Summary
Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.
Introduction
Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale 1, 2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell'adulto funzione neuronale 3, 4 . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh 5; la via attivatore Smoothened (SMO) 6; e Gpr161 7, un recettore orfano accoppiato alla proteina G (GPCR) che regola negativamente il pathway Shh, localizzarsi a cilia in modo dinamico. GPCR Molteplici sono stati segnalati per localizzare alle ciglia nei neuroni nel cervello 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Difetti di cilia e vie di segnalazione cilia generata influenzano molteplici tessuti e sono noti collettivamente come ciliopatie 17, 18, 19. Lo spettro malattia ciliopathy frequentemente include difetti neurologico, quali difetti craniofacciali 20, 21, 22. Inoltre, ciglia primarie nei neuroni ipotalamici regolare percorsi sazietà centrali, e difetti provocare obesità centrale 23, mirroring obesità in ciliopatie sindromici come Bardet Biedel sindrome 24. Inoltre, recettore neuropeptide segnalazione in cilia regola centrAl sazietà Percorsi di 11, 14. Localizzazione ciliare ciclasi III (ACIII) e GPCR come recettore della somatostatina 3 in neuroni ippocampali provocare difetti di riconoscimento dell'oggetto nuovi e deficit di memoria 25, 26 e parallela una mancanza di integrità ciliare 27. Gli aspetti dello sviluppo di segnalazione cilia generati sono strettamente legate alla omeostasi tissutale; in particolare, cilia sono importanti per la progressione di medulloblastomas Shh-sottotipo derivanti da progenitori dei granuli nel cervelletto 28, 29. Così, cilia primarie svolgono un ruolo importante durante embrionale, postnatale e adulta sviluppo e la funzione neuronale.
Neurali cellule staminali (NSC) risiedono nella zona sottoventricolare (SVZ) del ventricolo laterale, la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo, ezona ventricolare del terzo ventricolo nell'ipotalamo nei mammiferi 30, 31, 32. NSC sono multipotenti, possiedono la capacità di auto-rinnovamento, e sono importanti per lo sviluppo del cervello e la medicina rigenerativa 30. La maggior parte NSC nella SVZ sono quiescenti e possiedono un cilium primario solitaria che, in molti casi, si estende verso il ventricolo laterale 33. I segnali cilium primarie tramite la localizzazione dei vari recettori, inducendo risposte cellulari a valle, in particolare in relazione alla Shh, TGFp, e del recettore tirosina chinasi vie 2, 34, 35, 36. Poiché cilia primarie estendono nel ventricolo laterale, si ipotizza che cilia primaria rilevare citochine nel liquido cerebrospinale (CSF) per attivare NSC 37 38, 39, 40, 41. Tuttavia, i meccanismi mediante i quali CSF comunica con NSC e se cilia primaria sono coinvolti non sono noti. NSC aderenti in coltura sono ciliato; localizzare componenti della via Shh, come Smo e Gpr161 in cilia; e sono Shh reattivo 42. Così, NSC possono servire come un importante sistema modello per studiare il percorso Shh, il traffico ciliare, e percorsi di differenziazione neuronale. Inoltre, i neuroni differenziati da NSC possono essere utilizzati anche per saggi traffico ciliare.
Neurosfere sono costituiti da gruppi di cellule fluttuanti derivanti dalla proliferazione di neural cellule staminali / progenitrici che crescono in presenza di fattori di crescita specifici e superfici non adesivo 43, 44. Neurosfere servono come importante in modelli di coltura in vitro per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali nello sviluppo normale e malattie 31, 45, 46, 47. Qui, descriviamo un saggio neurosfere-based per la coltura di cellule progenitrici / staminali neurali e di differenziazione in neuroni / glia. Si sottolinea in particolare il traffico di segnalazione componenti cilia di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati (Figura 1). Al contrario di coltura neuroni primari, neurosfere primarie sono relativamente facili da coltura, sono suscettibili di passaggi multipli e congelare-disgelo, e possono differenziarsi in neuroni / glia. È importante sottolineare che abbiamo stabilito che neurale neurosfere di derivazionecellule staminali / progenitrici e neuroni dissociati sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione relativi alla funzione ciliare in questi compartimenti. i metodi di coltura neurosfere-based può servire come un sistema modello ideale per lo studio del traffico ciliogenesis e ciliare in NSC e neuroni differenziati.
