Abstract
Villkorligt omprogrammerade celler (CRC) ger en hållbar metod för primär cellodling och förmågan att utveckla omfattande "levande biobanker" patient härledda cellinjer. För många typer av epitelceller, har olika tredimensionella (3D) odlingsmetoder beskrivits att stödja en förbättrad differentierat tillstånd. Medan CRC behåller sin härstamning engagemang för vävnad från vilken de isoleras, misslyckas de att uttrycka många av differentieringsmarkörer i samband med vävnaden ursprungs när den odlas under normala tvådimensionella (2D) odlingsbetingelser. Att förbättra tillämpningen av patientgenererade CRC för prostatacancerforskning, har en 3D-kultur-format har definierats som möjliggör en snabb (2 veckor totalt) luminala celldifferentiering i både normala och tumör härledda prostata epitelceller. Häri, är en filterinsats-baserat format som beskrivits för odling och differentiering av både normala och maligna prostata CRC. En detailed beskrivning av de förfaranden som krävs för insamling cell och behandling för immunhistokemisk och immunofluorescerande färgning tillhandahålls. Kollektivt 3D kultur format som beskrivs i kombination med de primära CRC linjer, utgör ett viktigt medel- till hög genomströmning modellsystem för biospecimen baserad prostata forskning.
Introduction
Identifieringen och användning av cancerbehandlingar som är anpassade till individer är ett primärt mål inom cancerforskningen. På senare tid har nya metoder utvecklats som tillåter större lätthet i upprättandet av primära cellkulturer, potentiellt ger sätt både identifiera och testa personligt terapier. Till exempel, R-spondin baserade prostata organoid tillvägagångssätt 1 möjliggör tredimensionell (3D) odling av normala och metastatiska prostatacancerceller i en kommersiell extracellulär matrix (t.ex. Matrigel), medan Villkor Omprogrammering av celler metoden (CRC) utvecklats vid Georgetown 2, 3 använder mer standard 2D odlingsbetingelser. Bestämt kombinationen av en Rho-kinashämmare (Y-27632) och bestrålade J2 murina fibroblast-matarceller leder till den obestämda odling av keratinocytceller CRCs 2. CRC metoden ärextremt robust, med primära cellinjer framgångsrikt etablerat och underhålls på obestämd tid från prostatan och många andra normala och maligna epitelvävnader 3. Viktigt är vår CRC teknik möjliggjorde snabb identifiering av etiologiska grunden för återkommande andnings papillomatos hos en patient som hade misslyckats ett antal tidigare läkemedelsbehandlingar. Dessutom, med hjälp av normala och tumörhärledda CRC, framgångsrik identifiering av ett FDA-godkända läkemedel, vorinostat, gjordes inom två veckor efter första vävnadsbiopsi. Patienten placerades på vorinostat, vilket resulterar i den framgångsrika behandlingen av deras sjukdom 4.
Den normala prostatakörteln består av luminal, basal och de sällsynta neuroendokrina celler 5. Luminala celler bildar den kolonn epitelskikt av körteln och uttrycker androgenreceptorn (AR), såväl som andra luminala markörer såsom cytokeratiner 8 och 18 och prostate specifikt antigen (PSA) 6. Omvänt är basalceller lokaliserade under den luminala skiktet och uttrycker cytokeratin 5 och P63, men låga nivåer av AR 5. Vi 7, 8, 9 och andra 10 har framgångsrikt använt prostata CRC i prekliniska mekanistiska läkemedelskänslighet undersökningar. Men när den odlas under standard 2D vävnadsodlingsbetingelser, dessa celler misslyckas att fullt ut engagera AR signalering 10. Viktigt, när den placeras under njurkapseln i möss med immunbrist, den CRC återfick normal prostata körtel arkitektur och funktion tyder på att prostata CRC behåller sin härstamning engagemang när de placeras i en tillåtande miljö. Utvecklingen av filterinsatsen baserade cellkultursystem som beskrivs här gör det möjligt för den snabba (2 veckor) in vitro differentiering av prostata CRC vilket framgår by ökat uttryck av AR och AR målgener samt minskade nivåer av P63.
