Abstract
Betinget omprogrammeres celler (CRC) gir en bærekraftig metode for primær cellekultur og evnen til å utvikle omfattende "levende biobanker" av pasient avledet cellelinjer. For mange typer av epiteliale celler, har forskjellige tre-dimensjonale (3D) dyrkningsfremgangsmåter blitt beskrevet som støtter en forbedret differensiert tilstand. Mens CRC beholde sin avstamning engasjement i vev fra hvilken de er isolert, de ikke å uttrykke mange av de differensieringsmarkører forbundet med vevet opprinnelses når den dyrkes under normale to-dimensjonal (2D) dyrkningsbetingelser. For å forbedre anvendelsen av pasient avledet CRC for prostatakreft forskning, har en 3D-kultur format er definert som muliggjør en rask (2 uker totalt) luminal celledifferensiering i både normale og tumor-avledet prostata epitelceller. Heri blir en filterinnsats basert format som er beskrevet for dyrking og differensiering av både normale og ondartede prostata CRC. En detailed beskrivelse av prosedyrene som kreves for celle innsamling og prosessering for immunhistokjemisk og immunfluorescens farging er gitt. Kollektivt 3D kultur formatet som er beskrevet, kombinert med de primære CRC linjer, gir en viktig middels til høy-throughput modellsystem for biospecimen baserte prostata forskning.
Introduction
Identifisering og bruk av kreft behandling som er tilpasset for å enkeltpersoner er et hovedmål i kreftforskning. Nylig har nye tilnærminger blitt utviklet som tillater større letthet i etableringen av primære cellekulturer, potensielt gi måter å både identifisere og teste personlige terapier. For eksempel, kan R-spondin-baserte prostata organoid metode 1 for tre-dimensjonale (3D) dyrking av normale og metastatiske prostatakreftceller i en kommersiell ekstracellulær matriks (f.eks Matrigel), mens den Betinget omprogrammering av celler (CRC) -metoden utviklet ved Georgetown 2, 3 benytter mer standard 2D kultur forhold. Nærmere bestemt, kan kombinasjonen av en Rho-kinase inhibitor (Y-27632) og bestrålte J2 murine fibroblast-feeder-celler fører til ubestemt dyrkning av keratinocytt CRC 2. Barnekonvensjonen metodikken erekstremt robust, med primære cellelinjer opprettet og vedlikeholdes på ubestemt tid fra prostata og mange andre normale og maligne epiteliale vev 3. Viktigere, vår CRC teknologi tillatt for rask identifisering av årsaks grunnlag for gjentatte luftveis papillomatosis hos en pasient som hadde mislyktes en rekke tidligere medikamentell behandling. I tillegg bruker normale og tumor-avledet CRC, vellykket identifisering av en FDA godkjente stoffet, vorinostat, ble gjort innen to uker etter første vev biopsi. Pasienten ble satt på vorinostat resulterer på vellykket behandling av sykdommen 4.
Den normale prostatakjertel består av luminal, basal og de sjeldne nevroendokrine celler 5. Luminal cellene danner den søyle epitellaget av kjertelen og hurtig androgenreseptoren (AR), så vel som andre luminal markører som cytokeratins 8 og 18 og prostate-spesifikt antigen (PSA) 6. Omvendt er basalceller lokalisert under den luminale lag og hurtig cytokeratin 5 og p63, men lave nivåer av AR 5. Vi 7, 8, 9 og andre 10 har med hell brukt prostata CRC i prekliniske mekanistiske narkotika følsomhet undersøkelser. Imidlertid, når dyrket under standard 2D vev dyrkningsbetingelser, disse cellene ikke klarer å engasjere fullt AR signale 10. Viktigere, når den plasseres under nyrekapselen av immunsvikt mus, den CRC gjenvunnet normal prostata kjertel arkitektur og funksjon som indikerer at prostata CRC beholde sin avstamning engasjement når den plasseres i en ettergivende miljø. Utviklingen av filterinnsatsen baserte cellekultursystem som er beskrevet her gjør det mulig for de hurtige (2 uker) in vitro differensiering av prostata CRC som dokumentert by den økte ekspresjon av AR og AR målgener, så vel som reduserte nivåer av p63.
