Summary
主な繊毛は、神経前駆細胞の増殖、ニューロン分化、および成人の神経機能における基本的に重要です。ここでは、繊毛形成とプライマリニューロスフェア培養を用いて神経幹/前駆細胞および分化したニューロンにおける繊毛へのシグナル伝達タンパク質の輸送を研究するための方法について説明します。
Introduction
一次繊毛は、成体神経機能3における胚神経発達1、2、及び区画細胞内シグナル伝達の間ソニックヘッジホッグ（Shhの）経路を含む細胞シグナル伝達経路の調整における感覚アンテナとして機能する微小管ベースの動的細胞内区画である4 。このような5にパッチを当てShhの受容体として、これらの経路のシグナル伝達成分、。経路アクチベーターあるSmoothened（SMO）6。そしてGpr161 7、負のShh経路を調節するオーファンGタンパク質共役型受容体（GPCR）は、動的に繊毛に局在します。複数のGPCRは、10脳7、8、9で神経細胞に繊毛に局在することが報告されていますSUP>、11、12、13、14、15、16。繊毛および繊毛で生成シグナル伝達経路における欠陥は、複数の組織に影響を与えると総称ciliopathies 17、18、19として知られています。繊毛病の疾患スペクトルはしばしば、頭蓋顔面異常20、21、22のような神経発達の欠陥を含みます。加えて、視床下部ニューロンにおける主要繊毛は、中央満腹経路を調節し、欠陥は、バルデーBiedel症候群24として症候群ciliopathiesにおける肥満をミラーリング、中心性肥満23をもたらします。また、繊毛シグナリング神経ペプチド受容体はCENTRを調節しますアル満腹14、11経路。毛様体アデニリルシクラーゼIII（ACIII）の局在化および海馬ニューロンにおけるそのようなソマトスタチン受容体3としてGPCRは、新規物体認識欠陥および記憶欠損25をもたらし26と毛様体の整合27の欠如に匹敵します。繊毛が生成したシグナルの発達的側面は密接に組織恒常性に結びついています。特に、繊毛は小脳28、29における顆粒前駆細胞から生じるのShhサブタイプの髄芽腫の進行に重要です。このように、主繊毛は、胚、出生後、および成人の神経細胞の発達と機能の間に重要な役割を果たしています。
神経幹細胞（NSCは）、側脳室の脳室下帯（SVZ）に存在する海馬の歯状回の顆粒下ゾーン、及び哺乳類30、31、32における視床下部における第三脳室の脳室帯。 NSCは、多能ある自己複製能を有し、かつ脳の発達と再生医療30のために重要です。 SVZのほとんどのNSCは、静止していると、多くの場合、側脳室33に張り出し孤独主要繊毛を持っています。特にShhは、TGFβ、および受容体チロシンキナーゼ経路2、34、35、36に関連して、下流の細胞応答を誘導する様々な受容体の局在化を介して、一次繊毛信号。一次繊毛は、側脳室中に延びているので、一次繊毛は、脳脊髄液（CSF）のNSC 37を活性化するためにサイトカインを検出すると仮定されます、Shhのシグナル伝達経路と主な繊毛が嗅上皮、肺、腎臓および38を含む複数の組織の修復および再生における幹細胞の活性化のために重要であることを示唆している39、40、41。しかしながら、CSFは、NSCを用いて一次繊毛が関与しているかどうかを通信するメカニズムは知られていません。文化の中で付着NSCは繊毛されています。このような繊毛でのSmoとGpr161としてのShh経路成分を、ローカライズ。そして42応答のShhです。このように、NSCは、Shhの経路を研究するための重要なモデル系、毛様体人身売買、および神経分化経路としての役割を果たすことができます。また、NSCをから分化したニューロンはまた、繊毛輸送アッセイのために使用することができます。