Filterinsatserna används innehåller polykarbonatmembran (porstorlek, 0,4 um) som kan stödja odling av däggdjursceller. Systemet, som utvecklats, använder sig av normala och maligna prostata CRC, 6 och odlingsskålar och filterinsatser. Cellodlingsmedia som betingas av J2 cellerna 11 är placerad i den nedre kammaren och prostata differen medier i den övre kammaren. De tekniker som beskrivs häri stödja prostata luminala celldifferentiering inom en 2 veckors tidsram, i linje med målen för personlig medicin. Det var också viktigt att utveckla metoder som gör det möjligt att omfattande molekylära, genetiska och cellulära profilering av kulturerna. Tillvägagångssätt för att isolera DNA, RNA och protein från celler som frigörs från filterytan har utvecklats och strömlinjeformad för noggrann upprepning urval bearbetning. Finally, den metod som krävs för att ta bort filtret för att möjliggöra inbäddning, snittning och för H & E, immunhistokemisk och immunofluorescerande färgning, beskrivs ingående.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastställande av 3D Cell Culture Insert System
- Placera två polykarbonatcellodlingsinlägg i en inverterad orientering (filtersidan uppåt) i en 6-brunnsplatta (Figur 1A).
- Applicera ett tunt skikt av 0,1% gelatin i vatten till bottensidan av insatsen och låt torka (10-20 min) i ett biologiskt säkerhetsskåp för att upprätthålla sterilitet.
- Upprepa steg 1,2 ytterligare två gånger för totalt 3 tillämpningar av 0,1% gelatin på skären.
OBS! Gelatinbeläggning kan begränsa spridningen mellan kamrarna. - För att samla de primära CRC från standardodlingsbetingelser, tillsätt 5 ml PBS för att tvätta odlingskolven.
- Trypsinize cellerna med hjälp av (1 ml för en T-25 och 2 ml för en T-75) 0,25% trypsin-EDTA under 5 min vid 37 ° C. Knacka försiktigt på sidan av kolven för att underlätta rubba cellerna. Fortsätt sedan att stoppa trypsin reaktionen och samla upp cellerna genom att tillsätta 5 ml fullständigt DMEM.
- Samla cellerna i ett 15 ml rör. Centrifugera röret vid 4 ° C och 188 x g och räkna med användning av en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.
- Återsuspendera 600.000 CRC i 250 mikroliter konditionerat medium (CM) och lägg till rätt orienterad (filtersidan nedåt) odlingsinsatsen (Figur 1B). Detta hänvisas till som den inre kammaren.
Notera: CM är F-media konditionerade genom bestrålade J2 celler och innehåller 10 | j, m Y-27632, såsom beskrivits tidigare 7, 8, 9, 11.
- Applicera två ml CM till den yttre kammaren i sex brunnar och inkubera vid 37 ° C över natten (minst 18 h).
- Försiktigt bort CM på den inre kammaren med en 1 ml eller 200 mikroliter pipett och tillsätt långsamt differentiering media (DM) till den inre kammaren med en 1 ml pipett tills full. Var noga med att inte störa cellskiktet.
- Kontrollera kulturerna varje dag. Friska celler visas som visas i figur 2.
- Ändra CM i den yttre kammaren varje dag eller varannan dag beroende på metabolismen av cellerna.
- När medierna av den inre kammar ändrar färg (gul), försiktigt bort media på den inre filterkammaren med en 1 ml eller 200 mikroliter pipett.
- Aspirera media i yttre sex brunnar kammare med en aspirerande spets.
- Med hjälp av en 1 ml pipett, långsamt tillämpa färsk DM till den inre kammaren tills full. Var noga med att inte skrapa eller på annat sätt rubba cellskiktet.
- Byt ut media i den yttre kammaren med 2 ml färsk CM.
- Bibehålla kulturerna i 2 veckor, och sedan vidare till behandling för den önskade bimolekylära isolering.