De filterinnsatser som benyttes inneholde polykarbonat-membraner (porestørrelse 0,4 um) som kan støtte dyrking av pattedyrceller. Systemet, som utvikles, gjør bruk av normale og maligne prostata CRC, 6 brønners kulturskåler og filterinnsatser. Celledyrkingsmedier betinget av J2 celler 11 er plassert i bunnkammeret og prostata differensierende media i toppkammeret. Teknikkene beskrevet her støtte prostata luminal celledifferensiering innen en to ukers tidsramme, i samsvar med målene for personlig medisin. Det var også viktig å utvikle metoder som gjør det mulig for den omfattende molekylær, genetisk og cellulær profilering av kulturer. Tilnærminger for isolering av DNA, RNA og protein fra celler som frigjøres fra filteroverflaten er blitt utviklet og strømlinjeformet for nøyaktig gjentakelse prøvebehandling. Finally, den metodikk som er nødvendig for fjerning av filter for å muliggjøre forankring, seksjonering og for H & E, immunohistokjemisk og immunofluorescerende farging, er fullstendig beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering av 3D-Cell Culture Insert System
- Plasser to polykarbonat cellekultur innstikk i en invertert orientering (filter siden opp) ned i en 6 brønners plate (figur 1A).
- Påføre et tynt lag med 0,1% gelatin i vann til undersiden av innsatsen og la den tørke (10-20 min) i en biologisk sikkerhetskabinett for å opprettholde sterilitet.
- Gjenta trinn 1,2 to ganger for totalt 3 søknader på 0,1% gelatin på innleggene.
MERK: gelatin belegg vil bidra til å begrense spredningen mellom kamrene. - Å samle de primære CRC fra standard dyrkningsforhold, tilsett 5 ml PBS for å vaske kultur kolbe.
- Trypsineres cellene ved hjelp av (1 ml for en T-25 og 2 ml for en T-75) 0,25% trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C. Forsiktig på siden av flasken, for å hjelpe til løsner cellene. Deretter fortsetter å stoppe trypsin reaksjonen og samle cellene ved å tilsette 5 ml komplett DMEM.
- Samle inn cellene i et 15 ml rør. Sentrifuger røret ved 4 ° C og 188 xg og telle ved hjelp av en automatisk celleteller eller et hemocytometer.
- Re-suspendere 600.000 CRC i 250 mL klimaanlegg media (CM) og legge til riktig orientert (filter siden ned) kultur innsatsen (figur 1B). Dette er referert til som det indre kammer.
Merk: CM er F-media betinget av bestrålte J2-celler og inneholder 10 um Y-27632 som beskrevet ovenfor 7, 8, 9, 11.
- Anvende 2 ml CM til det ytre kammeret i 6 brønners plate og inkuberes ved 37 ° C natten over (minst 18 timer).
- Fjern forsiktig CM på det indre kammeret med en 1 ml eller 200 ul pipette og tilsett langsomt differensieringsmedium (DM) til det indre kammeret med en 1 ml pipette inntil full. Vær nøye med å ikke forstyrre cellelaget.
- Sjekk kulturer hver dag. Friske celler ser ut som vist i figur 2.
- Endre CM i det ytre kammer hver dag eller annenhver dag, avhengig av metabolismen av cellene.
- Når media av den indre kammer skifter farge (gul), forsiktig fjerne media på den indre filter kammer med en 1 ml eller 200 mL pipette.
- Aspirer media i den ytre 6 brønnen plate kammer med en sugespissen.
- Anvendelse av en 1 ml pipette, langsomt gjelder friskt DM til det indre kammeret inntil full. Vær forsiktig så du ikke å skrape eller på annen måte løsne cellelaget.
- Bytt ut media i det ytre kammer med 2 ml av fersk CM.
- Opprettholde kulturene i 2 uker, og deretter gå videre til behandling for ønsket bimolecular isolasjon.
MERK: Hver rad i 6 brønners plate, totalt seks innsatser (Figur 1b), skal behandles per eksperiment for å skaffe nok celler til DNA, RNA eller protein for analyser. - Sug medier i det ytre kammer og skyll med 2 ml fosfatbufret saltløsning (PBS).
- Fjern forsiktig media fra det indre kammeret med en 1 ml eller 200 mL pipette og tilsett 500 mL PBS. Unngå skraping eller på annen måte forstyrre cellene på membranen.
- Aspirer PBS fra det ytre kammer og fjern forsiktig PBS fra det indre kammeret med en 1 ml eller 200 ul pipette. Når PBS er fjernet, gå direkte til det aktuelle programmet beskrevet nedenfor. Ikke la membranen til å tørke ut. Kulturen kan holdes kort i PBS inntil søknaden er klar til å begynne.
3. Behandling av filtre Pellet Banking
- Tilsett 100 ul 0,25% trypsin-EDTA til hver indre kammeret og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C.
- I korthet og nøye agitere / skrapes cellene på membranoverflaten med en 200 ul pipette mens pipettering opp og ned (Punch unngåturing membranen). Inkuber i 1 min ved 37 ° C.
- Tilsett 250 ul CM til den første indre kammer og pipettere opp og ned forsiktig for å skylle filteret.
- Overføring resuspendert celler til den tilstøtende filterkammer som inneholder de samme media betingelser og gjentatt pipettering opp og ned.
- Gjenta denne fremgangsmåten for hver av innsatsene i en enkelt tilstand. Samle og overføre cellene til en 1,5 ml sentrifugerør.
- Skyll hvert indre kammer med en ekstra 100-200 ul CM til å samle eventuelle gjenværende celler. Legg til 1,5 ml sentrifugerør i trinn 3.5.
- Spinn cellene ved 423 x g i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og vask cellepelleten en gang med 1000 ul PBS.
- Spinne igjen ved 423 x g i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 5 minutter.
- Aspirer PBS og fryse ved -80 ° C for senere bruk.
4. Behandling av Filtre for RNA eller DNA Isolation
- Som filter kan dissosiere fra innsatsen, vaske tilknytningen filtermembranen ved å pipettere ekstraksjonsløsningen opp og ned. Samle så mye av ekstraksjon reagens som mulig ved å vippe 6 brønners platen og aspirering eventuelle gjenværende væske.
5. Behandling av filtre Protein Isolation
- Plasser filterinnsatsen i 6-brønn plate på is. Til det indre kammeret, tilsett 10 mL av protein lysis buffer supplert med 1 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM natrium vanadate (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) og 100 ul av anti-protease cocktail.
- Agitere / skrape cellene på membranoverflaten med en 20 ul pipette mens pipettering opp og ned. Unngå å generere bobler i lyseringsbuffer.
- Inkuber 6-brønners plate med filterinnsatser på is i 10 min.
- Gjenta skraping og skyll membranen overflaten med lysebuffer.
- Samle lysatene fra de 6 innsatser og overføre til et 1,5 ml sentrifugerør på is.
- Skyll den første membran med ytterligere 10 mL av lysis buffer og overføring til neste filter.
- Gjenta trinn 5.6 for alle innsatser, samle eventuelle gjenværende lysis buffer løsning og legge til 1,5 ml tube (trinn 5.5).
- Inkuber prøven på is i ytterligere 5 min.
- Sentrifugering ved maksimal hastighet (16873 xg i en bordsentrifuge) i 15 minutter ved 4 ° C.
- Pipetter lysate supernatanten til et nytt 1,5 ml rør.
- Fortsett til analyse av proteinkonsentrasjonen eller store lysates ved -80 ° C.
6. Behandling for H & E og Immuno-farging
- Legge til 500 mL og 1 ml 10% NBF (nøytral buffret formalin) til den indre og ytre kammer og la inkuber over natten ved 4 ° C.
- Aspirer NBF fra det ytre kammer og tilsett 1 ml hydroksyetyl agarose (HEA) behandling av gelen til et 1,5 ml sentrifuge. Sakte smelte agarose i en mikrobølgeovn ved bruk av lav effekt og gjentatt 10-20 s pulser inntil den er smeltet agarose.
- Hold HEA i en 37 ° C varmt bad for å hindre størkning til den er klar til bruk.
- Fjern det NBF fra det indre kammer og anvende 25 ul av smeltet HEA til det indre kammer og tillate agarose å stivne i 2-5 min.
- Våte to skum histologi pads i 10% NBF og plassere en pute i en embedding kassett (se Figur 3D).
- Bruke en # 11 skalpellblad (som har en meget skarp, fine spiss blad) til å sette inn filter fra undersiden av innsatsenkammer, delvis frigjøre den fra plastinnsats kammeret.
- Plasser en liten mengde (100-200 mL) av NBF i en petriskål og senk delvis løsner filteret i NBF (figur 3A).
- Med en # 10 skalpellblad, svakt trykk mot midten av filteret, fra innsiden av innsatsen kammeret, for å fullt ut løsne filter fra innsatsen fat (figur 3B). Hvis det ikke er noen del av filteret som fremdeles er festet til løpet, bryte den med skalpellen.
- Kutt HEA-belagt filter i to med # 10 blad skalpell (Figur 3C).
- Plassere hver halvdel av filteret på skumputen i histologi kassett fremstilt i trinn 6.4 (figur 3D).
- Legg den andre 10% NBF gjennomvåt svamp på kassetten, sandwiching filteret.
- Snap forsegle kassetten sted i NBF, og inkuber natten.
- Prosess filtre i parafinblokker for seksjonering og flekker sombeskrevet tidligere 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellekultur innsatsen basert system er en relativt enkel og rask fremgangsmåte for fremstilling av 3D-kulturer av prostata CRC som støtter luminale celledifferensiering. Et skjematisk riss av systemet er vist (figur 1A) fremhever anvendelse av gelatinen belegget til den nedre overflate av filterinnsatsen. Innsatsene er bare veltet for anvendelsen av gelatinen. I figur 1B er filtrene i den riktige orientering for dyrking. Ved hjelp av en gjennomsiktig celle innsats, er et representativt bilde av en sunn 3D prostata CRC kultur vist (10X) (figur 2). Den tette lagdeling av sunne CRC demonstrert er typisk etter etablering og kan visualiseres ved hjelp av standard lysmikroskopi. Under innledende etablering, er det avgjørende å visualisere laget av celler dannet for å sikre at metoden er kompatibelt med en gitt cellelinje, og at hensiktsmessige feste og laYering av celler som har oppstått.
HEA påføres på innsiden av innsatsen som beskrevet ovenfor. Etter påføring av HEA, må man være forsiktig når ledelsen med filter for å fjerne den fra innsatsen (3A, 3B). I alle trinnene (Figurene 3A-3D), må forsiktighet også utvises for å minimalisere unødvendig bevegelse av HEA lag på filteret med celler. CRC lag kan lett forstyrret og skadet under overføringen til den H & E kassett (figur 3D). Etter fjerning av HEA-belagt filter fra plast fat (3A-3C), kan filteret bli halvert og behandlet for seksjonering og flekker ved hjelp av standard embedding kassetter (Figur 3D). Splitte filter i halvparten er viktig for å maksimere den tilgjengelige overflaten for cross seksjonering på H & E og IF.
immunofluorescent fargingsamt lyse feltet (BF) bilder av celler dyrket på filterlaget ble samlet inn ved hjelp av et mikroskop med DSU (Disk Scan Unit) roterende disk confocal evner. Representative resultater for histologi og H & E farging er vist i et tverrsnitt av filterinnsatsen og celler (20X) (figur 4). Med riktig stell, viser vi at en CRC lag på filterinnsatser kan seksjoneres og beiset, som er standard praksis for vev histologi. Under snitting, er det mulig for CRC å løsne fra filter som en intakt lag av celler som vist (figur 4). BF Bildet viser flerlagscelle lag på toppen av den porøse membranen (figur 5A). De enkelte fluorescerende bilder for kjerner (DAPI, figur 5B), P63 (figur 5C) og AR (figur 5D) er vist, som er sammenslåingen av alle tre fluorescens markører (figur 5E). Til slutt, en kompositte BF og IF overlegg er vist (figur 5F), etablere for lokalisering av fluorescensen signal i forhold til cellene og filteret. Den overlegg av DAPI flekken med p63 IF flekker viser tydelig noen celler fortsatt i en proliferativ tilstand. Lokalisering av AR IF flekker i kjernen er et tegn på funksjonell aktivering av AR i prostata celler.
En sammenligning mellom IF av vårt filterinnsats system og en seksjonert prostatavevet er vist (figurene 6A, 6B) for å vise likheten i utviklingen av CRC innsatsen lag til den av prostata epitel. Prostata kanal viser ekspresjon av p63, i samsvar med prostata basale celler. p63 farging er også sett i CRC på innsatsen. En høyere prosentandel p63 uttrykkende celler ble observert i vårt innsatsen i forhold til intakt vev delen. I tillegg er både nukleær og cytoplasmisk AR sett i prostata tis sue seksjon og mens CRC på filterinnsatsen vis mindre samlet AR uttrykk, både nukleær AR ekspresjon og cytoplasmatisk farge er sett, i likhet med den intakte prostata.
Figur 1: Representative Bilder av den seks-brønns dyrkningsskål og Sett som omfatter 3D-kultursystemet. (A) Inverterte innsatser for påføring av gelatinbelegg på undersiden av filteret (pil). En større bilde av innsatsen og filter er showet (innfelt). (B) Riktig plassert innsatser. De indre og ytre kamre i systemet er vist (piler). Eske rad i B viser hvordan flere prøver er oppnådd for en gitt eksperimentell tilstand. Ved avslutningen av de to ukers vekstperioden disse innsatser kan bli slått sammen for å gi tilstrekkelig materiale for analyse."Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: En representant Bilde av et lag av sunn CRC Last inn en gjennomsiktig filtermembran er vist. Både indre og ytre kammer inneholdt aircondition media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: En representant Bilde av et filter halvert i to seksjoner og plassert i en parafin kassett for innebygging. (A) Filter sett med HEA belegg etter scoring og før fjerning. (B) Den frigjorte filterinnsatsen fra polykarbonat fat. (
Figur 4: En representant H & E Stained tverrsnitt av filter Sett og Cells (20X). Både membranen (nederst) og cellelaget (toppen) er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: En serie representant Bright Field (BF) og immunfluorescens (IF) Bilder avCeller vogn- på Filter (40X). Tverrsnitt av filteret og celler er vist. Et unstained BF bilde av cellene på filterflaten (5A) er ledsaget av bilder for DAPI farget kjernen (5B) og immunofluorescerende farging for to forskjellige proteiner, p63 (5C) og androgenreseptoren (AR, 5D). En sammensatt overlegg av celle seksjoner (5E, F) definerer lokaliseringen av IF-signaler i forbindelse med cellene og filter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: En representant immunfluorescens (IF) Bilde av celler delt på Filter versus en seksjon av prostata Epitel fra Tissue (20X).En tverrsnittsbilde av vår filterinnsats er vist (figur 6A) i forhold til de duktale epitel lag av en intakt prostata (figur 6B). Farging av p63, ble AR og kjernen utført som i figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primære cellelinjer er en viktig og rask utvikling plattform for kreftforskning. Kulturen insert-basert 3D kultur systemet støtter differensiering av primære prostata CRC innen en to-ukers tidsramme. CRC filtermetoden representerer en ny, medium throughput metode for prostata forskning. Eksisterende mus PDX modeller er tidkrevende og svært kostbart, og mange av de PDX prøver kan ikke dyrkes i kultur, noe som begrenser etterforsker initiert eksperimentering og deres nytte. I tillegg, mens suksessraten ved å etablere PDX varierer sterkt 13, har CRC-metoden en høy grad av suksess i å etablere cellelinjer 3. Vi anser systemet vårt for å være komplementære til R-spondin baserte prostata organoid tilnærming; har imidlertid en mangel på suksess med hensyn til etablering av organoids fra primær prostatakreft blitt rapportert 14. I tillegg media, metoder for etablering,og vedlikehold av CRC er betydelig enklere enn R-spondin-baserte prostata organoid tilnærming. Som en ekstra fordel, kan CRC etableres og brukes til å teste matchet normale og kreft kulturer for direkte molekylære sammenligninger.