ニューロスフェアはneuraの増殖から生じる浮遊細胞のクラスターで構成されています特定の増殖因子と非接着面43、44の存在下で増殖L幹/前駆細胞。ニューロスフェアは、正常な発達と病気31、45、46、47の神経幹/前駆細胞を研究するためにin vitro培養モデルのように重要な役割を果たす。ここでは、神経幹/前駆細胞を培養するためにニューロン/グリアへの分化のためのニューロスフェアベースのアッセイを説明します。我々は、特に神経幹/前駆細胞および分化したニューロン（ 図1）の繊毛へのコンポーネントのシグナリングの輸送を強調する。一次ニューロンの培養とは対照的に、一次ニューロスフェアは、培養するのが比較的容易である複数の継代および凍結 - 融解のサイクルに適している、およびニューロン/グリアへの分化を受けることができます。重要なのは、我々はそのニューロスフェア由来神経を決定しました幹/前駆細胞と分化したニューロンは、培養中の繊毛およびこれらの区画における繊毛機能に関連するシグナル伝達分子局在化しています。ニューロスフェアベースの培養方法は、NSCの分化及びニューロンにおいて繊毛形成と繊毛輸送を研究するための理想的なモデル系として役立つことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
成体マウス脳からのニューロスフェアの単離
- イソフルランの過剰投与により（約2ヶ月）成体マウスを安楽死させます。マウスが呼吸を停止し、死の直後に解剖したことをダブルチェック。
- はさみを使用して、頭蓋骨を開くために正中切開を行います。脳を削除します。
- 氷の上で10cmディッシュに冷たいPBSで脳を置きます。側脳室48からSVZを得るために全体のマウント解剖の方法に従ってください。
- 、1.5mlチューブに側脳室を配置し、0.05％トリプシン-EDTAをPBS中の500μLを添加し、水浴中で37℃で15分間チューブをインキュベートします。
- 15分後、停止中の500μLを加え、穏やかに20ピペット - 1mLの先端と30回。ピペット操作中に気泡を形成することは避けてください。
注：この手順は、細胞の生存に重要です。 - 8分間、500×gで細胞をスピンダウン。 、上清を捨て、PBS 1 mLを加え、再懸濁さt穏やかに1 mLの先端で5回ピペッティングすることにより彼の細胞。
- 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。
- （オプション）細胞破片が認められた場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。
- 血球計数器を用いた細胞の数を数えます。一般的には、約30,000 - 60,000細胞/ SVZが得られます。
- プレートを5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養の10mlで10cmディッシュに1つのSVZからの細胞。
- 球体49との間の融合を回避するために（オプション）、5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養1.5mLの予め充填されている超低結合、6ウェルプレートの1ウェルに1,000細胞を置きます。
注：5-7日後、神経球を観察することができる（ 図2A）。培養期間は、マウスの年齢や遺伝的背景と異なる場合があります。 - 文化を維持するために、3〜4日ごとにNSC培地2mlを追加（既存のメディアを削除しないでください）。
ニューロスフェアの分化能と繊毛形成試験の2分析
- 分化能を分析するために、分化培地中の付着条件の下での神経球を分析します。
- オートクレーブまたは使用前にUV照射で12ミリメートルラウンドカバースリップを滅菌します。接着細胞培養のために、無菌条件下で24ウェルプレートのウェルに滅菌12ミリメートル丸いカバーガラスを置きます。
- 0.002％ポリ-L-リシン（PLL）の500μLで10秒間コートカバーガラス。ソリューションを吸引し、10〜15分間、それを乾燥させます。
- ラミニン溶液500μL（5μgの/μL）を追加します。 37℃で1時間、カバーガラスをインキュベートします。
- ラミニンを吸引し、分化培地またはNSC培地（未分化対照）500μLを加えます。
- 顕微鏡下で200μLチップで200ミクロン球 - 分化アッセイのために、100を拾います。加えます分化培地で7〜10日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10神経球。
- 未分化神経球を分析するために、NSC培地中で1〜2日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10ニューロスフィアを加えます。添付の神経球を広げ、単層（ 図2B）として成長します。