OBS: Varje rad i 6-brunnsplatta, totalt sex insatser (figur 1B), bör behandlas per experiment för att förvärva tillräckligt med celler för DNA, RNA eller protein för analys. - Aspirera media i den yttre kammaren och skölj med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Försiktigt bort media från den inre kammaren med en 1 ml eller 200 mikroliter pipett och tillsätt 500 mikroliter PBS. Undvik att skrapa eller på annat sätt störa cellerna på membranet.
- Aspirera PBS från den yttre kammaren och försiktigt bort PBS från den inre kammaren med en 1 ml eller 200 mikroliter pipett. När PBS har tagits bort, gå direkt till lämpligt program nedan. Tillåter inte membranet torka ut. Kulturen kan hållas kort i PBS tills programmet är redo att börja.
3. Bearbetning av Filter för pellets Banking
- Tillsätt 100 mikroliter 0,25% trypsin-EDTA till varje inre kammare och inkubera under 5 min vid 37 ° C.
- Kortvarigt och noggrant agitera / skrapa cellerna på membranytan med en 200 mikroliter pipett medan pipettera upp och ner (undvika puncturing membranet). Inkubera under 1 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 250 mikroliter av CM till den första inre kammaren och pipettera upp och ner försiktigt för att skölja filtret.
- Överföring återsuspenderades cellerna till den angränsande filterkammaren som innehåller samma mediaförhållanden och upprepa pipettering upp och ned.
- Upprepa denna procedur för varje skär av ett enda villkor. Samla in och överföra celler till en 1,5 ml centrifugrör.
- Skölj varje inre kammare med ytterligare 100-200 mikroliter av CM för att samla eventuella kvarvarande celler. Lägg till 1,5 ml centrifugrör i steg 3,5.
- Snurra cellerna vid 423 xg i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 5 min.
- Aspirera supernatanten och tvätta cellpelleten en gång med 1000 mikroliter PBS.
- Snurra igen vid 423 x g i en mikrocentrifug vid 4 ° C under 5 min.
- Aspirera PBS och frysa vid -80 ° C för senare användning.
4. Bearbetning av Filter för RNA eller DNA-isolering
- Som filtret kan dissociera från insatsen, tvätta disassocierade filtermembranet genom att pipettera extraktionslösningen upp och ner. Samla så mycket av extraktionsreagens som möjligt genom att luta sex brunnar och aspirera någon kvarvarande vätska.
5. Bearbetning av Filter för proteinisolering
- Placera filterinsatsen i 6 brunnar på is. Till den inre kammaren, tillsätt 10 mikroliter av protein lysbuffert kompletterad med 1 mM natriumfluorid (NaF), 1 mM natriumvanadat (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) och 100 | il av anti-proteas cocktail.
- Agitera / skrapa cellerna på membranytan med en 20 mikroliter pipett medan pipettering upp och ned. Undvika att skapa bubblor i lyseringsbuffert.
- Inkubera 6 brunnar med filterinsatser på is under 10 min.
- Upprepa skrapning och skölj membranytan med lysbuffert.
- Samla lysaten från 6 skär och överför till en 1,5 ml centrifugrör på is.
- Skölj det första membranet med ytterligare 10 mikroliter av lyseringsbuffert och överföring till nästa filter.
- Upprepa steg 5,6 för alla skär, samla eventuella rest lysbuffert lösning och tillsätt till 1,5 ml rör (steg 5,5).
- Inkubera provet på is under ytterligare 5 min.
- Centrifugera vid maximal hastighet (16.873 xg i en bordscentrifug) under 15 minuter vid 4 ° C.
- Pipett lysat supernatanten i ett nytt 1,5 ml rör.
- Fortsätt till analysen av proteinkoncentrationen eller store lysat vid -80 ° C.
6. Behandling för H & E och Immuno-färgning
- Tillsätt 500 | il och 1 ml 10% NBF (neutral buffrad formalin) till den inre och yttre kammaren och låt inkubera över natten vid 4 ° C.
- Aspirera NBF från den yttre kammaren och tillsätt 1 ml hydroxietyl agaros (HEA) bearbetning gel till en 1,5 ml centrifug. Sakta smälta agarosen i en mikrovågsugn med hjälp av låg effekt och upprepas 10-20 s pulser tills agarosen smält.