Noen tekniske problemer gjenstår å løses ved etablering av dette systemet. Først, gelatinbelegg påført på undersiden av filterinnsatsen bidrar til, men ikke eliminere, diffusjon av medier på tvers av membranen. Hyppige media endringer blir brukt til å opprettholde den respektive gradient av differensiering (øvre eller apikale cellelaget) kontra vekst (nedre eller basalcellelaget) betingelser i kammeret. For det andre vellykkede 3D CRC kulturer kreves en forholdsvis høy celletetthet poding. Lavere densiteter seeding ga dårlige resultater med hensyn til integriteten til cellelaget som utvikler seg på filterflaten. Dette er en vanlig betraktning når dyrking CRC, som de vokser mest kraftig når opprettholdt ent høye celletettheter. Til slutt, den riktige fjerning og påfølgende parafin innebygging av det intakte cellelaget var kritisk for å definere graden av celledifferensiering. Tilsetningen av hydroksyetyl-agarose (HEA) begge redusert celletap og bedret den totale morfologi av cellene sammenlignet med ikke-innebygd filter (ikke vist). Når den skal innebygd, ble filtrene seksjonert og behandles på nøyaktig samme måte som vanlige celler og vevsprøver.
Vi er bare begynnelsen for å etterligne arkitekturen av prostata epitel ved hjelp av denne filtermetoden. Andre endringer av kulturforhold, til media og til underlaget er garantert, som lett kan håndteres. For eksempel kan reformulert differensiering medier som kan bedre fremme luminal vs basal differensiering bli raskt testet. Siden lentiviral infeksjon av CRC er utført like lett som med kommersielle kreftceller 7 og 2D CRC har alså blitt transfektert med CAS9 / CRISPR genet redigering teknologi vektorer for permanent å endre cellegenomet (data ikke vist) var effekten av muterte, slettet eller repareres gener kan testes. På samme måte kan avstamning sporing gjøres mulig ved å innføre avstamning spesifikke rapportørgener.
I tillegg til å endre de media eller cellene, kan modifikasjoner av filterflaten også bli testet. Forskjellige filter membran substrater er kommersielt tilgjengelige. I tillegg har vi funnet at det kommersielle ekstracellulære matriks gir et passende vekstmiljø når den påføres på innsiden av filteret. Som en av målene for innsatsen systemet er å bedre modellere prostata mikromiljøet, kanskje de mest interessante modifikasjoner kan være innføringen av normale eller tumor-avledet stromale celler, enten i co-kultur med CRC innenfor rammen av innsatsen eller i den nederste kammer for å kondisjonere vekstmedier. Endring av innsatsen godt med seksjoner of decellularized prostatavevet er også mulig. I denne tilnærmingen, kan stromale / epitel interaksjoner at de primære cellene å bruke den decellularized vev som et stillas for vekst.
Muligheten til å etablere primærceller og til senere å levere vilkårene for deres differensiering er et ideelt format for mer biologisk relevant forskning på normal kjertel utvikling og for kreftforskning. Systemet som her er beskrevet tilveiebringer en plattform ved hvilken et ubegrenset antall celletyper og modifikasjoner kan kombineres for å tilpasse systemet til de enkelte eksperimentelle behov, og for å samle pålitelig prøvene for analysene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av T32 (CA 9686-18) og TL1 (TL1TR001431) postdoktor trening stipender (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) samt U01 PAR-12-095 (Kumar) og P30 CA051008-21 (Weiner). Prøvefiksering, seksjonering og farging ble utført i Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologi og Tissue delt ressurs. Vi takker Richard Schlegel for nyttige diskusjoner. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