- 注意深く培地を除去した後、室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて細胞を固定し、その後、室温で5分間、PBSで二回洗浄します。プレートを1~2ヶ月間4℃で保存することができます。
注：（神経幹/前駆細胞マーカー）ネスチンに対して免疫染色を行い、NSC培地中で神経幹/前駆細胞と分化培地中で分化した細胞を可視化するために、βチューブリンIII（TUJ1モノクローナル、ニューロンマーカー）、GFAP（グリア線維酸性タンパク質、星状細胞のマーカー）、及びO4（オリゴデンドロサイトマーカー）（ 図2B-E）。 （Arl13bに対する一次CIを免疫染色を行い、繊毛を分析するためにリア・マーカー）とGpr161（毛様体GPCR）（ 図3）。 - スライドガラス上に溶液を取り付けるとカバーガラスをマウントします。過剰の溶液を除去するためのスライドガラスを傾けます。
ニューロスフェアにおける繊毛形成の3分析
- 免疫染色によって、無傷のニューロスフェア中の細胞を分析するために、培養培地の転送1mLを1.5mlチューブに複数のニューロスフェアを含有し、8分間、500×gでスピンダウン。 15分間、培地を除去した後、4％（PFA）で球体を固定し、PBSで洗浄します。 、8分間、500×gで球をスピンダウンし、上清を除去し、そして4℃で30％スクロースと球O / Nインキュベートします。
- 1mLのチップを使用して上清を捨て、カット1mLのチップを用いたOCT溶液の500μLを加えます。 10月が粘性であるように、開口部を広くする先端の縁を切りました。
- 使い捨てプラスチック凍結モールド（10ミリメートル×10ミリメートル×5ミリメートル）にニューロスフェアを含有するのOCT溶液を移します。
- メートルをフリーズ少なくとも15分間ドライアイス上の古いです。
- （オプション）実験を停止し、最大1年間-80℃の冷凍庫内の金型を格納します。
- クライオスタットを持つセクションをカット。セクションの厚さは15〜30ミクロンでなければなりません。
- ニューロスフェア中の一次繊毛を視覚化するために、Arl13bに対する免疫染色（ 図4）を実行します。
4.文化とニューロスフェアと接着NSCのパッセージ
- パッセージの神経球球のサイズは100〜200μmの間にありながら、ニューロスフェアは、（300ミクロン以上）大きすぎるとき、彼らは実験のための理想的ではありません。
- 1mLのチップを使用して、50mLのチューブに神経球を移し、8分間、500×gでスピンダウン。
- アスピレータを用いて上清を捨て、PBS中の0.05％トリプシンEDTAの500μLを添加し、37℃で5分間インキュベートします。トリプシンの量は、球の数によって異なります。
- 血清中の500μLを加え、穏やかにパイプ1mLの先端とT 20回。
- 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。
- （オプション）細胞残屑や非解離神経球が見られる場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。
- 通路NSC培地中10,000細胞/ cm 2の密度で10cmディッシュ中の細胞。細胞は、一週間後の次の通過のための準備が整います。
- （任意）50万1,000,000細胞/ mL懸濁液を生成するために、凍結培地追加、細胞を凍結します。クライオ冷凍容器を用いて細胞を凍結します。解離していないの神経球はまた、凍結することができます。
- 接着培養のために、1~2日間NSC培地、および培養とPLL-ラミニン被覆カバースリップ上に50,000細胞/ cm 2に細胞をdillute。
5.飢餓と繊毛の分析
- 飢餓培地（ 表1）を調製。
- 1~2日、最初のPL後別のウェル（実験）で解離、1つのウェル（対照）におけるNSC培地に変更し、飢餓培地後の接着細胞のating。
- 文化24時間接着細胞。
- RTで15分間、PBS中の4％PFAで細胞を固定し、室温で5分間ずつPBSで2回洗浄します。
- （オプション）実験を停止し、1~2ヶ月間、4℃でPBSでカバーガラスを含む24ウェルプレートを格納します。