- Förvara HEA i en 37 ° C varmt bad för att förhindra stel tills den ska användas.
- Avlägsna NBF från den inre kammaren och applicera 25 mikroliter av smält HEA till den inre kammaren och tillåta agarosen att stelna för 2-5 min.
- Våta två skum histologi kuddar i 10% NBF och placera en kudde i en inbäddning kassett (se figur 3D).
- Använd en # 11 blad skalpell (som har en mycket skarp, finspetsig bladet) att göra mål filtret från undersidan av insatsenkammare, delvis frigöra den från plastinsatsen kammaren.
- Placera en liten mängd (100-200 mikroliter) av NBF i en petriskål och sänk ned delvis rubbas filtret i NBF (figur 3A).
- Med en # 10 blad skalpell, försiktigt trycka mot mitten av filtret, från insidan av insatsen kammaren, för att till fullo rubba filtret från insatsen pipan (figur 3B). Om det finns någon del av filtret som fortfarande är fäst till pipan, åtskiljer den med skalpell.
- Skär HEA belagda filter i halv med # 10 blad skalpell (Figur 3C).
- Placera varje halva av filtret på skumdynan i histologi kassett som framställts i steg 6,4 (Figur 3D).
- Lägg den andra 10% NBF indränkt svamp kassetten, sandwiching filtret.
- Snap täta kassetten, plats i NBF, och inkubera över natten.
- Process i paraffinblock för sektionering och färgning sombeskrivits tidigare 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellodlingsinsats baserat system är ett relativt enkelt och snabbt förfarande för framställning av 3D-kulturer av prostata CRC: er som stödjer luminala celldifferentiering. Ett schema över systemet visas (Figur 1A) belysa tillämpningen av gelatinbeläggning på bottenytan av filterinsatsen. Skären är endast upphävde för tillämpningen av gelatinet. I figur 1B filtren är i rätt riktning för odling. Med hjälp av en transparent cell insats, är en representativ bild av en frisk 3D prostata CRC kultur visas (10X) (Figur 2). Den täta lager av friska CRC visat är typisk efter etablering och kan visualiseras genom att använda standardljusmikroskop. Under första etablering, är det viktigt att visualisera lager av celler som bildats för att säkerställa att metoden är kompatibel med en given cellinje och att lämplig fastsättning och laYering av celler har inträffat.
HEA appliceras på insidan av insatsen enligt ovan. Efter applicering av HEA, måste man vara försiktig när scoring filtret för att ta bort det från insatsen (figurerna 3A, 3B). I alla stegen (figurerna 3A-3D), måste försiktighet också iakttas för att minimera onödig rörelse av HEA skiktet på filtret med cellerna. CRC skiktet kan lätt störs och skadas under överföringen till H & E kassetten (Figur 3D). Efter excision av HEA belagda filtret från plastbehållaren (figurerna 3A-3C) kan filtret halveras och behandlas för sektionering och färgning med användning av standard inbäddande kassetter (figur 3D). Dela filtret i hälften är viktigt att maximera den tillgängliga ytan för tvärsektionering på H & E och IF.
immunofluorescerande färgningliksom ljusa fält (BF) bilder av celler som odlats på filterskiktet samlades med hjälp av ett mikroskop med DSU (skivenheten Scan) snurrande skiva konfokala kapacitet. Representativa resultat för histologi och H & E-färgning visas i ett tvärsnitt av filterinsatsen och celler (20X) (Figur 4). Med rätt skötsel, visar vi att en CRC skikt på filterinsatser kan sektioneras och färgas, som är praxis för vävnads histologi. Vid snittning, är det möjligt för den CRC lossnar från filtret som ett intakt lager av celler såsom visas (Figur 4). BF-bilden visar flerskiktscellskikt på toppen av det porösa membranet (figur 5A). De enskilda fluorescerande bilder för kärnor (DAPI, Figur 5B), P63 (figur 5C) och AR (Figur 5D) visas, som är sammanslagningen av de tre fluorescensmarkörer (Figur 5E). Slutligen ett composite BF och IF overlay visas (figur 5F), om inrättande av lokalisering av fluorescenssignalen i förhållande till cellerna och filtret. En överlagring av DAPI fläcken med P63 IF färgning visar tydligt vissa celler fortfarande i en proliferativ tillstånd. Lokaliseringen av AR IF färgning i kärnan är ett tecken på funktionell reaktivering av AR i prostataceller.