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Protocol
1. Isolamento di neurosfere dal cervello di topo per adulti
- Euthanize un topo adulto (circa 2 mesi) per una dose eccessiva di isoflurano. Fare doppio verificare che il mouse ha smesso di respirare e sezionare immediatamente dopo la morte.
- Utilizzando le forbici, fare un'incisione mediana per aprire il cranio. Rimuovere il cervello.
- Mettere il cervello in PBS freddo in un piatto di 10 centimetri sul ghiaccio. Seguire tutta montaggio metodo dissezione avere la SVZ dal ventricolo laterale 48.
- Posizionare il ventricolo laterale in una provetta da 1,5 ml, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare la provetta per 15 minuti a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Dopo 15 minuti, aggiungere 500 ml di media arresto e pipettare delicatamente 20 - 30 volte con una punta ml 1. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il pipettamento.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. - Spin giù le cellule a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS e risospendere tegli cellule pipettando gentilmente 5x con una punta mL 1.
- Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base.
- (Facoltativo) Se si osservano detriti cellulari, passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro.
- Contare il numero di cellule con un emocitometro; in generale, circa 30.000 - 60.000 cellule / SVZ si ottengono.
- Piastra le cellule da una SVZ in 10 cm piatto con 10 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2.
- (Opzionale) Per evitare la fusione tra le sfere 49, mettere a 1000 cellule in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti bassissimo legame che è preriempita con 1,5 ml di terreno di coltura e NSC a 37 ° C con 5% di CO 2.
NOTA: Dopo 5-7 giorni, neurosfere possono essere osservati (Figura 2A). Il periodo di coltura può essere diverso con l'età del mouse o il background genetico. - Aggiungere 2 ml di terreno NSC ogni 3-4 giorni per mantenere la cultura(Non rimuovere il supporto esistente).
2. Analisi della Capacità Differenziazione di neurosfere e Ciliogenesis Test
- Per analizzare la capacità di differenziazione, analizzare le neurosfere in condizioni aderenti in terreno di differenziazione.
- Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave o con l'esposizione ai raggi UV prima dell'uso. Per una cultura di cellule aderenti, mettere un bicchiere coperchio tondo 12 millimetri sterilizzati in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti in condizioni asettiche.
- Rivestire il vetro di copertura per 10 s con 500 microlitri di 0,002% di poli-L-lisina (PLL). Aspirare la soluzione e asciugare per 10-15 min.
- Aggiungere 500 ml di soluzione di laminina (5 mg / mL). Incubare il vetro di copertura per 1 ora a 37 ° C.
- Aspirare il laminina e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione o medio NSC (controllo indifferenziata).
- Per il saggio di differenziazione, prendere un 100-200 micron sfera con una punta di 200 microlitri sotto il microscopio. Inserisci5-10 neurospheres a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e coltura per 7-10 giorni in terreno di differenziamento.
- Per analizzare neurosfere indifferenziate, aggiungere 5-10 neurosfere a ciascun pozzetto di una piastra e coltura a 24 pozzetti per 1-2 giorni in media NSC. Neurosfere allegate diffondere e crescere come monostrato (Figura 2B).
- Dopo aver rimosso attentamente il mezzo, fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 minuti a RT, e poi lavare con PBS due volte per 5 minuti a temperatura ambiente. La piastra può essere conservato a 4 ° C per 1-2 mesi.
NOTA: per visualizzare le cellule staminali / progenitrici neurali in media NSC e cellule differenziate in terreno di differenziamento, eseguire immunostaining contro Nestin (staminali neurali / marcatore di cellule progenitrici), β-tubulina III (TUJ1 monoclonale, marcatore neuronale), GFAP (fibrillare gliale Acidic Protein , marcatore astrociti), e O4 (marcatore oligodendrociti) (Figura 2B-e). Per analizzare le ciglia, eseguire immunostaining contro Arl13b (CI primariolia marker) e Gpr161 (GPCR ciliare) (Figura 3). - Montare il vetro di copertura con soluzione di montaggio su un vetrino. Inclinare il vetrino per rimuovere la soluzione in eccesso.
3. Analisi di Ciliogenesis in Neurosfere
- Per analizzare cellule in neurosfere intatte mediante immunocolorazione, trasferimento 1 ml di terreno di coltura contenente più neurospheres ad una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 500 xg per 8 min. Fissare le sfere con 4% (PFA) dopo aver rimosso il mezzo per 15 minuti e lavare con PBS. Spin down sfere a 500 xg per 8 minuti, rimuovere il surnatante e incubare le sfere O / N con 30% saccarosio a 4 ° C.
- Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 500 ml di soluzione di ottobre con un taglio di 1 punta mL. Tagliare il bordo della punta di allargare l'apertura, come PTOM viscoso.
- Trasferire la soluzione contenente i Ottobre neurosfere in uno stampo di plastica monouso di congelamento (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Congelare il mvecchio in ghiaccio secco per almeno 15 min.
- (Opzionale) interrompere l'esperimento e memorizzare lo stampo in un congelatore C -80 ° fino a 1 anno.
- Tagliare le sezioni con un criostato; lo spessore delle sezioni deve essere di 15-30 um.
- Per visualizzare le ciglia primario in un neurosfere, eseguire immunostaining contro Arl13b (Figura 4).
4. Cultura e Passaggio di neurosfere e NSC aderenti
- Passage le neurosfere mentre la dimensione della sfera è tra 100-200 micron; quando le neurosfere sono troppo grandi (300 micron o superiore), non sono l'ideale per gli esperimenti.
- Trasferire le neurosfere in un tubo da 50 ml usando una punta mL 1 e centrifugare a 500 xg per 8 min.
- Scartare il surnatante mediante un aspiratore, aggiungere 500 ml di 0,05% tripsina-EDTA in PBS, e incubare per 5 min a 37 ° C. La quantità di tripsina varia a seconda del numero di sfere.
- Aggiungere 500 microlitri di media siero e delicatamente il tubot 20 volte con una punta mL 1.
- Spin down a 500 xg per 8 minuti. Eliminare il surnatante utilizzando un mL punta 1 e aggiungere 1 ml di terreno di base.
- (Opzionale) Se detriti cellulari o indissociate neurosfere si vedono passare le cellule attraverso una cella di 70 micron-filtro.
- Passaggio le cellule in 10 cm piatto ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 in media NSC; le cellule saranno pronti per il prossimo passo, dopo una settimana.
- (Facoltativo) Per congelare le cellule, aggiungere il congelamento medio di generare 500.000 a 1.000.000 cellule / ml sospensione. Congelare le cellule utilizzando contenitori crio-congelamento; neurosfere indissociate possono anche essere congelati.
- Per la coltura aderente, dillute le cellule a 50.000 cellule / cm 2 sul PLL- e coprioggetto con media NSC e cultura laminina rivestite per 1-2 giorni.
5. La fame e analisi di Cilia
- Preparare mezzo inedia (Tabella 1).
- 1-2 giorni dopo l'iniziale plCORTEGGIAMENTO di cellule aderenti dopo la dissociazione, il cambiamento medio NSC in un pozzetto (controllo) e media fame in un altro pozzo (esperimento).
- Coltura le cellule aderenti per 24 h.
- Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 15 minuti a RT e lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno a RT.
- (Opzionale) interrompere l'esperimento e memorizzare le piastre a 24 pozzetti con coprioggetto in PBS a 4 ° C per 1-2 mesi.
- Eseguire un protocollo di immunofluorescenza per la colorazione 7, 50.
- Montare i coprioggetti con soluzione di montaggio. Asciugare il vetrino O / N a temperatura ambiente al buio.
- Acquisire immagini su un microscopio composto all'ingrandimento necessario. Utilizzare un microscopio, una macchina fotografica, e gli obiettivi (40X / 1.3 olio e 63X / 1.4 olio), controllata utilizzando il software accompagnato. Prendere sufficienti z sezioni a 0,5-0,8 micron intervalli (Figura 5).
- Per l'analisi quantitativa della localizzazione in ciliarecellule aderenti, acquisiscono pile di immagini dal 3-8 campi consecutivi con cellule confluenti, cercando nel canale DAPI. Quantificare il numero di ciglia primarie utilizzando ImageJ / Figi. In genere, utilizzare la funzione "contatore cella" nel ImageJ Plugin> Analizzare finestra di dialogo per contare le cellule con cilia GPCR-positivi; proiezioni massime da pile di immagini possono essere esportati da ImageJ / Fiji.Use simile intensità dell'immagine ei parametri di contrasto per tutte le immagini dello stesso esperimento per il conteggio e scopi esportazione.
6. La trasfezione di neurosfere
- Aderire dissociato cellule di vetrini per 24 h. Utilizzare una densità cellulare tipicamente tra 75.000 e 150.000 cellule in 500 microlitri di NSC media in un singolo pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Mescolare 25 ml di mezzo di siero ridotto e 1,5 ml di reagente di trasfezione in un mL microtubo 0,5 vortex per 5 s.
- Aggiungere 2,5 mg di DNA plasmidico privo di endotossine ad un separato 0,5 ml microtube contenente 25 ml di mezzi di siero ridotto e mescolare nel vortex per 5 s.
- Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione al secondo DNA provetta contenente e mescolare nel vortex per 5 s.
- Aggiungere il composto dal tubo di DNA contenenti alla prima provetta e mescolare pipettando.
- Incubare la miscela per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente la goccia a goccia mix trasfezione ai pozzetti in cima alla media NSC (500 pl / pozzetto).
- Cambiare il mezzo 24 h dopo la trasfezione per il controllo di media (media NSC) o medio fame (500 pl / pozzetto).
- Fissare le cellule cambiando il mezzo di 4% PFA dopo 24 he eseguire immunostaining; tipicamente, fino ad un'efficienza di transfezione 10% è ottenuto usando questo protocollo.
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Representative Results
Dopo la placcatura le cellule dalla SVZ in terreno NSC per una settimana, neurosfere galleggianti sono stati osservati (Figura 2A). Le dimensioni delle sfere variavano tra 50 e 200 um. Per esaminare se le sfere sono state derivate da cellule staminali / progenitrici neurali, le neurosfere furono piastrate su PLL- e coprioggetto in terreno NSC laminina rivestite per 2 giorni. Sono stati poi immunostained contro il marcatore staminali / progenitrici neurali delle cellule, Nestin. sono stati necessari due giorni per consentire alle sfere di allegare al coprioggetto e di crescere come un monostrato di cellule. Il monostrato di cellule è stato positivo per Nestin (Figura 2B). Per esaminare la capacità di differenziazione dei neurosfere, li placcato seguente procedura descritta nella sezione 2 sul PLL- e coprioggetto in terreno di differenziamento laminina rivestite senza dissociazione per 7-10 giorni. Ci vuole almeno una settimana per la differenziazione. Le neurosfere associate alle coprioggetti ed espandereEd a crescere come un monostrato di cellule. Abbiamo fissato le cellule e immunostained contro neuroni, astrociti, oligodendrociti e pennarelli. Abbiamo osservato neurospheres aderenti che differenziano in β-Tubulin neuroni III-positivi, astrociti GFAP-positivi, e oligodendrociti O4-positivi (Figura 2C-E). Così, neurosfere multipotenti possono essere derivate da SVZ topo adulto.
Per determinare se neurospheres aderenti e neuroni differenziati hanno cilia primaria, abbiamo immunostained contro Arl13b (marcatore ciglio primario) 51 e Gpr161 (ciliare-localizzato GPCR) 7. Nella nostra esperienza, in modelli murini disponibili esprimono ARL13B-mCherry, e in studi con lo sviluppo della corteccia del mouse, la maggior parte (se non tutti) cilia neuronale nel cervello esprimere Arl13b, mentre tutti i neuroni non sono ACIII-positivi 52, 53, 54. gios, abbiamo principalmente si basano su Arl13b per rilevare cilia neuronali. Abbiamo rilevato cilia primaria e la localizzazione del Gpr161 alle ciglia delle cellule progenitrici in neurosfere aderito (Figura 3A) e nei neuroni differenziati (Figura 3B). Così, neurosfere aderenti e linee differenziate sono Ciliated in coltura e localizzare molecole di segnalazione.
Per determinare se neurospheres galleggianti hanno cilia primaria, abbiamo cryosectioned neurosfere galleggianti dopo la fissazione, come illustrato nella sezione 3. Abbiamo osservato ciglia primarie in cellule staminali / progenitrici neurali nelle neurosfere sezionate (Figura 4A-B). È importante acquisire z sezioni di tutti i neurosfere visualizzare completamente cilia primaria, perché è difficile esaminare le ciglia primario in un singolo piano z. In sintesi, neurosfere indifferenziate hanno popolazioni eterogenee di cellule ciliate e non ciliate.
(Figura 5A-B). Inoltre, abbiamo osservato un aumento del numero delle ciglia Gpr161-positive sulla fame (% Gpr161-positivi ciglia / ciglia Arl13b-positivo) (Figura 5A-B). È interessante notare che un precedente studio utilizzando linee di cellule staminali embrionali umane indifferenziate dimostrato che le cellule staminali embrionali umane in coltura possiedono anche cilia primaria 55. Il numero e la lunghezza delle ciglia aumento su deprivazione di siero in queste linee cellulari, e queste ciglia possiedono anche componenti del macchinario Shh.
Inoltre abbiamo trasfettato aderente neurali staminali / progenitor cellule, come descritto nella sezione 6. genere rilevati un'efficienza di transfezione di fino al 10%, simile a colture neuronali primarie in laboratorio (Figura 6).
| Soluzione | Componente |
| 1x PBS | Diluire 10x PBS con acqua autoclavato |
| media NSC | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 mL 200 mM L-glutammina | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-base (bFGF umano) (Soluzione madre 25 ng / ml in mezzo Neurobasal): 20 ng / ml o 2 mg totale per 100 mL mezzi | |
| EGF (Soluzione madre 25 ng / ml in mezzo Neurobasal): 20 ng / ml o 2 mg totale di 100 mL mezzi | |
| 95 ml di terreno di base | |
| FGF-base umana (umana bFGF) | 1 ml di terreno di base per bFGF 25 mcg bottiglia umana commerciale |
| Memorizzare in microtubi sterili a -20 ° C o inferiore. Utilizzare una sola aliquota di 80 ml o 2 mg / 100 ml supporto NSC. | |
| EGF | Aggiungere 8 ml di terreno di base di commerciale FEG 20 mcg bottiglia |
| Memorizzare microprovette sterili -20 ° C o inferiore. Utilizzare un unico / 100 supporti 80 mg aliquota mL. | |
| Arresto medio | 1 mL FBS |
| 75 U DNasi I (75 U / uL in PBS) | |
| 9 ml di PBS | |
| media Siero | 1 mL FBS |
| media 9 ml basale | |
| mezzo di congelamento | 4 ml DMSO |
| 24 ml di terreno di base | |
| 12 ml 30% FBS | |
| media differenziazione | 90 mL terreno di base |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 mL 200 mM L-glutammina | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-base (bFGF umano) (Soluzione di 25 ng / ml in mezzo Neurobasal): 10 ng / ml o 1 mg totale per 100 mL | |
| media Starvation | 95 ml di terreno di base |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 mL 200 mM L-glutammina | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabella 1: Ricetta di soluzioni.