- 7、50を染色するための免疫プロトコルを実行します。
- マウントソリューションを使用してカバースリップをマウントします。暗所でRTでスライドガラスO / Nを乾燥させます。
- 必要な倍率の複合顕微鏡で画像を取得します。同行のソフトウェアを使用して制御顕微鏡、カメラ、および目的（40X / 1.3油および63X / 1.4油）を、使用してください。 0.5〜0.8μmの間隔（ 図5）において十分なZ-セクションを取ります。
- で毛様体局在の定量分析のために接着細胞を、DAPIチャネルに調べることによってコンフルエント細胞と3-8の連続するフィールドからの画像スタックを取得します。 ImageJの/フィジーを使用して、プライマリ繊毛の数を定量化します。一般的に、ImageJのプラグインで「セルカウンタ」ツールを使用する> GPCR陽性繊毛で細胞をカウントするためのダイアログボックスを分析します。画像のスタックからの最大突出はまた、目的をカウントし、エクスポートするための同一の実験からのすべての画像のためのImageJ / Fiji.Use同様の画像輝度及びコントラストパラメータからエクスポートすることができます。
ニューロスフェアの6トランスフェクション
- 24時間カバーガラスに解離細胞を接着。 24ウェルプレートの単一のウェルに500μLNSCの培地中で、典型的には75,000との間の150,000細胞の細胞密度を使用します。
- 5秒間ボルテックスすることにより低減血清培地および0.5 mLのマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1.5μLの25μLを混合します。
- 別個0.5mLのmicrotubにエンドトキシンフリープラスミドDNA2.5μgのを追加eは減少血清培地の25μLを含有し、5秒間ボルテックスして混合します。
- DNAを含む第二のマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1μLを添加し、5秒間ボルテックスすることにより混合します。
- DNAを含有するチューブから最初のマイクロチューブに混合物を添加し、ピペッティングにより混合します。
- RTで10〜15分間混合物をインキュベートします。インキュベーション後、穏やかNSC媒体の上面（500μL/ウェル）でウェルにトランスフェクション混合物を滴下して加えます。
- 培地（NSC培地）又は飢餓培地（500μL/ウェル）を制御するために媒体24時間後、トランスフェクションを変更します。
- 24時間後に4％PFAに培地を交換することによって細胞を固定し、免疫染色を行います。典型的には、10％のトランスフェクション効率までこのプロトコルを使用して得られます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
週間NSC培地中のSVZからの細胞をプレーティングした後、浮遊ニューロスフェアは、（ 図2A）が観察されました。球のサイズは、50と200μmの間で変化しました。球が神経幹/前駆細胞に由来するものであったかどうかを調べるために、ニューロスフェアは、2日間PLL-とNSC培地中のラミニンでコーティングしたカバーガラス上にプレーティングしました。これらはその後、神経幹/前駆細胞マーカー、ネスチンに対して免疫染色しました。二日は球がカバースリップに接続すると、細胞の単層として成長できるようにするために必要でした。細胞の単層は、ネスチン（ 図2B）について陽性でした。ニューロスフェアの分化能を調べるために、我々は、7〜10日間PLL-の上のセクション2で説明したステップと解離せずに分化培地中でラミニンコーティングしたカバースリップを、以下にそれらをメッキ。それは差別のために少なくとも1週間かかります。ニューロスフェアは、カバースリップに取り付けられ、拡張しますedは、細胞の単層として成長します。我々は、細胞を固定し、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトマーカーに対する免疫染色しました。我々は、βチューブリンIII陽性ニューロン、GFAP陽性アストロサイトに分化接着ニューロスフィアを観察し、O4陽性オリゴデンドロサイト（ 図2C-E）。したがって、多能ニューロスフェアは、成体マウスのSVZ由来することができます。
接着性神経球および分化したニューロンは、一次繊毛を持っているかどうかを決定するために、我々はArl13b（一次繊毛マーカー）51とGpr161（毛様体局在GPCR）7に対して免疫染色しました。私たちの経験では、ARL13B-mCherryをを表現可能なマウスモデルにおいて、および脳内のマウス皮質を開発し、ほとんどの（すべてではない）の神経繊毛を用いた研究のすべてのニューロンがACIII陽性をされていない一方、52、53、54、Arl13bを表明しました。木sが、私たちは、主に神経細胞の繊毛を検出するために、Arl13bに依存しています。我々は、一次繊毛と接着ニューロスフィア（ 図3A）で前駆細胞の繊毛へと分化した神経細胞（ 図3B）におけるGpr161の局在を検出します。したがって、接着ニューロスフィアおよび分化系統は、培養中の繊毛およびシグナル伝達分子を局在化されます。
セクション3で概説したように、浮遊ニューロスフェアは、一次繊毛を持っているかどうかを決定するために、我々は切断ニューロスフェア（ 図4A-B）の神経幹/前駆細胞に一次繊毛を観察し、定着後の浮遊ニューロスフェアを凍結切片。単一のz平面における一次繊毛を検査することは困難であるので、完全に一次繊毛を視覚化するためにニューロスフェアを横切ってZ-セクションを取得することが重要です。要約すると、未分化ニューロスフェアは、繊毛と非繊毛細胞の不均一な集団を持っています。
図5A-B）で培養したものと比較して、Arl13bによって検出されるように、繊毛の増加割合を観察しました。加えて、我々は、飢餓時Gpr161陽性繊毛（％Gpr161陽性繊毛/ Arl13b陽性繊毛）（ 図5A-B）の数の増加を指摘しました。興味深いことに、未分化型ヒト胚性幹細胞株を使用した以前の研究では、培養中のヒト胚性幹細胞は、プライマリ繊毛55を有することが示されました。繊毛これらの細胞株における血清飢餓時の増加、及びこれらの繊毛の数と長さものShh機械の構成要素を有します。
また、付着性神経幹/ progenitoをトランスフェクトセクション6で概説したようにR細胞、我々は、典型的には実験室での一次ニューロン培養物と同様、最大10％のトランスフェクション効率（ 図6）を検出します。
| 溶液 | 成分 |
| 1×PBS | オートクレーブ水で10×PBSを希釈 |
| NSC培地 | 2mLの50X B27 |
| 1mLの100×N2 | |
| 1 mLの200 mM L-グルタミン | |
| 1mLの100×ペニシリン/ストレプトマイシン | |
| FGF塩基性（ヒトbFGF）（Neurobasal培地中ストック溶液に25ng / mL）を100 mLのメディアのために20ng / mlの又は2mgの合計 | |
| EGF（Neurobasal培地中のストック溶液に25ng / mL）を100 mLのメディアのために20ng / mlの又は2mgの合計 | |
| 95 mLの基礎培地 | |
| ヒトFGF塩基性（ヒトbFGF） | 市販のヒトbFGFを25μgの瓶に1 mLの基礎培地 |
| -20℃以下での滅菌マイクロチューブに保管してください。単一の80μLアリコート又は2μgの/ 100mLのNSC培地を使用します。 | |
| EGF | 商用EGF20μgのボトルに8 mLの基礎培地を追加 |
| -20℃以下のような滅菌マイクロチューブを格納します。単一の80μgのアリコート/ 100mLの培地を使用します。 | |
| 停止中 | 1mLのFBS |
| 75 U DNアーゼI（PBS中の75 U / UL） | |
| 9mLのPBS | |
| 血清培地 | 1mLのFBS |
| 9mLの基本培地 | |
| 凍結培地 | 4mLのDMSO |
| 24 mLの基礎培地 | |
| 12 mLの30％FBS | |
| 分化培地 | 90mLの基礎培地 |
| 5mLの5％FBS | |
| 1mLの100×ペニシリン/ストレプトマイシン | |
| 1 mLの200 mM L-グルタミン | |
| 1mLの100×N2 | |
| 2mLの50X B27 | |
| FGF塩基性（ヒトbFGF）（Neurobasal培地中25 ngの/ mlのストック溶液）：100mLのために10ng / mlまたは1mgの合計 | |
| 飢餓培地 | 95 mLの基礎培地 |
| 1mLの100×ペニシリン/ストレプトマイシン | |
| 1 mLの200 mM L-グルタミン | |
| 1mLの100×N2 | |
| 2mLの50X B27 |
表1：ソリューションのレシピ。
1 ">：「=キープtogether.withinページFO" ve_content
図1：ニューロスフェア培養および分化プロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ニューロスフェア展示分化能。 （A）代表的なニューロスフェアが示されています。 （B）ニューロスフェアを2日間PLL-およびNSC培地中でラミニン被覆カバースリップ上に播種しネスチン（神経幹/前駆細胞のマーカー）に対して免疫染色しました。 （CE）ニューロスフェアはwitho 7日間分化培地でPLL-上のセクション2で説明した手順とラミニン被覆カバースリップを以下播種しUT解離;一定;そしてβチューブリンIII（ニューロンマーカー）、GFAP（星状細胞のマーカー）、及びO4（オリゴデンドロサイトマーカー）に対して免疫染色しました。核はDAPIで染色しました。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：接着差別ニューロスフェアでのニューロスフェアと神経細胞が繊毛あります。 （A）解離していない神経球を、2日間NSC培地でコートしたカバーガラス上にプレーティングしました。一定;そしてGpr161（緑）、Arl13b（赤）、およびDNA（青）に対する免疫染色。 （B）分化したニューロンはArl13b（赤、A）またはβチューブリンIII（赤、B）、およびDNA（青）、Gpr161（緑色）に対して免疫染色しました。白い矢印は、繊毛にGpr161の局在を示しています。（A）の右パネルは白い矢印で示す一次繊毛の拡大図です。ホワイトボックス化ニューロンにおけるGpr161陽性繊毛は、（B）の右側に示されています。スケール=10μmの（A）。 50μmの（B）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4は：フローティング、未分化神経球は、繊毛細胞を有します。浮遊ニューロスフェアは、固定されたOCTに包埋し、凍結切片、およびArl13b（赤）及びDNAに対する免疫蛍光のために処理しました。 ニューロスフェアでArl13b陽性主な繊毛が示されています。 （A）中のパネルは、神経球から0.8μmの間隔で14のzセクションの最大強度の投影です。 （B）中のパネルは、Cの拡大図を示しています（A）において白四角で囲まれた領域内の細胞をiliated。番号1〜14は、個々のz断面を示しながら、全てのzセクションから最大の投影像は、スタックとして示されています。白い矢印は、プライマリ繊毛を示しています。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：飢餓誘導繊毛形成解離付着神経幹/前駆細胞です。 （A）解離した細胞を、NSC培地または24時間飢餓培地でコートしたカバーガラス上にプレーティングしました。一定;そしてGpr161（緑）、Arl13b（赤）、およびDNA（青）に対する免疫染色。 Gpr161陽性繊毛は、コントロール（左）および飢餓状態（右）細胞において観察されます。下のパネルは、それぞれに示されている白いボックスの拡大図であります上パネル。白矢印と矢印は、それぞれ、Gpr161陽性および陰性繊毛を示します。スケールバー=100μmです。 （B）Arl13b陽性繊毛細胞（左グラフ）の定量とGpr161制御と飢餓細胞においてArl13b陽性繊毛（右グラフ）に局在。 Arl13b陽性繊毛細胞およびGpr161はArl13b陽性繊毛に局在化の両方のパーセンテージは、飢餓時に増加しました。定量化は、単一の実験の2つの技術的複製物から2つの視野からそれぞれ行いました。データは±標準偏差ビューのすべての4つのフィールドからの平均として表されます。 *、P <0.05; **、P <0.01。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：トランスフェクションで解離付着性神経幹/前駆細胞。コーティングされたカバースリップ上に播種解離した細胞は、コアIFT複合体56に結合しないLAP-TULP3 N末端（1-183 AA）mut12構築物でトランスフェクトしました。培地を飢餓培地中24時間トランスフェクション後に変更しました。細胞は、24時間後に固定し、GFP（緑色）に対して免疫染色しました Gpr161（赤）、Arl13b（マゼンタ）、およびDNA（青）。繊毛ことなくトランスフェクトされた細胞は、白矢印で示されているがGpr161-とArl13b陽性繊毛でトランスフェクトされた細胞は、白抜き矢印でマークされています。黄色の矢印および矢じりは、それぞれGpr161 / Arl13b、を含むまたは含まない非トランスフェクト細胞を指します。 =10μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、成体マウスのSVZからニューロスフェア培養を生成し、維持するための方法について説明します。次のように文化に関するいくつかの適切なポイントがあります。 200ミクロン - まず、球の大きさは、通常50の間です。ニューロスフェアは、直径がより大きく300μm以下を取得し、私たちの経験では、継代のための最適な時間が見逃されています。これらの大きな球は、コア内の死細胞を含んでいます。ニューロスフェアは、一般的に神経幹/前駆細胞を研究するために使用されているように、第2、これらの細胞の幹細胞性を維持するために、EGFとFGF-基本（のbFGF）を使用することが重要です。したがって、例えばFBS等の分化を誘導する因子は、ニューロスフィアのメンテナンス時に避けなければなりません。 10％FBSがアストロサイト47への神経球を区別することができることが示されています。第三に、神経分化の程度は、マウスの年齢に依存する場合があります。 1は、神経球からより多くの神経分化を希望する場合は、若いマウス（生後ダY 0）を使用することができます。新しい文化を開始する場合には第四に、神経球の分化能を調べるために、常に良いです。第五に、私たちの方法は、また、将来の実験的な使用のために確立されたニューロスフェア培養物から凍結融解することができます。解凍後、細胞は、典型的には、ポリ-L-リジン又はラミニンなしのような付着性紡錘状細胞を成長させます。これは、細胞への凍結融解損傷によって引き起こされることがあります。通過する前に、80％コンフルエント - 彼らが60になるまで成長している細胞を維持することが重要です。経過した後、細胞は、典型的には、ニューロスフェアとして成長し、一般的に5まで継代することができる - 10回。
ニューロスフェアベースの培養法は、私たちは、繊毛輸送および神経幹/前駆細胞および分化したニューロンにおけるシグナル伝達経路を研究することができます。我々は、フローティング/付着性と差別ニューロスフェアのプライマリ繊毛を調べました。ニューロスフェアの全範囲にわたって繊毛を視覚化するために、いくつかのzセクションを取得することが重要です。さらに、後方ERこれらのニューロスフェアの付着培養物を生成し、そして24時間のためにそれらを飢え、細胞の大部分は（ 図5）繊毛及びオーファンGPCR、Gpr161に富んでいます。しかし、細胞内液胞構造における接着培養結果の飢餓を延長しました。したがって、慎重に特定の実験の目的のために飢餓期間を最適化することが重要です。
現在、繊毛形成の研究は主に、いくつかの繊毛で行われ、細胞株57を不死化。これらの細胞株は、常に忠実にそれが不可欠生物学的プロセスにおける繊毛の役割を研究するための新しい方法を開発すること、などのGPCRまたはShhの経路機械などシグナル伝達成分を、表現するニューロンおよび神経幹/前駆細胞を再現していません。ここで説明したニューロスフェアベースの方法は、神経幹/前駆細胞の文脈や差分におけるGPCRとShhシグナル伝達を含め、私たちは、繊毛-規制細胞経路を研究することができますerentiatedニューロン。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