En jämförelse mellan IF av vår filterinsatsen systemet och en sektionprostatavävnad visas (Figurerna 6A, 6B) för att påvisa likhet i utvecklingen av vår CRC inläggsskiktet med den hos prostatan epitel. Prostatakanalen visar uttryck av P63, som överensstämmer med prostatabasalceller. P63 färgning ses också i CRC på insatsen. En högre andel P63 uttryckande celler observerades i vår insats jämfört med den intakta vävnadssnitt. Dessutom är både nukleär och cytoplasmatisk AR ses i prostata tis stämma avsnitt och medan de CRC på filterinsatsen show mindre total AR expression, både nukleär AR expression och cytoplasmisk färgning ses, liknande den intakta prostata.
Figur 1: Representativa Bilder av 6-brunnars odlingsskål och Insert som utgör 3D Culture System. (A) Inverterade skär för applicering av gelatinbeläggning på undersidan av filtret (pil). En större bild av insatsen och filtret är show (infälld). (B) korrekt placerad skär. De inre och yttre kammaren av systemet visas (pilar). Den inramade rad i B visar hur flera sampel erhålls för en given experimentell betingelse. Vid slutet av den två veckor tillväxtperioden dessa insatser kan slås samman för att ge tillräckligt material för analys."Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En representativ bild av ett lager av hälsosam CRC ympas på en transparent filtermembran visas. Både inre och yttre kammaren innehöll konditionerat medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: En representativ bild av ett filter Halverade i två sektioner och placeras i en Paraffin kassett för inbäddning. (A) Filterinsats med HEA beläggning efter poäng och före avlägsnande. (B) Den frigjorda filterinsatsen från polykarbonat fat. (
Figur 4: En representant H & E målat Tvärsnitt av filterinsatsen och celler (20X). Både membranet (botten) och cellskiktet (överst) är visade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: En serie representant Bright Field (BF) och Immunofluorescens (IF) Bilder avCeller Sektionerad på Filter (40X). Tvärsnitt av filtret och celler visas. En ofärgade BF bild av cellerna på filterytan (5A) åtföljs av bilder för DAPI färgas kärnan (5B) och immunofluorescerande färgning för två olika proteiner, P63 (5C) och androgenreceptorn (AR, 5D). En sammansatt överlagring av cellsektioner (5E, F) definierar lokalisering av IF-signalerna i samband med cellerna och filter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: En representant Immunofluorescens (IF) Bild av celler sektionerade på Filter mot en del av prostata epitel från Tissue (20X).En tvärsnittsbild av vår filterinsatsen visas (Figur 6A) jämfört med duktala epiteliala skikt av en intakt prostata (Figur 6B). Färgningen av P63, var det AR och kärnan utfördes såsom i Figur 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Primära cellinjer är en viktig och snabbt växande plattform för cancerforskning. Odlingsinsatsen baserade 3D kultur Systemet stöder differentieringen av primära prostata CRC inom en två veckors tid. CRC filtermetoden representerar en ny, medel genomströmning metod för prostatacancer forskning. Befintliga mus PDX modeller är tidskrävande och extremt dyra, och många av de PDX proverna inte kan odlas i kultur, vilket begränsar läkarinitierad experiment och deras användbarhet. Dessutom medan andelen framgångsrika av upprättandet PDX varierar kraftigt 13, har CRC-metoden en hög grad av framgång i upprättandet cellinjer 3. Vi anser att vårt system för att vara ett komplement till R-spondin baserad prostata organoid strategi; har dock en brist på framgång när det gäller etablering av organoids från primär prostatacancer rapporterats 14. Dessutom, media, metoder etablerings,och underhåll av CRC är betydligt enklare än R-spondin baserad prostata organoid tillvägagångssätt. Som en extra fördel, kan CRC fastställas och användas för att testa matchade normala och tumörkulturer för direkta molekylära jämförelser.
