本方案展示了如何在不损伤周围组织的情况下，稳定地切除涡虫的眼睛（视杯）。使用胰岛素针头和注射器，可选择性地切除单侧或双侧眼睛，以促进对调控眼睛再生的机制、视觉再生的进化以及光诱导行为的神经基础等领域的研究。
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摘要
摘要
在成体干细胞与再生机制的研究中，涡虫（planarian flatworms）是一种常用的体内（in vivo）模型系统。这主要归因于其丰富的多能干细胞群体，以及在遭受对大多数动物而言致命的损伤后仍能再生所有细胞和组织类型的能力。近年来，涡虫作为眼再生研究模型的受欢迎程度日益增加。它们能够再生完整的眼部结构（由两种组织类型组成：色素细胞和感光细胞），从而为解析视觉系统再生的调控机制提供了理想条件。相较于其他技术（如头部切除或打孔法），眼部消融法在研究眼特异性通路和机制方面具有多项优势，其中最重要的是再生过程基本局限于眼部组织本身。本视频文章旨在演示如何可靠地去除涡虫的视杯结构，同时不损伤脑组织或周围组织。文中还描述了涡虫的操作方法以及稳定品系的维持。该技术使用一根31 G、5/16英寸的胰岛素针，在低温板上固定涡虫后，通过外科手术方式将视杯组织挖除。该方法适用于单眼和双眼消融，眼睛通常在1至2周内再生，因而具有广泛的应用前景。特别地，该消融技术可轻松结合药理学和遗传学（RNA干扰）筛选，以更深入地理解再生机制及其演化规律、眼干细胞的特性与维持机制，以及趋光行为反应及其神经基础。
引言
涡虫是研究成体干细胞介导再生的有力模式生物。这些非寄生性淡水扁形动物具有再生任何缺失组织的能力，包括其中枢神经系统和大脑1早在18世纪就已开始研究2，过去10至15年中涡虫研究领域的技术进步（例如基因组测序完成、 原位 杂交、免疫组织化学、RNA干扰（RNAi）和转录组学）使这一经典模式生物重新焕发活力。特别是，涡虫近年来逐渐成为眼睛研究领域的一种新兴模式生物。3.
涡虫的眼睛具有原型结构，仅包含两种组织类型，即感光神经元和色素细胞；这使得研究人员能够鉴定其眼干细胞群体，并证明许多调控脊椎动物眼睛发育的基因在涡虫中是保守的4,5视杯位于背部，由感光神经元的白色无色素树突和新月形的黑色色素细胞组成，眼睛通过视交叉与脑部相连。此外，该模型还被用于阐明再生过程6，涡虫的眼睛非常适合用于研究视觉机制的进化7，对光的行为反应（涡虫表现出负趋光性）8行为的神经学基础9.
涡虫眼睛再生的研究主要集中在两个方面：一是头部截除后头部再生过程中的眼睛再生4,10，二是仅切除眼组织后的再生11,12。目前大多数关于涡虫眼睛再生的研究采用的是截头法，因其操作简单直接。迄今为止最常用的涡虫眼组织切除方法是使用细玻璃毛细管进行打孔切除13,14，尽管也有研究采用仅在眼睛后方进行截除（部分截头）的方法15。然而，所有这些方法都会导致除眼睛以外的多种组织丢失（如脑组织、肠道和原肾管），可能使实验结果的解释变得复杂。本文所介绍的眼组织消融方案将切除范围严格限制在眼组织内（明确排除脑组织），从而获得更特异于眼睛再生的数据。此外，与截头后的涡虫需要7–14天才开始进食不同，眼组织消融后的涡虫在消融后24小时内即可恢复进食12，因此可同时开展RNA干扰实验（RNAi通过食物递送）。
尽管摘除眼睛在技术上比断头术更难成功实施，但目前涉及切除眼睛的研究尚未包含详细的操作步骤。本视频文章的目的是使研究人员能够稳定地移除涡虫的视杯结构，同时不损伤其下方的脑组织，并尽可能少地去除其他组织。该方法可用于单眼或双眼摘除，适用于多种研究场景。与大多数再生实验一样，眼摘除非常适合与药理学和遗传学（RNAi）筛选以及行为学研究相结合。本文将介绍涡虫的处理方法、涡虫品系的维持以及眼摘除技术本身的具体操作步骤。
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方案
1. 动物培养与操作
注意：本实验方案使用地中海涡虫（Schmidtea mediterranea），这是一种基因组已测序的二倍体涡虫物种16,17，常用于再生研究。然而，该检测方法在其他物种中同样成功，例如虎纹涡虫（Girardia tigrina）和多头涡虫（Girardia dorotocephala）（这些物种可商业获得）。
- 在超纯水（或过滤去离子水）中配制含 0.5 g/L 海盐的“蠕虫水”以维持蠕虫培养。使用无菌的聚丙烯或玻璃容器盛装蠕虫水。有关蠕虫水配制的详细信息，请参见 补充文件 1。
注意：切勿使用肥皂清洗容器（或其他用品），因为肥皂对蠕虫具有毒性；应使用 70% 乙醇擦拭后自然晾干。- 操作涡虫时应佩戴手套，以防止污染。
注意：蠕虫对环境毒素和化学物质极为敏感，包括肥皂、漂白剂、洗发水、护发素和护手霜。
- 操作涡虫时应佩戴手套，以防止污染。
- 将种群饲养于聚丙烯食品容器中，盖子部分打开以利于空气交换，温度维持在约 20 °C（室温）。实验用蠕虫可存放于培养皿（每 100 mm 培养皿放置 20 条）或未经处理的组织培养板（12 孔板中每孔 1 条）。为减少应激，种群和实验均应置于黑暗环境中。
注意：每升蠕虫水中种群密度不应超过 500–1,000 条。实验期间应将盖子完全盖好，因为这些培养皿本身已设计有通气结构。 - 每周喂食一次非实验用蠕虫，使用匀浆的有机牛肝或鸡肝，通过移液管滴加，将食物均匀分布于容器中。让蠕虫在黑暗中摄食 2 小时后再进行容器清洁（见步骤 1.4）。短期（数周）储存匀浆物于 -20 °C，长期（数月）储存则置于 -80 °C；切勿将解冻后的匀浆物再次冷冻（以免细菌增殖而损害蠕虫）。
注意：肝脏应不含激素或抗生素，且最好未经预先冷冻。在冷冻前（或喂食前）对匀浆物进行离心，以去除空气，防止食物漂浮。食物应沉降至容器底部。1 mL 匀浆物足以喂养 500–1,000 条蠕虫。 - 每周更换一次种群和实验用容器中的水，使用新鲜蠕虫水。对于饥饿状态的蠕虫，每周用未漂白的纸巾擦拭容器内壁一次；对于喂食状态的蠕虫，则每周两次（喂食后 2 小时及之后第 2 天各一次），以清除黏液残留物，防止废物积聚。为保留生物膜，擦拭面积不得超过容器表面积的 80%。
- 使用移液管在容器之间（或手术装置间）转移蠕虫。若蠕虫附着于容器表面，可向其上方或后方喷水使其脱离表面，然后吸入移液管中，并尽量使蠕虫保持在移液管底部一英寸（较细）区域。
- 在吸取蠕虫前，先用少量蠕虫水反向装填移液管。
- 尽量移动水流带动蠕虫，而非直接移动蠕虫本身，以避免移液管接触导致软体蠕虫撕裂。
- 除非正在转移蠕虫或更换水，否则应保持实验培养皿加盖状态。
2. 准备
- 实验前至少一周停止喂食涡虫。
- 选择至少一周未喂食、体长不小于5-7 mm的涡虫。将涡虫转移至装有三分之二虫用培养液的培养皿中，通过将尺子置于培养皿下方确认虫体长度。测量时应确保涡虫完全伸展并处于运动状态。
注意：在进行后续免疫荧光实验时，较小的（5-7 mm）涡虫效果更佳 原位 杂交分析中，较大的涡虫（8-10 mm）更易于操作——尤其是在学习进行眼消融时。 - 确保涡虫完整无损，且未处于近期再生状态。
注意：与正常涡虫相比，正在再生的涡虫头部和/或尾部区域的色素会明显变浅（或完全无色素）。 - 若对涡虫进行RNAi或药物处理，应在本步骤进行。若涡虫的处理涉及喂食（如RNAi实验），则需在最后一次喂食后至少等待7天，再继续进行步骤2.2。
- 选择至少一周未喂食、体长不小于5-7 mm的涡虫。将涡虫转移至装有三分之二虫用培养液的培养皿中，通过将尺子置于培养皿下方确认虫体长度。测量时应确保涡虫完全伸展并处于运动状态。
- 用70%乙醇清洁工作区域和解剖显微镜底座，并使其完全干燥。将盛有选定蠕虫的培养皿置于显微镜左侧。在显微镜右侧放置一对#5镊子、一支带有1 mL注射器的31 G 5/16英寸胰岛素针头以及一支干净的移液管。
- 确保器械不接触实验台（以免引入污染物）。使用硬质物品（如筷子架）保持镊子、针头和移液器的清洁。或者，将器械放置在一张新的棕色（未漂白）纸巾上。
注意：这些及后续说明均以惯用右手者为对象撰写。惯用左手者应将左右方向互换。
- 确保器械不接触实验台（以免引入污染物）。使用硬质物品（如筷子架）保持镊子、针头和移液器的清洁。或者，将器械放置在一张新的棕色（未漂白）纸巾上。
- 在工作区旁边放置一盒无尘擦拭纸、新鲜涡虫水来源以及一些额外的转移移液管（需远离实验台面保护）。将涡虫水装入塑料洗瓶中以便于取用。在显微镜右侧放置一个已标记的12孔板（或100 mm培养皿），用于收集完成去眼的动物。
- 若使用自制的帕尔帖冷却板来固定涡虫，将帕尔帖板置于体视显微镜底座的凹槽内，并调节直流电源的输出，使帕尔帖板的工作表面足够冷却（通常约为 5 V）。或者，可通过将一个 100 mm 培养皿注满冰水混合物来制作冷板 ½ 用清水装满后冷冻至少24小时。弃去盖子，将100 mm培养皿的底部置于解剖显微镜的底座上，然后将60 mm培养皿的盖子倒扣在冰面之上（图1A）。
- 在100 mm培养皿中的水结冰后，一个 "火山" 冰块可能会出现在培养皿中央。若发生此情况，需使用剃刀刀片将冰面刮平，以去除表面不平整之处。
注意：手术过程中冰会融化，导致消融操作变得困难。请预先准备多个冰盘，并在60 mm培养皿的盖子开始漂浮时，立即用未融化的冰盘替换正在融化的冰盘。
- 在100 mm培养皿中的水结冰后，一个 "火山" 冰块可能会出现在培养皿中央。若发生此情况，需使用剃刀刀片将冰面刮平，以去除表面不平整之处。
- 准备手术表面。裁剪一块5 cm × 10 cm的塑料石蜡膜（4 cm2 若使用培养皿冷板，则将其置于固定装置的中央。将一块无尘擦拭纸折叠成约2 cm的方形2 并将其置于膜上。剪取一片1.5–2 cm的白色滤纸2 并将其置于擦拭垫上方。参见图1B-1E。
- 用戴着手套的手指按住折叠的擦拭纸，并用涡虫培养用水轻轻润湿擦拭纸，以确保其保持折叠状态。然后使用移液管的一侧将擦拭纸滚平。
注意：低温有助于防止蠕虫移动。操作时 "干燥" 也有助于固定。组织擦拭纸可通过滤纸吸走水分，使涡虫在手术过程中保持湿润，同时避免其完全干燥（完全干燥会导致死亡）。
- 用戴着手套的手指按住折叠的擦拭纸，并用涡虫培养用水轻轻润湿擦拭纸，以确保其保持折叠状态。然后使用移液管的一侧将擦拭纸滚平。
3. 手术消融
- 使用移液管将一只涡虫背侧朝上放置于滤纸上。打开光源，调节鹅颈管使光线聚焦于涡虫。调节解剖显微镜的焦距和放大倍数，使眼睛清晰可见（无需完整看到整个虫体）；5倍放大倍数是一个合适的起始点。通过旋转石蜡膜来调整涡虫方向，使头部朝向研究人员（朝向显微镜前方），并向右倾斜30–40度。
- 避免使用强光，以防止涡虫过度移动。涡虫具有负趋光性，会试图逃离强光环境。
- 若涡虫腹面朝上（可见咽部开口），应使用镊子的钝面轻轻将其翻转至背面朝上（使眼点可见）。翻转过程中应避免使用镊子尖端接触动物，以尽量减少因刺破软组织而造成损伤的风险。
- 调节显微镜焦距，使眼睛清晰对焦。同时确保眼睛及周围头部组织均在视野范围内。
- 用右手像握笔一样握住一支新的针头/注射器（拇指与食指之间）。将左手拇指抵住帕尔帖冷却板（或培养皿冷板），并以左手拇指作为支点，使注射器的下部 resting 在其上（图2A）。通过显微镜观察，确保针头的斜面可见。
注意：针头非常锋利，操作时需谨慎。佩戴乳胶或丁腈手套可提供一定保护。- 在整个操作过程中，用左手拇指协助固定针头/注射器，保持稳定，避免手部抖动。
- 形成约40度角° 用左手拇指和左食指（食指置于手术表面）协助固定手术表面，保持其稳定。
- 将针头斜面朝上（如勺子般），使针头与眼睛呈直角位置（图2B）。用针尖轻轻刺入覆盖在眼杯（白色、无色素区域）上的薄层组织，从右向左进行刮取。极其轻柔地移除位于其中的任何色素组织 在视杯内部操作时，需注意不要刺穿底部或破坏视杯的边界。
- 如果涡虫已在滤纸上方停留 >在操作过程中的任意时刻，每隔1-2分钟，加入一滴涡虫水以重新润湿涡虫。
注意：脱水会增加涡虫撕裂损伤的风险。
- 如果涡虫已在滤纸上方停留 >在操作过程中的任意时刻，每隔1-2分钟，加入一滴涡虫水以重新润湿涡虫。
- 重复步骤 3.3，直至所有黑色色素组织（色素细胞）以及视杯中的白色组织（感光细胞的树突）完全清除。用纸巾轻轻擦拭针尖，以去除附着在其末端的切除组织。如需进行双眼消融，此时对第二只眼进行消融。
注意：为避免受伤，可用拇指和食指捏住干净的纸巾擦拭针头，另一只手将针头从拇指和食指之间向外拉过纸巾进行清洁。或者，也可将针头在湿润的纸巾表面擦拭，并检查其清洁程度。 - 操作完成后，使用移液管将虫体转移至含有新鲜蠕虫培养液的已标记培养皿中。若需分析群体数据，可将最多20条虫体置于一个100 mm的培养皿中；若需长期追踪同一虫体的再生过程，则应将每条虫体单独放入12孔板的各个孔中。待所有虫体转移完毕后，通过吸除培养皿或孔中的旧培养液并更换为新鲜蠕虫培养液，对虫体进行清洗。
- 为将蠕虫从滤纸上移除，先用少量蠕虫培养水反向吸取至移液管中，然后将水释放到蠕虫上。这会使蠕虫脱离滤纸，并立即被吸入移液管中以进行转移。
- 在约 20 ℃ 下孵育实验 °室温避光保存，并观察再生过程。
注意：可以将蠕虫保存在温度可控的培养箱中以维持恒定温度，但并非绝对必要。大多数室温波动仅为 +5 °C，这不会影响涡虫的再生能力。 - 如有需要，可将蠕虫固定用于免疫组织化学（参见 图3-4）和/或 原位 基因表达的杂交分析。对于涡虫免疫组织化学，存在不同的固定方法。18,19,20 以及 原位 杂交21,22,23 方案
- 实验结束后，将活体涡虫从培养皿中取出，去除虫水后加入70%乙醇。孵育3-5分钟，观察涡虫是否发生裂解并变为灰白色。
- 将未处理的涡虫在处死后放入常规废物流中。避免将活体涡虫引入环境，尤其是非本地物种。
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结果
术后最初1-2小时内，动物的活动能力可能较完整个体的蠕虫有所减弱（但仍会移动）。如有需要，蠕虫在术后24小时内即可进食（例如用于RNAi喂养实验）。在对同一批个体进行眼再生过程的长期观察时，务必在手术前（完整状态）和消融后1小时（hpa）分别对每条蠕虫拍照记录。消融后4天（dpa）应可见再生的色素细胞，至14 dpa时整个眼睛将完全再生（图3A-B）。再生内容包括感光神经元及其向脑部的神经支配（图3C），以及视觉系统的功能恢复（图4A-C）。成功的消融操作不会损伤脑组织的深层组织（图4D-E），也不会对动物造成其他损伤（图5A）。失败的消融操作包括：切除范围过大导致两眼之间相连（图5B）、动物体侧边缘出现撕裂（图5C），和/或伤口穿透腹侧表皮（图5D）。此外，未能完全去除整个视杯结构也属于失败操作，视杯包...
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讨论
这种眼部消融技术通过排除脑组织并主要将切除范围限制在眼部组织，改进了现有方法（如打孔法）。经过练习，大多数人员均可掌握该技术，从具有显微手术经验的技术人员到虽无经验但认真细致的本科学生皆可操作。建议在将消融技术应用于正式实验前进行多次练习，包括（在条件允许时）通过免疫组织化学方法验证眼部组织是否完全去除。 原位 眼标记物的杂交4,5,13该方案中最关键的步骤是挖取组织。必须注意避免去除过多或过少的组织。为防止针头刺穿至蠕虫腹侧，操作时不应挖得过深。针尖插入深度应约为0.4 mm，针头斜面部分切勿完全穿透眼球。需特别注意保护两眼之间脆弱的组织（每只眼黑色色素区域的内侧边缘即为眼睛的边界）。同时应避免损伤眼睛与蠕虫远端边缘之间的组织。体型较小的蠕虫更容易撕裂或意外受损，因此建议使用体型较大的蠕虫（尤其是用于练习时）。该技术的主要局限性在于耗时相对较长（不适用于高通量筛选），且需要经过一定练习以确保操作的准确性。然而，经过训练后，可在约15...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Michelle Deochand对这一眼部消融技术的完善，感谢Taylor Birkholz在功能检测方面的协助，感谢Michael Levin提供抗阻遏蛋白抗体，以及感谢Junji Morokuma提供有关帕尔帖板的信息。本研究工作得到了西密歇根大学授予WSB的SFSA资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Instant Ocean 海盐 | Spectrum Brands | SS15-10 | "10 加仑" 盒子 （净重 3 磅） |
| Kimwipes EX-L 无尘擦拭纸 | Kimberly-Clark | 34155 | 4.5 英寸 × 8.5 英寸 |
| Whatman #2 滤纸 | Sigma | WHA1002125 | 圆形，直径125 mm，白色 |
| Easy Touch 胰岛素注射器（带针头） | 宠物健康市场 | 17175-04 | U-100 1 cc 注射器，31 G 5/16 英寸针头 |
| 100 mm 培养皿 | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| 60 mm 培养皿 | VWR | 25384-092 | 60 mm × 15 mm |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | 不锈钢，直头，11 厘米 |
| 移液管 | 萨姆科科学公司 | 225 | 刻度，大球，7.5 mL，非无菌 |
| Parafilm M 石蜡膜 | 品牌 | 701606 | 4 英寸 × 125 英尺卷装 |
| 12孔未处理组织培养板 | VWR | 15705-059 | 未处理，平底，无菌，Falcon 品牌 |
| 塑料食品容器（用于菌落） | Ziploc | 大型矩形 | 2.25 夸脱（2.12 L），10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16" |
| 涡虫（Planaria）Girardia tigrina) | 卡罗来纳生物公司 | 132954 | 出售为 "布朗" 涡虫；最常见的是 G. tigrina （又称 Dugesia tigrina），但有时是 G. dorotocephala （又称 Dugesia dorotocephala）；两者皆可。 |
| 涡虫（Planaria）地中海涡虫) | n/a | n/a | S. mediterranea 尚未商业化供应。目前，这些动物仅可从使用该动物且有富余动物的实验室获得。 |
| 棕色纸巾 | 格雷格纳 | 2U229 | 9-3/16 × 9-3/8" 未漂白单层多折纸巾 |
| 洗瓶（用于线虫水），可选 | VWR | 16650-275 | 洗瓶，低密度聚乙烯，广口，500 mL |
| 抗突触素抗体，可选 | 发育研究杂交瘤库 | 3C11 | 上清液 |
| 抗arrestin抗体，可选 | n/a | n/a | 非商业产品，由塔夫茨大学 Michael Levin 惠赠 |
| Nalgene Lowboy 带龙头大瓶（用于储存线虫培养液），可选 | Nalge Nunc International Corporation | 2324-0015 | 15 L 聚丙烯，低剖面设计，便于填充塑料菌落容器 |
| 定制帕尔贴板，可选 | Williams 机器公司，福克斯伯勒，马萨诸塞州 | n/a | 设计细节由塔夫茨大学 Junji Morokuma 提供： 帕尔贴板由标准的热电制冷模块构成（例如，All Electronics Corp 目录号 PJT-1，30 mm）2). 方形热泵表面覆盖一层薄的镜面后，置于30 mm2 圆形有机玻璃模具（直径约50 mm）上的方形孔。该模具厚度与热泵相近，并可平整嵌入圆形散热片（直径约115 mm）中心部位精密加工的凹槽内。模具/热泵 "锚定的" 使用硅基导热硅脂将散热器固定到散热片上。引线穿过在成形件和散热器上钻出的孔。散热器的下半部分被加工成 "足" 适合放入显微镜底板开口的 |
| 直流电源（用于帕尔帖板），可选 | B & K 精密仪器 | 1665 | 可调直流低压电源，1-18 V（直流），1-10 安培 |
| 其他常用耗材 | |||
| 手套 | |||
| 剃刀刀片 | |||
| 剪刀 | |||
| 使用鹅颈灯解剖显微镜 | |||
| 筷子架，可选 |
参考文献
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