputum filtraten (lägre paneler), följt av färgning med biofilm livskraft kit. En skala enhet representerar 19,68 pm. (B - C) Genomsnittlig tjocklek isolat (B) och döda: levande förhållande (C) av flera bilder av BCC isolat odlas för 48 timmar i glidkamrar i frånvaro (vita staplar) eller närvaro (svarta staplar) av slem filtraten. Varje stapel representerar medelvärdet av 45 bilder ritasmed standardfelet av medelvärdet. ** P <0,001 jämfört med kontroll (media enbart) med användning av Kruskal-Wallis test. Figur anpassad från Kennedy et al. ¹⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representativa bilder av antibiotikabehandling på biofilmer utsatta för slem filtratet. (A) Bilder av Burkholderia vietnamiensis kliniska isolat efter 48 h tillväxt i chambered coverglass med enbart media (vänster) eller i närvaro av 10% sputum filtraten (höger) med eller utan 1000 mikrogram / m tobramycin. Biofilmer odlades under 24 h i medium enbart eller medium med tillsats av 10% (volym / volym) sputum filtraten. Efter 24 h tillfördes mediet avlägsnades och ersattes med medien (+/- sputum) innehållande antibiotika. En skala enhet representerar 19,68 pm. (B - C) Genomsnittlig tjocklek isolat (B) och döda: levande förhållande (C) av flera bilder (n = 9) av B. vietnamiensis isolat odlas för 48 timmar i glidkamrar i närvaro eller frånvaro av slem filtraten. Varje stapel representerar medelvärdet av 45 bilder ritas med standardfelet av medelvärdet. ** P <0,001 jämfört med kontroll (0 | j, g / ml) med användning av Kruskal-Wallis test. Figur anpassad från Kennedy et al. ¹⁶ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

De metoder som beskrivs häri medger visualisering av bakteriella biofilmer som odlats i närvaro av exogena produkter. Inte överraskande, är produktionen av exoproducts av betydelse när man använder denna typ av system. Exempelvis ditiotreitol (DTT), används ofta på humana sputumprover att hjälpa vätskeform proverna. Däremot kan effekten av DTT enbart minska biofilm utveckling och lönsamhet (data visas ej). Således, ordentliga kontroller för alla villkor är nödvändiga. Vidare tillsatsen av humant slem produkter skapar normala variationer om försöket på grund av det faktum att sputum hos varje patient har en unik microbiome. Att justera för detta, har vi använt poolade sputumprov att undvika patientspecifika resultat. Dessutom är det viktigt att välja rätt material vid användning av någon modellsystem. Standard medier för biofilm tillväxt avsedda organismen rekommenderas vid den inledande installationen av systemet. Om målet med experimentet är att identlikrikta hur exogena produkter påverkar biofilm formation, är en näringsrika medier som ger tillräcklig biofilmsbildning föreslås. Detta kommer att ge tillräcklig näring för tillväxt samtidigt bestämma hur yttre faktorer kan påverka biofilm. Andra medier, såsom minimalt eller definierade medier, kan användas för att bättre härma vissa villkor. Andra medier har använts med goda resultat i detta system (data visas ej). Fastsättningen av biofilmer till chambered coverglass är robust, måste dock stor försiktighet iakttas när du tar bort / lägga till media eller under tvättningsstegen av biofilmer för att förhindra störa biofilmer.

Användningen av levande döda fläcken enligt tillverkarens protokoll har gett goda resultat för det beskrivna systemet. Ett antal faktorer kan påverka fluorescensförhållandet av bilderna (inklusive färgupptagning av bakterier, relativ densitet av biofilm och detektorförstärkningsinställningar), bör dock denna metod hänför sig till vad som observeras i bildens. Andra åtgärder kan användas för att representera den relativa mängden av döda / levande biofilm, såsom biomassa från de döda celler som ett förhållande av den totala nuvarande biomassan i biofilmen (som härrör från COMSTAT). Använda bakterietal att bekräfta biofilm lönsamhet i upprepade experiment rekommenderas att bekräfta de visuella observationer av denna modell. På grund av inneboende heterogenitet biofilmer, bör flera bilder från varje kammare och ett flertal kammare användas för varje tillstånd i ett experiment. Detta ökar kostnaden och varaktigheten av dessa experiment.

Förvärvet av bilder är viktigt före analys av data från dessa experiment. Man måste vara försiktig att inte över mätta bilder och vid fastställandet mikroskop setup. Beroende på den detaljnivå som krävs och mikroskopet tillgängliga, kan ett antal olika mål (10X, 25X, 40X och 63X) kan användas för att få bilder, även om vi tycker att 25X mål ger bättre bilder. Tjockleken på than Z-stack kan också påverka den totala bildkvaliteten och detaljnivå. Med bilder tagna var 0,5-1 um verkar ge tydliga bilder på 25X mål, samtidigt som de Z-stack bilder i en storlek som kan analyseras genom COMSTAT på standard datorsystem.

Dessa experiment är mer kostsamt och tidskrävande än andra fastsättnings analyser, och kan inte göras i en hög genomströmning sätt. I detta förfarande, bakterier fäster en borsilikat yta, som inte ger uttryck för en in vivo tillstånd och kan påverka biofilm bildning och utveckling. Men de ge ytterligare information och kan generera hypoteser för mekanism för biofilm antibiotikaresistens och fysiologiska svaret på exogen signal. Om målet med försöket är att förstå hur biofilmer förändras till följd av olika faktorer, snarare än att identifiera anti-biofilm föreningar med hjälp av hög genomströmning metoder till exempel, den ytterligare information som gjorts med hjälp av thans teknik gör metoden värt. den nuvarande metoden är således ett betydande framsteg jämfört med tidigare begränsade fäst analyser såsom kristallviolett analys som oftast används för att studera biofilmer.

Kritiska steg i detta förfarande inkluderar: 1) säkerställa snabb behandling av slemprover för att undvika nedbrytning; 2) Att försiktig med medie förändringar på biofilmer att undvika störningar av biofilm och 3) göra upprepade mätningar av biofilm bildbehandling för att säkerställa en korrekt representation av biofilmen tjocklek på grund av heterogenitet biofilmbildning.

När systemet är inställd för en given bakterieart, kan man testa ett antal olika villkor, inklusive effekter av yttre faktorer på flera kliniska isolat. Detta system har använts för att studera effekten av antibiotika på biofilmer exponeras för humant slem ¹⁶ och att jämföra mycket resistenta och mellanliggande resistenta kliniska isolat. ¹⁷ Ändringar av chambered coverglass, såsom beläggning i botten med mucin eller kollagen mikro-ställningen (t.ex. puracol), kan ytterligare utöka utbudet av experiment möjliga. Det kan vara möjligt att anpassa detta system för att studera direkta interaktioner, såsom de mellan epitelceller och bakterier, eller mellan olika bakteriearter. Detta är en utvidgning av den modell som beskrivs av Jurcisek et al. ²⁰ Metoden använder glidkammaren tillväxt liknar den som beskrivits här och använder formalin för att fixera biofilmer före visualisering. Alternativt, i denna metod som vi visualisera biofilmer omedelbart efter färgning och inte använder en fixerings. Dessutom lägger vi yttre faktorer för att testa effekten av antibiotika på biofilmer. Denna modell har således potential att avsevärt öka vår förståelse av bakteriella biofilmer i mänskliga sjukdomar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf