用于研究涡虫眼睛再生的手术消融实验

摘要

本方案展示了如何在不损伤周围组织的情况下，稳定地切除涡虫的眼睛（视杯）。使用胰岛素针头和注射器，可选择性地切除单侧或双侧眼睛，以促进对调控眼睛再生的机制、视觉再生的进化以及光诱导行为的神经基础等领域的研究。

摘要

在成体干细胞与再生机制的研究中，涡虫（planarian flatworms）是一种常用的体内（in vivo）模型系统。这主要归因于其丰富的多能干细胞群体，以及在遭受对大多数动物而言致命的损伤后仍能再生所有细胞和组织类型的能力。近年来，涡虫作为眼再生研究模型的受欢迎程度日益增加。它们能够再生完整的眼部结构（由两种组织类型组成：色素细胞和感光细胞），从而为解析视觉系统再生的调控机制提供了理想条件。相较于其他技术（如头部切除或打孔法），眼部消融法在研究眼特异性通路和机制方面具有多项优势，其中最重要的是再生过程基本局限于眼部组织本身。本视频文章旨在演示如何可靠地去除涡虫的视杯结构，同时不损伤脑组织或周围组织。文中还描述了涡虫的操作方法以及稳定品系的维持。该技术使用一根31 G、5/16英寸的胰岛素针，在低温板上固定涡虫后，通过外科手术方式将视杯组织挖除。该方法适用于单眼和双眼消融，眼睛通常在1至2周内再生，因而具有广泛的应用前景。特别地，该消融技术可轻松结合药理学和遗传学（RNA干扰）筛选，以更深入地理解再生机制及其演化规律、眼干细胞的特性与维持机制，以及趋光行为反应及其神经基础。

引言

涡虫是研究成体干细胞介导再生的有力模式生物。这些非寄生性淡水扁形动物具有再生任何缺失组织的能力，包括其中枢神经系统和大脑¹早在18世纪就已开始研究²，过去10至15年中涡虫研究领域的技术进步（例如基因组测序完成、 原位 杂交、免疫组织化学、RNA干扰（RNAi）和转录组学）使这一经典模式生物重新焕发活力。特别是，涡虫近年来逐渐成为眼睛研究领域的一种新兴模式生物。³.

涡虫的眼睛具有原型结构，仅包含两种组织类型，即感光神经元和色素细胞；这使得研究人员能够鉴定其眼干细胞群体，并证明许多调控脊椎动物眼睛发育的基因在涡虫中是保守的^4,5视杯位于背部，由感光神经元的白色无色素树突和新月形的黑色色素细胞组成，眼睛通过视交叉与脑部相连。此外，该模型还被用于阐明再生过程⁶，涡虫的眼睛非常适合用于研究视觉机制的进化⁷，对光的行为反应（涡虫表现出负趋光性）⁸行为的神经学基础⁹.

方案

1. 动物培养与操作

注意：本实验方案使用地中海涡虫（Schmidtea mediterranea），这是一种基因组已测序的二倍体涡虫物种^16,17，常用于再生研究。然而，该检测方法在其他物种中同样成功，例如虎纹涡虫（Girardia tigrina）和多头涡虫（Girardia dorotocephala）（这些物种可商业获得）。

1. 在超纯水（或过滤去离子水）中配制含 0.5 g/L 海盐的“蠕虫水”以维持蠕虫培养。使用无菌的聚丙烯或玻璃容器盛装蠕虫水。有关蠕虫水配制的详细信息，请参见 补充文件 1。
   注意：切勿使用肥皂清洗容器（或其他用品），因为肥皂对蠕虫具有毒性；应使用 70% 乙醇擦拭后自然晾干。
   1. 操作涡虫时应佩戴手套，以防止污染。
      注意：蠕虫对环境毒素和化学物质极为敏感，包括肥皂、漂白剂、洗发水、护发素和护手霜。
2. 将种群饲养于聚丙烯食....

结果

术后最初1-2小时内，动物的活动能力可能较完整个体的蠕虫有所减弱（但仍会移动）。如有需要，蠕虫在术后24小时内即可进食（例如用于RNAi喂养实验）。在对同一批个体进行眼再生过程的长期观察时，务必在手术前（完整状态）和消融后1小时（hpa）分别对每条蠕虫拍照记录。消融后4天（dpa）应可见再生的色素细胞，至14 dpa时整个眼睛将完全再生（图3A-B）。再生内容包括感光神经元及其向脑部的神经支配（图3C），以及视觉系统的功能恢复（图4A-C）。成功的消融操作不会损伤脑组织的深层组织（图4D-E），也不会对动物造成其他损伤（图5A）。失败的消融操作包括：切除范围过大导致两眼之间相连（图5B）、动物体侧边缘出现撕裂（图5C），和/或伤口穿透腹侧表皮（图5D）。此外，未能完全去除整个视杯结构也属于失败操作，视杯包.......

讨论

这种眼部消融技术通过排除脑组织并主要将切除范围限制在眼部组织，改进了现有方法（如打孔法）。经过练习，大多数人员均可掌握该技术，从具有显微手术经验的技术人员到虽无经验但认真细致的本科学生皆可操作。建议在将消融技术应用于正式实验前进行多次练习，包括（在条件允许时）通过免疫组织化学方法验证眼部组织是否完全去除。 原位 眼标记物的杂交^4,5,13该方案中最关键的步骤是挖取组织。必须注意避免去除过多或过少的组织。为防止针头刺穿至蠕虫腹侧，操作时不应挖得过深。针尖插入深度应约为0.4 mm，针头斜面部分切勿完全穿透眼球。需特别注意保护两眼之间脆弱的组织（每只眼黑色色素区域的内侧边缘即为眼睛的边界）。同时应避免损伤眼睛与蠕虫远端边缘之间的组织。体型较小的蠕虫更容易撕裂或意外受损，因此建议使用体型较大的蠕虫（尤其是用于练习时）。该技术的主要局限性在于耗时相对较长（不适用于高通量筛选），且需要经过一定练习以确保操作的准确性。然而，经过训练后，可在约15.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Instant Ocean 海盐	Spectrum Brands	SS15-10	"10 加仑" 盒子  （净重 3 磅）
Kimwipes EX-L 无尘擦拭纸	Kimberly-Clark	34155	4.5 英寸 × 8.5 英寸
Whatman #2 滤纸	Sigma	WHA1002125	圆形，直径125 mm，白色
Easy Touch 胰岛素注射器（带针头）	宠物健康市场	17175-04	U-100 1 cc 注射器，31 G 5/16 英寸针头
100 mm 培养皿	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
60 mm 培养皿	VWR	25384-092	60 mm × 15 mm
Dumont #5  镊子	Fine Science Tools	11254-20	不锈钢，直头，11 厘米
移液管	萨姆科科学公司	225	刻度，大球，7.5 mL，非无菌
Parafilm M 石蜡膜	品牌	701606	4 英寸 × 125 英尺卷装
12孔未处理组织培养板	VWR	15705-059	未处理，平底，无菌，Falcon 品牌
塑料食品容器（用于菌落）	Ziploc	大型矩形	2.25 夸脱（2.12 L），10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
涡虫（Planaria）Girardia tigrina)	卡罗来纳生物公司	132954	出售为 "布朗" 涡虫；最常见的是 G. tigrina （又称 Dugesia tigrina），但有时是 G. dorotocephala （又称 Dugesia dorotocephala）；两者皆可。
涡虫（Planaria）地中海涡虫)	n/a	n/a	S. mediterranea 尚未商业化供应。目前，这些动物仅可从使用该动物且有富余动物的实验室获得。
棕色纸巾	格雷格纳	2U229	9-3/16 × 9-3/8" 未漂白单层多折纸巾
洗瓶（用于线虫水），可选	VWR	16650-275	洗瓶，低密度聚乙烯，广口，500 mL
抗突触素抗体，可选	发育研究杂交瘤库	3C11	上清液
抗arrestin抗体，可选	n/a	n/a	非商业产品，由塔夫茨大学 Michael Levin 惠赠
Nalgene Lowboy 带龙头大瓶（用于储存线虫培养液），可选	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L  聚丙烯，低剖面设计，便于填充塑料菌落容器
定制帕尔贴板，可选	Williams 机器公司，福克斯伯勒，马萨诸塞州	n/a	设计细节由塔夫茨大学 Junji Morokuma 提供：  帕尔贴板由标准的热电制冷模块构成（例如，All Electronics Corp 目录号 PJT-1，30 mm）2).  方形热泵表面覆盖一层薄的镜面后，置于30 mm2 圆形有机玻璃模具（直径约50 mm）上的方形孔。该模具厚度与热泵相近，并可平整嵌入圆形散热片（直径约115 mm）中心部位精密加工的凹槽内。模具/热泵  "锚定的" 使用硅基导热硅脂将散热器固定到散热片上。引线穿过在成形件和散热器上钻出的孔。散热器的下半部分被加工成 "足" 适合放入显微镜底板开口的
直流电源（用于帕尔帖板），可选	B & K 精密仪器	1665	可调直流低压电源，1-18 V（直流），1-10 安培
其他常用耗材
手套
剃刀刀片
剪刀
使用鹅颈灯解剖显微镜
筷子架，可选