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Figura 1: schema di neurosfere cultura e differenziazione protocolli. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Neurosfere Esporre Differenziazione capacità. (A) neurosfere rappresentativi sono mostrati. (B) Neurosfere state piastrate su vetrini PLL- e laminina rivestite in mezzo NSC per 2 giorni e sono stati immunoistochimica contro nestina (marcatore di cellule staminali / progenitrici neurali). (CE) Neurosfere state piastrate seguendo la procedura descritta nella sezione 2 sul PLL- e coprioggetto in terreno di differenziamento laminina rivestite per 7 giorni senzut dissociazione; fisso; e immunoistochimica contro β-tubulina III (marcatore neuronale), GFAP (marcatore astrociti), e O4 (marcatore oligodendrociti). I nuclei sono stati colorati per DAPI. bar scala = 100 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Neurosfere e neuroni in Adherent differenziata Neurosfere sono Ciliated. (A) neurospheres indissociate state piastrate su vetrini rivestiti in mezzo NSC per 2 d; fisso; e immunoistochimica contro Gpr161 (verde), Arl13b (rosso), e DNA (blu). (B) neuroni dissociati sono stati immunoistochimica contro Gpr161 (verde), Arl13b (rosso, A) o β-tubulina III (rosso, B), e il DNA (blu). frecce bianche indicano Gpr161 localizzazione in cilia.I pannelli a destra in (A) sono viste ingrandite del ciglio primario indicata dalla freccia bianca. Cilium Gpr161-positivo nel neurone bianco-scatola è mostrato a destra (B). Scala = 10 micron (A); 50 um (B). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: fluttuante, indifferenziata Neurosfere possiedono cellule ciliate. neurosfere galleggianti sono state fissate, incorporato in ottobre, cryosectioned, e trattati per immunofluorescenza contro Arl13b (rosso) e di DNA. cilia primaria Arl13b-positivi in un neurosfere sono presenti. Il pannello (A) è una sporgenza massima intensità di 14 z sezioni a 0.8 micron intervalli da un neurosfere. I pannelli in (B) mostrano la vista ingrandita di ccellule iliated nella regione di bianco inscatolato in (A). L'immagine massima sporgenza rispetto tutte z sezioni è indicata come una pila, mentre i numeri da 1 a 14 indicano singole z sezioni. Le frecce bianche indicano cilia primaria. bar scala = 50 pm. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: fame Induce Ciliogenesis in dissociato Adherent Neural Stem / cellule progenitrici. (A) cellule dissociate sono state piastrate su vetrini rivestiti in media NSC o mezzo fame per 24 h; fisso; e immunoistochimica contro Gpr161 (verde), Arl13b (rosso), e DNA (blu). cilia Gpr161-positive si osservano nel controllo (sinistra) e cellule affamate (a destra). I pannelli inferiori sono viste ingrandite delle caselle bianche indicato nelle rispettivepannelli superiori. Le frecce bianche e frecce indicano cilia Gpr161-positivi e -negativa, rispettivamente. bar scala = 100 pm. (B) Quantificazione di cellule Arl13b-positivi ciliate (grafico a sinistra) e Gpr161 localizzazione in cilia Arl13b-positivi (destra grafico) in controllo e cellule affamate. Le percentuali di entrambe le cellule ciliate Arl13b-positivi e Gpr161 localizzazione in cilia Arl13b-positivi aumentata sotto fame. La quantificazione è stata eseguita da due campi di vista ciascuno da due repliche tecniche di un singolo esperimento. I dati sono rappresentati come media da tutti i 4 campi di vista ± la deviazione standard. *, P <0,05; ** P <0,01. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: trasfezione inDissociata aderente Neural Stem / cellule progenitrici. Cellule dissociate placcato su vetrini rivestiti sono state transfettate con un PAL-TULP3 N-terminale (1-183 aa) mut12 costrutto che non si lega al nucleo IFT-56 complessa. Il mezzo è stato cambiato per mezzo di fame 24 ore dopo la trasfezione. Le cellule sono state fissate dopo 24 ore e immunoistochimica contro GFP (verde), Gpr161 (rosso), Arl13b (magenta), e il DNA (blu). Una cellula transfettate con Gpr161- e Arl13b positivi cilium è contrassegnato da una freccia bianca, mentre una cellula trasfettata senza cilia è indicata con una freccia bianca. Giallo frecce e frecce indicano le cellule non trasfettate con o senza Gpr161 / Arl13b, rispettivamente. bar scala = 10 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, descriviamo un metodo per generare e mantenere colture di neurosfere da SVZ topo adulto. Alcuni punti pertinenti riguardanti le culture sono i seguenti. In primo luogo, le dimensioni delle sfere sono tipicamente tra 50 - 200 um. Nella nostra esperienza, quando un neurosfere diventa più grande di 300 micron di diametro, il momento ottimale per passaging è stato mancato. Queste sfere più grandi contengono cellule morte nel nucleo. In secondo luogo, come neurosfere sono comunemente usati per studiare le cellule staminali / progenitrici neurali, è importante utilizzare EGF e FGF-base (bFGF) mantenere lo stemness di queste cellule. Pertanto, i fattori che inducono differenziazione, come FBS, devono essere evitati durante la manutenzione delle neurosfere. E 'stato dimostrato che il 10% FBS può differenziare neurospheres in astrociti 47. In terzo luogo, il grado di differenziazione neuronale potrebbe dipendere l'età di mouse. Se uno vuole la differenziazione neuronale più da neurosfere, topi più giovani (da postnataley 0) può essere utilizzato. In quarto luogo, se a partire nuove culture, è sempre bene per esaminare la capacità di differenziazione delle neurosfere. In quinto luogo, il nostro metodo permette anche di congelamento e scongelamento da colture di neurosfere stabiliti per il futuro uso sperimentale. Dopo lo scongelamento, le cellule crescono tipicamente cellule fusiformi come aderenti senza poli-L-lisina o laminina. Ciò può essere causato da danni gelo-disgelo alle cellule. È importante mantenere le cellule crescere fino a diventare 60 - 80% confluenti prima del passaggio. Dopo il passaggio, le cellule tipicamente crescere come neurosfere e possono generalmente essere diversi passaggi fino a 5 - 10 volte.
metodi di coltura neurosfere basati permettono di studiare il traffico ciliare e vie di segnalazione di staminali neurali / cellule progenitrici e neuroni differenziati. Abbiamo esaminato cilia primaria galleggianti / neurosfere aderenti e differenziate. È importante acquisire diversi z-sezioni per visualizzare cilia durante tutta la misura delle neurosfere. Inoltre, a poppaer generando culture aderenti di tali neurosfere, e fame per 24 ore, la maggior parte delle cellule sono ciliate (Figura 5) e arricchito nel orfano GPCR, Gpr161. Tuttavia, prolungato fame delle culture aderenti risultati in strutture subcellulari vacuolare. Pertanto, è importante per ottimizzare la cura periodi fame per particolari scopi sperimentali.
Attualmente, studi sulla ciliogenesis sono prevalentemente eseguite in pochi ciliato, immortalate linee cellulari 57. Queste linee cellulari non sempre fedelmente ricapitolano i neuroni e le cellule staminali / progenitrici neurali nell'esprimere componenti di segnalamento, come GPCR o macchinari pathway Shh, che rende indispensabile per lo sviluppo di nuovi metodi per studiare il ruolo delle ciglia nei processi biologici. I metodi basati neurosfere qui descritti permettono di studiare vie cellulari cilia-regolato, tra GPCR e segnalazione Shh nel contesto / cellule progenitrici neurali staminali e diffneuroni erentiated.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
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