Abstract
条件付きで再プログラムされた細胞（CRCが）初代培養細胞と患者由来細胞株の大規模な「生きたバイオバンク」を開発する能力のための持続可能な方法を提供します。上皮細胞の多くのタイプのために、様々な3次元（3D）培養アプローチは、改善された分化状態をサポートすることが記載されています。 CRCが、それらが分離されている、そこから組織への系統コミットメントを保持するが、それらは通常の2次元（2D）培養条件下で増殖させた場合起源の組織に関連分化マーカーの多くを発現しません。前立腺癌の研究のための患者由来のCRCのアプリケーションを強化するために、3D培養形式は、正常および腫瘍由来の前立腺上皮細胞の両方の急速な（2週間合計）管腔細胞分化を可能にするように定義されています。ここで、フィルタインサートベースのフォーマットは、正常および悪性の前立腺のCRCの両方の培養および分化のために記載されています。デ免疫組織化学および免疫蛍光染色のための細胞の収集および処理に必要な手順の尾説明が提供されます。総称して、プライマリCRCラインと組み合わせて説明した3D培養フォーマットは、生物試料ベースの前立腺研究のためのスループットモデルシステムを高するための重要な中長期を提供します。
Introduction
個人にパーソナライズされた癌治療の同定および使用は、癌研究における第一の目標です。最近、新しいアプローチが開発されており、潜在的に識別し、パーソナライズされた治療法をテストし、両方の方法を提供し、初代細胞培養の確立でより容易にするために可能にします。例えば、Rスポンジンベース前立腺オルガノイドアプローチ1は、セルの条件付き再プログラミング（CRC）法が、商業外マトリクス（ 例えば 、マトリゲル）中の正常および転移性前立腺癌細胞の三次元（3D）培養を可能にしますジョージタウン2、3で開発は、より標準的な2D培養条件を利用します。具体的には、Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632）、照射J2マウス線維芽細胞フィーダー細胞の組み合わせは、ケラチノサイトのCRC 2の不定培養をもたらします。 CRC方法であります極めて堅牢、初代細胞株が正常に確立し、前立腺癌および他の多くの正常および悪性上皮組織3から無期限に維持したまま。重要なことは、私たちのCRC技術は、以前の薬物治療の数を失敗していた患者における再発性呼吸器乳頭腫症のための病因の基礎の迅速な同定を可能にしました。また、正常および腫瘍由来のCRCを使用して、FDAの成功同定は、薬物、ボリノスタットは、初期の組織生検の2週間以内に行われた承認されました。患者は、その病気4の成功した治療の結果、ボリノスタット上に置きました。
正常な前立腺は管腔、基底と希少な神経内分泌細胞5から構成されています。管腔細胞が腺の円柱上皮層を形成し、アンドロゲン受容体（AR）、ならびにサイトケラチン8と18とプロのような他の管腔マーカーを発現します状態特異的抗原（PSA）6。逆に、基底細胞が管腔層の下に局在し、サイトケラチン5およびP63が、AR 5を低レベルで発現しています。私たちは、7、8、9、その他10が正常に前臨床メカニズムの薬剤感受性調査で前立腺CRCを使用しています。標準2D組織培養条件下で増殖させた場合しかし、これらの細胞は、完全に10シグナリング ARに係合することができません。免疫不全マウスの腎被膜下に置かれたとき重要なのは、CRCは許容する環境に置かれたとき、前立腺CRCがその系譜コミットメントを維持していることを示す正常前立腺腺のアーキテクチャと機能を取り戻しました。ここで説明したフィルタインサート基づく細胞培養系の開発が急速に（2週間）のために証明さbと前立腺のCRCのインビトロ分化を可能にします増加したARとAR標的遺伝子の発現と同様には、P63のレベルを減少させたY。
使用されるフィルタインサートは、哺乳動物細胞の培養を支持することができるポリカーボネート膜（孔径0.4μm）を含みます。システムは、開発され、正常および悪性前立腺のCRC、6ウェル培養皿とフィルタインサートを利用します。 J2セル11によって調整細胞培養培地を上部チャンバーに下部チャンバと前立腺分化培地中に置かれます。本明細書に記載の技術は、個別化医療の目標と一致して2週間の時間枠内に前立腺管腔細胞分化をサポートしています。文化の総合的、分子遺伝学および細胞プロファイリングを可能にする方法論を開発することも不可欠でした。フィルター表面から放出された細胞からのDNA、RNAおよびタンパク質を単離するための手法が開発され、正確な反復サンプル処理のための合理化されています。フィナLLY、埋め込みを有効にするフィルタを削除切片とH＆E、免疫組織化学および免疫蛍光染色のために必要な方法論は、完全に記載されています。
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Protocol
3D細胞培養インサートシステムの1.設立
- 6ウェルプレート（ 図1A）にダウン逆方向（フィルタ側まで）で2ポリカーボネート細胞培養インサートを配置します。
- インサートの底面側に水中0.1％ゼラチンの薄い層を適用し、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの中で（10〜20分間）乾燥させます。
- 手順を繰り返し1.2インサートに0.1％ゼラチンの3アプリケーションの合計2回以上。
注：ゼラチンコーティングは、チャンバ間の拡散を制限するのに役立ちます。 - 培養フラスコを洗浄するためのPBS 5 mLを加え、標準的な培養条件から主CRCを収集します。
- 37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA（T-75のためのT-25及び2mLのために1 ml）を用いて細胞をトリプシン処理。細胞を穏やかに取り除くのを助けるために、フラスコの側面をタップします。その後トリプシン反応を停止し、完全DMEMを5ml加えることにより細胞を収集するために進みます。
- 集めます 15 mLチューブ内の細胞。 4℃、188×gでチューブを遠心し、自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用してカウントされます。
- メディア（CM）を条件付け250μL60万CRCを再懸濁し、適切に配向（フィルタ側を下に）カルチャーインサート（ 図1B）に追加します。これは、内部チャンバと呼ばれています。
注：CMは、照射J2細胞によって条件付けF-メディアであると以前に7、8、9、11を説明したように10μmのY-27632が含まれています。
- 6ウェルプレートの外側室にCMの2ミリリットルを適用し、（少なくとも18時間）、37℃で一晩インキュベートします。
- 慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットを用いて内部チャンバにCMを削除して、ゆっくりと完全になるまで1 mLのピペットで内室に分化培地（DM）を追加します。細胞層を乱さないように注意してください。
- 毎日文化を確認してください。 図2に示すように、健康な細胞が出現します。
- 外側チャンバ内のCM毎日または細胞の代謝に応じて一日おきに変更します。
- 内部チャンバのメディアは、色（黄色）を変更する場合は、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部フィルター室にメディアを削除します。
- 吸引先端を有する外側6ウェルプレート室でメディアを吸引除去します。
- 1 mLのピペットを使用して、ゆっくりと完全になるまで、内側室に新鮮なDMを適用します。こすりまたはその他の細胞層を落とさないように注意してください。
- 新鮮なCM 2mLで外側室でメディアを交換してください。
- 2週間の文化を維持し、目的の生体分子の分離のための処理に進みます。
注：6ウェルプレートの各行は、6インサート（ 図1B）の合計は、DNのための十分な細胞を取得するために、実験ごとに処理する必要があります分析のために、RNAまたはタンパク質。 - 外側チャンバ内を吸引メディアとは、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいでください。
- 慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内側チャンバからメディアを取り出し、500μLのPBSを追加します。スクレイピングまたはそうでなければ、膜上の細胞を乱すことは避けてください。
- 吸引除去し、PBS外側チャンバから、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部チャンバーからPBSを削除します。 PBSを除去した後、以下に詳述する適切なアプリケーションに直接進みます。膜を乾燥させないでください。アプリケーションを開始する準備ができるまで、文化はPBSで簡単に維持することができます。
3.ペレットバンキング用フィルターの処理
- 各内部チャンバ100μL、0.25％トリプシン-EDTAを加え、37℃で5分間インキュベートします。
- （puncを避ける上下にピペッティングとしながら、200μLピペットで膜表面上の細胞をこすり/簡単に言えば、慎重に攪拌）膜をチューリング。 37℃で1分間インキュベートします。
- フィルターを洗浄するために静かに上下最初の内室とピペットにCMの250μLを追加します。
- 転送は、同じメディア条件が含まれており、上下にピペッティングを繰り返し、隣接するフィルタ室に細胞を再懸濁しました。
- 単一条件の挿入ごとに、この手順を繰り返します。収集し、1.5 mL遠心チューブに細胞を移します。
- 残りの細胞を収集するために、CMの追加の100-200μLで各内側チャンバを洗い流します。ステップ3.5で1.5 mLの遠心分離管に追加します。
- 5分間、4℃で微量で423×gで細胞をスピン。
- 上清を吸引除去し、1000年μLPBSで一度細胞ペレットを洗浄します。
- 5分間、4℃で微量で423×gで再びスピン。