Vissa tekniska frågor återstår att regleras vid upprättandet av detta system. Först, tillämpat gelatinbeläggning på undersidan av filterinsatsen hjälper, men eliminerar inte, diffusion av medier över membranet. Frekventa medie förändringar används för att upprätthålla de respektive gradient av differentiering (övre eller apikala cellskiktet) vs tillväxt (lägre eller basalskiktet av celler) förhållandena inuti kammaren. För det andra, framgångsrika 3D CRC kulturer krävs en relativt hög cellsåddtäthet. Lägre ympning densiteter gav dåliga resultat med avseende på integriteten hos cellskiktet som utvecklas på filterytan. Detta är en vanlig faktor när odling CRC, när de växer mest kraftigt när bibehållit ent höga celldensiteter. Slutligen den korrekt avlägsnande och efterföljande paraffininbäddning av den intakta cellskiktet var kritisk för att definiera omfattningen av celldifferentiering. Tillsatsen av hydroxietyl agaros (HEA) både minskad cellförlust och förbättrade den övergripande morfologin hos cellerna jämfört med icke-inbäddade filter (ej visat). När de väl inbäddade ades filtren sektioneras och behandlas på ett sätt som inte kan särskiljas från typiska cell- och vävnadsprover.
Vi har precis börjat efterlikna arkitekturen av prostata epitel med hjälp av detta filter metod. Ytterligare ändringar av odlingsbetingelser, till media och till substratet motiverat, som lätt kan åtgärdas. Till exempel kan omformulerade differentiering medier som bättre kan främja luminal vs basal differentiering snabbt testas. Eftersom Lentiviral infektion av CRC har utförts lika lätt som med kommersiella cancerceller 7 och 2D CRC har alså transfekterats med CAS9 / crispr genen redigering teknik vektorer för att permanent modifiera cellgenomet (data ej visade), effekten av muterade, raderade eller reparerade gener kan testas. På liknande sätt kan möjliggöras härstamning spårning genom att införa härstamning specifika reportergener.
Förutom att förändra de media eller cellerna, kan modifieringar av filterytan också testas. Olika filtermembransubstrat är kommersiellt tillgängliga. Dessutom har vi funnit att den kommersiella extracellulära matrisen tillhandahåller en lämplig tillväxtmiljö när de appliceras på filtrets insida. Som ett av målen för insatsen systemet är att bättre modell prostatan mikro, kanske de mest intressanta ändringar kan vara införandet av normala eller tumörhärledda stromaceller, antingen i samodling med CRC inom ramarna för insatsen eller i den nedre kammaren för att konditionera tillväxtmediet. Modifiera insatsen väl med sektioner of decellulariserade prostatavävnad är också möjligt. I detta tillvägagångssätt, kan stromala / epitelceller interaktioner tillåta de primära cellerna att använda den decellulariserade vävnaden som en byggnadsställning för tillväxt.
Förmågan att etablera primära celler och att därefter ge förutsättningar för deras differentiering är en idealiska formatet för mer biologiskt relevanta forskning normal körtel utveckling och för cancerforskning. Det system som beskrivs häri tillhandahåller en plattform med vilken ett obegränsat antal celltyper och modifieringar kan kombineras för att skräddarsy systemet till individuella experimentella behov och för att på ett tillförlitligt sätt samlar in de prover för analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av T32 (CA 9686-18) och TL1 (TL1TR001431) postdoktoral utbildning Beviljade bidrag (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) samt U01 PAR-12-095 (Kumar) och P30 CA051008-21 (Weiner). Prov fixering, sektionering och färgning utfördes i Lombardi Comprehensive Cancer Center histologi och Tissue delad resurs. Vi tackar Richard Schlegel för bra diskussioner. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Cancer Institute eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
