基于插入 - 滤池3D文化系统原发性前列腺细胞分化

这种基于过滤器插入片段的 3D 培养系统用于患者来源的原代细胞，其总体目标是为前列腺癌研究建立更具生物学相关性的体外模型系统。通过使用原代人类细胞，这种方法可以帮助回答前列腺发育生物学和前列腺癌中的关键问题。该技术的主要优点是它是一种相对快速的体外方法，用于建立分化的原代前列腺细胞，还允许快速分离生物分子，如 RNA、DNA 和蛋白质。

这些方法的视觉演示至关重要，因为用于组织学或 RNA 和蛋白质收集的过滤器插件上的细胞处理非常精细且对时间敏感。为了帮助限制生物安全柜中腔室之间的扩散，请在插入物的底部涂上一层薄薄的 0.1% 明胶并让它们干燥。再重复此过程两次。

然后将细胞涂在明胶包被小室的内腔中，并培养长达两周。两周后，将培养的过滤器插件直接应用于适当的下游应用之一，详见下文。要开始此过程，请从外腔吸出 PBS，然后小心地从内腔中取出 PBS。

培养的小室可以在 PBS 中短暂保存，直到应用准备好开始，但不要让膜变干。接下来向每个内腔中加入 100 微升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA。然后在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

然后，用 200 微升移液管短暂小心地刮擦膜表面的细胞，同时上下移液。然后在 37 摄氏度下孵育 1 分钟。一分钟后，将 250 微升条件培养基添加到第一个内腔中，轻轻上下移液以冲洗过滤器。

然后，将重悬的细胞转移到包含相同培养基条件的相邻过滤室中，并上下重复移液。对单个条件的每个插入重复此过程。然后收集细胞并将其转移到 1.5 毫升离心管中。

用额外的 100 至 200 μL 条件培养基冲洗每个内腔，以收集任何剩余的细胞，并将它们添加到 1.5 mL离心管中。接下来，将细胞在 4 摄氏度的微量离心机中旋转 5 分钟。然后吸出上清液，用 1， 000 微升 PBS 洗涤细胞沉淀一次。

4 摄氏度的微量离心机中再次离心细胞 5 分钟。5 分钟后吸出 PBS 并在零下 80 摄氏度下冷冻样品以备后用。在此过程中，将 200 微升硫氰酸胍、苯酚、氯仿或类似的提取试剂添加到内腔中，并通过上下移液短暂搅动膜表面的细胞。

然后将细胞在提取试剂中在室温下孵育 5 分钟，并保持外腔干燥。然后通过上下吹打萃取溶液来清洗滤膜。通过倾斜 6 孔板并吸出任何残留液体，尽可能多地收集提取试剂。

请注意，过滤器可能会与插入物分离。清洗解离的滤膜（如果已连接）。然后收集尽可能多的提取试剂，并按照制造商的方案纯化和回收 DNA、RNA 或蛋白质。

洗涤细胞时应小心，并用硫氰酸胍过滤，因为过度搅拌会产生质量差的 RNA。为了从过滤器插件中分离蛋白质，请将过滤器插件置于冰上的六孔板中。然后向内腔中加入 10 μL 蛋白质裂解缓冲液。

用 20 μL 移液器搅拌和刮擦膜表面的细胞，同时上下移液，避免在裂解缓冲液中产生气泡。然后将带有过滤器插件的六孔板在冰上孵育 10 分钟。重复刮擦，然后用裂解缓冲液冲洗膜表面。

从 6 个小室中收集裂解物，并将其转移到冰上的 1.5 ml 离心管中。接下来，用额外的 10 μL 裂解缓冲液冲洗第一层膜，并将其转移到下一个过滤器。对给定实验条件的所有插入片段重复此过程，收集任何残留的裂解缓冲液并添加到 1.5 毫升试管中。

将样品在冰上再孵育 5 分钟。然后在 4 摄氏度下以最大速度旋转 15 分钟。完成后，将裂解物移液到新的 1.5 毫米试管中。

然后进行蛋白质浓度分析或将裂解物储存在零下 80 摄氏度。在此过程中，分别向内腔和外腔中加入 500 微升和 1 毫升 10%NBF。将它们在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天从外腔吸出 NBF，并将 1 毫升 HEA 加工凝胶添加到 1.5 毫升离心管中。在微波炉中以低功率缓慢熔化琼脂糖，并重复 10 秒脉冲，直到琼脂糖熔化。将 HEA 保存在 37 摄氏度的温水中以防止凝固，直到准备使用。

接下来从内腔中取出 NBF。将 25 μL 熔融 HEA 涂抹于内腔，让琼脂糖凝固 2 到 5 分钟。然后在 10% NBF 中润湿两个泡沫组织学垫，并将一个垫放入包埋盒中。

使用 HistoGel 保护滤膜插件上细胞层的完整性是保存完整细胞层以进行组织学切片的关键步骤。之后，使用 11 号刀片手术刀从塑料插入室的底部对过滤器进行划痕，将其部分释放。将 100-200 微升 NBF 放入培养皿中，并将部分脱落的过滤器浸入 NBF 中。

用 10 号刀片手术刀，从插入室内部轻轻按压过滤器的中间，使过滤器从插入筒中完全脱落。如果过滤器的任何部分仍连接到枪管上，请用手术刀将其切断。随后将 HEA 涂层过滤器切成两半。

将过滤器的每一半放在准备好的组织学盒中的泡沫垫上。然后将第二块浸过 10%NBF 的海绵加入盒中，将过滤器夹在中间。接下来，快速密封包埋盒。

将其放入 NBF 中并孵育过夜。该明场图像显示了多孔膜顶部的多层细胞层。显示了细胞核、P63 和雄激素受体的单个荧光图像，以及所有三个荧光标记物的合并。

最后，显示了复合明场和免疫荧光叠加，建立了荧光信号相对于细胞和滤光片的定位。这里显示了我们的过滤器插件的横截面图像，与完整前列腺的导管上皮层进行比较。一旦掌握了这项技术，就可以在两周内完成，如果作得当，只需不到 30 分钟即可最终分离细胞和过滤器插件或所需的生物分子。

在执行此过程时，请务必始终记住在使用过滤器插件时要小心，以免损坏细胞层或底层过滤器。在此程序之后，可以执行其他方法，例如蛋白质印迹、RNA 微阵列和蛋白质组分析，以回答与通路分析和癌细胞相关的其他问题。这项技术将有助于为前列腺癌领域的研究人员铺平道路，以更好地探索前列腺生物学以及使用原代前列腺细胞的前列腺癌基础。

观看此视频后，您应该对如何从该 3D 培养系统中正确设置和恢复培养的原代前列腺细胞有很好的了解。