- 吸引し、PBS、後で使用するために-80℃で凍結。
4. RNAまたはDNAの単離のためのフィルタの処理
- フィルタは、挿入から解離することができるように、上下に抽出溶液をピペットで解離し、フィルター膜を洗浄してください。 6ウェルプレートを傾けると、残留液体を吸引することにより、可能な限り抽出試薬をできるだけ多く収集します。
5.タンパク質単離のためのフィルタの処理
- 氷上で6ウェルプレートにフィルタインサートを置きます。内側チャンバーに、10μLの1mMフッ化ナトリウム（NaF）、1mMのバナジン酸ナトリウム（NAV）、100mMのdithiothreを補充したタンパク質の溶解緩衝液を追加ITOL（DTT）および抗プロテアーゼカクテルの100μL。
- /攪拌上下にピペッティングしながら20μLピペットで膜表面上の細胞をこすり取ります。溶解緩衝液中に気泡を発生させることは避けてください。
- 10分間氷上でフィルターインサートで6ウェルプレートをインキュベートします。
- 掻き繰り返し、次いで溶解緩衝液で膜表面をすすぎます。
- 6インサートからの溶解物を収集し、氷上で1.5 mL遠心管に移します。
- 溶解緩衝液の追加の10μLと第一の膜をすすぎ、次のフィルタに転送します。
- すべての挿入を繰り返しステップ5.6、任意の残留溶解緩衝液を収集し、1.5 mLのチューブ（ステップ5.5）に追加します。
- さらに5分間氷上でサンプルをインキュベートします。
- 4℃で15分間、最高速度（テーブルトップ遠心分離機で16873×gで）でスピン。
- 新鮮な1.5 mLのチューブにピペット溶解液上清。
- タンパク質濃度やSTOの分析に進みます-80℃での溶解物の再。
6. H＆Eの処理及び免疫染色
- 内側と外側のチャンバーに500μL、10％NBF（中性緩衝ホルマリン）の1 mLを加え、4℃で一晩インキュベートしましょう。
- 外側室からNBFを吸引し、1 mLのヒドロキシエチルアガロース（HEA）1.5 mL遠心に処理ゲルを追加します。ゆっくりと低消費電力を使用して電子レンジでアガロースを融解し、アガロースが溶けるまで、10から20秒のパルスを繰り返しました。
- 使用する準備ができるまでの凝固を防ぐために、37℃の温浴中でHEAを保管してください。
- 内側チャンバからNBFを外し、内部チャンバに溶融HEAの25μLを適用し、アガロースは、2-5分間固化することができます。
- ウェット2発泡組織学パッドを10％NBF中と包埋カセットに一つのパッドを配置する（ 図3Dを参照）。
- インサートの底面側からフィルタを獲得するために（非常に鋭い、微尖った刃を持っている）＃11ブレードメスを使用しますチャンバーは、部分的にプラスチック製のインサート室からそれを解放します。
- ペトリ皿にNBFの少量（100〜200μL）を配置し、NBF（ 図3A）で部分的に外れフィルタを浸します。
- ＃10ブレードメスで、静かに完全に挿入バレル（ 図3B）からフィルタを取り除くために、インサートチャンバーの内側から、フィルタの中央押し付けます。まだバレルに取り付けられているフィルタの任意の部分がある場合には、メスを用いてそれを切断します。
- ＃10ブレードメス（ 図3C）で半分にHEAコーティングされたフィルタをカットします。
- ステップ6.4（ 図3D）で作製した組織学カセットにフォームパッドの上にフィルタの各半分を置きます。
- フィルタを挟んで、カセットに2つ目の10％NBF浸したスポンジを追加します。
- スナップNBFカセット、場所を密封し、一晩インキュベートします。
- 切片や染色などのためにパラフィンブロックへのプロセスフィルター以前12記載。
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Representative Results
細胞培養インサートに基づくシステムは、管腔細胞分化をサポートしている前立腺のCRCの3D培養物を作製するための比較的単純かつ迅速な方法です。システムの概略フィルタインサートの下面にゼラチンコーティングの適用を強調し（ 図1A）が示されています。インサートはゼラチンのみの適用のために覆されています。 図1Bにフィルタが培養のための適切な向きです。透明セルの挿入を使用して、健康的な3D前立腺CRC文化の代表画像は（10X）（ 図2）に示されています。実証健康のCRCの密な階層化は、設立後典型的であり、標準的な光学顕微鏡を用いて可視化することができます。最初の確立時に、この方法は、所定の細胞株およびその適切な添付ファイルやラと互換性があることを確認するために形成された細胞の層を可視化することが重要です細胞のイエリングが発生しています。
上記のようにHEAはインサートの内側に塗布されます。インサート（ 図3A、3B）からそれを除去するためのフィルタを採点する際HEAを塗布した後、注意が必要です。すべてのステップ（ 図3A〜3D）では、ケアはまた、細胞とフィルター上HEA層の無駄な動きを最小限に抑えるために行使されなければなりません。 CRC層が容易に破壊し、H＆Eカセット（ 図3D）への転送中に損傷を受けることができます。プラスチックバレル（ 図3A-3C）からHEAコーティングされたフィルタを切除した後、フィルターを半分にすることができ、切片と標準包埋カセット（ 図3D）を用いて染色のために処理しました。半分にフィルタを分割するH＆EとIFでの横断研磨のために利用可能な表面を最大にすることが重要です。
免疫蛍光染色同様に明視野（BF）としてフィルタ層上で培養した細胞の画像は、DSU（ディスクスキャンユニット）スピニングディスク共焦点機能を備えた顕微鏡を用いて収集しました。組織学およびH＆E染色のための代表的な結果をフィルターインサートおよび細胞（20X）（ 図4）の断面図で示されています。適切なケアでは、我々は組織の組織学のための標準的であるように、フィルタインサートのCRC層は、切片と染色することができることを実証しています。切片の間には（ 図4）に示されたようにCRCが細胞の完全な層としてのフィルターから剥離することになることが可能です。 BFの画像は、多孔質膜（ 図5A）の上に多層セル地層を示しています。すべての3つの蛍光マーカー（ 図5E）のマージであるように、核（DAPI、 図5B）のための個々の蛍光画像は、P63（ 図5C）及びAR（ 図5D）は 、示されています。最後に、コンポジット細胞やフィルタへの蛍光シグナルの相対的な局在を確立する電子のBFとオーバーレイが表示されている場合（ 図5F）、。染色IF P63とDAPI染色のオーバーレイは明らかに増殖状態で、まだいくつかのセルを示しています。核におけるARの局在染色IFは、前立腺細胞におけるARの機能的活性化の指標です。
我々のフィルタ挿入システムのIF及び切片前立腺組織との間の比較は、前立腺上皮のそれに私達のCRC挿入層の発達における類似性を実証する（ 図6A、6B）が示されています。前立腺管は、前立腺基底細胞と一致するP63の発現を示しています。 P63染色はまた、挿入時に大腸がんに見られます。発現細胞より高い割合のP63は、無傷の組織切片に比べて私たちのインサートで観察されました。また、核および細胞質の両方のARは、前立腺TISに見られますフィルターインサートショー少なく、全体的なAR発現、核AR発現と細胞質染色の両方でのCRCは、無傷の前立腺に類似見ている間にセクションを訴えると。
図1：3D培養系を含む6ウェル培養皿およびインサートの代表的な画像。 （A）は、フィルタ（矢印）の下面にゼラチンコーティングを適用するためのインサートを反転します。インサートとフィルタの拡大表示は、show（挿入図）です。 （B）適切に配置インサート。システムの内側と外側のチャンバは、（矢印）が示されています。 Bで箱入りの行は、複数のサンプルが与えられた実験条件に対して得られる方法を示しています。 2週間の成長期間の終了時にこれらのインサートは、分析のために十分な材料を得るためにプールすることができます。"ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：透明フィルタ膜上健康のCRCシード層の代表画像が示されています。両方の内側と外側のチャンバは、馴化培地を含有していました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：フィルタの代表的なイメージ二つに半分に埋め込むためのパラフィンカセットに入れました。 （A）フィルターは、スコアリング後に除去する前に、HEAコーティングを挿入します。 （B）ポリカーボネートバレルから解放フィルターインサート。 （
図4：フィルタを挿入し、細胞の代表的なH＆E染色した断面（20X）。両方の膜（下部）と細胞層（上部）を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：代表明視野（BF）および免疫蛍光（IF）のシリーズの画像細胞をフィルター（40X）に切断しました。フィルタセルの断面が示されています。フィルター表面上の細胞（5A）の非染色BFイメージがDAPI染色された核（5B）と2つの異なるタンパク質、P63（5C）とアンドロゲン受容体（AR、5D）のための免疫蛍光染色のために画像が添付されています。セル部（5E、F）の複合オーバーレイは、細胞およびフィルターのコンテキストでIF信号の局在を定義します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：組織からの前立腺上皮のセクション（20X） に対するフィルターに切片標本細胞の代表的な免疫蛍光（IF）イメージ。我々のフィルタインサートの断面画像がそのまま前立腺（図6B）の管上皮層と比較して（図6A）が示されています。 P63の染色、ARおよび核が図5のように実施しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
初代細胞株は癌研究のための重要かつ急速に発展プラットフォームです。カルチャーインサートベースの3D培養系は、2週間の期間内に原発性前立腺のCRCの分化をサポートしています。 CRCフィルタ法は、前立腺の研究のための新しい媒体スループット法を表します。既存のマウスPDXモデルは時間がかかり、非常に高価であり、PDXサンプルの多くは、研究者によって開始実験とその有用性を制限し、培養物中で成長させることができません。また、PDXの確立の成功率が大きく13を変化しながら、CRC方法は、細胞株3の確立の成功率が高いです。我々は、我々のシステムは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドアプローチに相補的であるように考慮します。しかしながら、原発性前立腺癌からオルガノイドの確立に関しての成功の欠如は14報告されています。さらに、メディア、設立の方法、そして、のCRCのメンテナンスは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドのアプローチよりも大幅に簡素化されています。追加の利点として、CRCは確立さ直接分子比較のための対応する正常及び腫瘍培養物を試験するために使用することができます。
いくつかの技術的な問題は、このシステムを確立するときに対処されないままです。まず、フィルタインサートの下面に適用されるゼラチンコーティングは役立ちますが、なくなるわけではありません、膜を横切るMEDIASの拡散。頻繁な培地交換は、（セルの下側または基底層）チャンバ内の条件の増殖対分化（上部または頂端細胞層）のそれぞれの勾配を維持するために使用されます。第二に、成功した3D CRC培養は比較的高い細胞播種密度を必要としました。低い播種密度は、フィルター表面に発達細胞層の完全性に関して悪い結果が得られました。 CRCを培養する際に維持したときに彼らが最も活発に成長するように、これは、一般的な考慮事項でありますトン高い細胞密度。最後に、無傷の細胞層の適切な除去とそれに続くパラフィン包埋は、細胞分化の程度を定義するために重要でした。ヒドロキシアガロース（HEA）両方の添加は、細胞損失を減少し、非埋め込みフィルタ（図示せず）と比較して、細胞の全体的な形態を改善しました。いったん適切に埋め込まれ、フィルタは典型的な細胞や組織サンプルと区別がつかないようにして切断して処理しました。
私達はちょうどこのフィルタ法を用いた前立腺上皮のアーキテクチャをエミュレートするために始めています。培養条件には、メディアおよび基板へ追加の変更を容易に対処することができ、保証されています。例えば、より良い基礎分化対腔を促進することができる改質分化マスコミを迅速に試験することができます。大腸がんのレンチウイルス感染が商業癌細胞7および2DのCRCと同じように簡単に実行されているので、アルを持っていますそのように（データは示していない）永続的に細胞のゲノムを変更するCAS9 / CRISPR遺伝子編集技術のベクターでトランスフェクトされ、変異し、削除または修復遺伝子の効果を試験することができます。同様に、系統追跡は系統特異的レポーター遺伝子を導入することによって可能となります。
培地または細胞を改変することに加えて、フィルター表面に修飾も試験することができます。異なるフィルター膜基板は、市販されています。また、我々は、フィルタの内側に適用した場合の商用の細胞外マトリックスは、適切な成長環境を提供することを見出しました。インサートシステムの目標の一つは、おそらく最も興味深いの修正は、インサートの範囲内のCRCとの共培養ではどちらか、正常または腫瘍由来の間質細胞を導入することであり得るが、より良いモデルに、前立腺微小環境であるように下部チャンバーに増殖培地を調整します。 Oセクションとよくインサートの変更F脱細胞化前立腺組織も可能です。このアプローチでは、間質/上皮相互作用は、初代細胞は成長のための足場としての脱細胞化組織を使用する可能性があります。
初代細胞を確立するために、その後、それらの分化のための条件を提供する能力は通常の腺開発へと癌研究のためのより多くの生物学的に関連する研究のための理想的なフォーマットです。本明細書に記載のシステムは、細胞型および改変の数に制限は、個々の実験のニーズにシステムを調整して、確実に分析のためのサンプルを収集するために組み合わせることができることにより、プラットフォームを提供します。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
本研究では、T32（CA 9686から18）と、TL1（TL1TR001431）ポスドクの訓練助成賞（LT）、DOD PC140268（CA）、W81XWH-13-1-0327（CA）TR000102-04（CA）と同様でサポートされていましたU01 PAR-12から095（クマー）とP30 CA051008-21（ウェイナー）。サンプルの固定、切片と染色はロンバルディ総合がんセンター組織学および組織共有リソースで行いました。私たちは便利な議論のためのリチャード・シュレーゲルに感謝します。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
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