Summary
Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.
Abstract
Vaak cellulaire gedrag en cellulaire reacties worden geanalyseerd op het bevolkingsniveau waar de reacties van veel cellen samen worden gebundeld als een gemiddelde resultaat maskeren de rijke eencellige gedrag binnen een complexe bevolking. Eencellige eiwit detectie en kwantificering technologieën hebben een opmerkelijke invloed gemaakt in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een praktische en flexibele eencellige analyse platform gebaseerd op adresseerbare druppel microarrays. Deze studie beschrijft hoe de absolute moleculen van doel eiwitten met eencellige resolutie kan worden gemeten. De tumor suppressor p53 is het meestal gemuteerde gen in menselijke kanker, met meer dan 50% van de totale kankergevallen vertoont een patroon van niet-gezonde p53 uitdrukking. Het protocol wordt beschreven stappen voor het maken van 10 nL druppels waarbinnen één menselijke kankercellen worden geïsoleerd en de exemplaaraantal van p53 proteïne wordt gemeten met een enkel molecuul resolutie precies bepalen de variabiliteit in expressie. De methode kan worden toegepast op elk celtype met inbegrip van primaire materiaal om te bepalen van de absolute exemplaaraantal van elke doelgroep proteïnen van belang.
Introduction
Het doel van deze methode is het bepalen van de variatie in overvloed van een doel-eiwit in een celpopulatie met eencellige resolutie. Eencellige analyse biedt een aantal voordelen die niet beschikbaar met traditionele ensemble biochemische methoden. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in de eerste plaats werken op het niveau van eencellige kan vangen de rijke heterogeniteit van een celpopulatie die anders verloren zou gaan door de gemiddeld dat met traditionele ensemble biochemische technieken optreedt. De meerderheid van de biochemische methoden werkpaard werken met het grootste deel, waarbij, zoals ze vaak doen, miljoenen cellen om een resultaat te produceren. Natuurlijk, de gevolgen voor de beoordeling van de gehele cel populaties hangt af van een aantal factoren, bijvoorbeeld de heterogeniteit in eiwit expressie waar enkele belangrijke kenmerken van de verdeling van eiwit overvloed kunnen worden gemist. Vanuit een praktisch perspectief, de gevoeligheid van eencellige technieken vereist maken hen geschikt voor het werken met hoeveelheden van biologisch materiaal dat onvoldoende is voor zelfs de meer gevoelige bulk technieken om te kunnen functioneren. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de studie van zeldzame celtypes zoals circulerende tumorcellen (CTCs) waar zelfs voor patiënten met een slechte prognostische vooruitzichten minder dan 10 CTCs zou aanwezig zijn in een één 7,5 mL bloed trekken. 6 hier presenteren we de methodologie die is vereist voor het uitvoeren van eencellige eiwit metingen met behulp van een verminderde volume antilichaam gebaseerde assay met druppels olie-afgetopte op een microarray antilichaam afgedrukt.
Microfluidic druppel perrons zijn hoge doorvoer, staat voor het genereren van duizenden druppeltjes per seconde, en geschikt voor isoleren, en zelfs kweken, afzonderlijke cellen in afzonderlijke druppels voor het uitvoeren van een breed scala van biochemische tests. Druppel gebaseerde technieken zijn geschikt voor eencellige analyse,7,8,9 met opmerkelijke recente voorbeelden, waaronder DropSeq10 en inDrop11, die aanzienlijk door de kracht van geholpen hebben amplificatie technieken. De beperkte hoeveelheid materiaal en geen methoden voor amplificatie voor eiwitten maken eencellige proteomics vooral een uitdaging.
Druppels kunnen worden geanalyseerd door een aantal methoden en fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt. Enkel molecuul technieken zoals de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie kunt fluorescerende moleculen aan met ongeëvenaarde signal-to-noise verhouding worden gevisualiseerd. 12 als gevolg van de exponentiële afname van het vluchtig veld, alleen fluorophores in de nabijheid van de hoog aan de oppervlakte (volgorde van 100nm) zijn enthousiast maken TIRF een goede strategie voor het opsporen van kleine hoeveelheden van een doelmolecule in een complex mengsel. De inherente optische vectorafbeeldingsbestanden sterkte van TIRF helpt ook om te voorkomen dat wassen stappen en grenzen assay tijd en complexiteit. Echter TIRF vereist vlakke oppervlakken en voorbeelden van TIRF microscopie toegepast op druppels in stroom betrekking hebben op de vorming van een vlakke oppervlakte van die afbeelding. 13 daarom eencellige proteomic technieken vaak ontwerpen microfluidic chips rond oppervlak-geïmmobiliseerd vangen agenten in een microarray opmaken. 4 , 14
De druppels, zelf, kunnen worden gevormd in matrices op vlakke oppervlakken, zogenaamde druppel microarrays. 15 , 16 , 17 ruimtelijk ordenen druppels in arrays kan ze gemakkelijk kunnen worden gunstig geïndexeerd, gecontroleerd na verloop van tijd, individueel gericht en, indien nodig, ontvangen. Druppel microarrays kan het bereiken van een hoge dichtheid van micro-reactoren met duizenden elementen per spaander die vrijstaande of ondersteund door microwell structuren zijn. 18 , 19 , 20 zij kunnen worden gevormd door opeenvolgende afzetting door liquid handling-robots, inkjet spotters, neem contact op met microarrayers21,22,23,24,25, 26 , of ze kunnen zichzelf monteren op oppervlakken zoals superhydrophillic plekken patroon op een superhydrophobic ondergrond. 27 , 28 , 29
Met deze overwegingen in het achterhoofd, werden adresseerbare Droplet Microarrays (ADMs) ontworpen om de veelzijdigheid, ruimtelijke serverprocessor en verminderde hoeveelheid druppel microarrays combineren met de gevoeligheid van een enkel molecuul TIRF microscopie aan kwantitatief maatregel eiwit overvloed. 5 ADMs inschakelen eencellige analyse vormen een druppel microarray met enkele cellen over een microarray antilichaam, die vervolgens wordt afgetopt met olie om te voorkomen dat de verdamping. De volumes van de druppels zijn discrete om verlies van de steekproef, die anders zou kunnen worden bereikt door op de chip kleppen in continue stroom microfluidics te voorkomen. 30 de absolute hoeveelheid eiwit van het doel van een enkele cel is extreem klein; de beperkte omvang van de druppels staat echter voor relatief hoge lokale concentratie opdat zij worden gedetecteerd met behulp van een sandwich antilichaam assay - antilichaam is geblokkeerd in een afzonderlijke regio, of ter plaatse, op een oppervlak dat vangt eiwit die op zijn beurt bindt aan een fluorescently geëtiketteerde detectieantilichaam aanwezig in het volume van de druppel. Als een etiket-vrije benadering (d.w.z. eiwit doelstellingen niet hoeft direct worden geëtiketteerd), ADMs zijn algemeen toepasbaar zijn bij de analyse van cellen uit primaire bronnen, zoals verwerkte bloed, prima moeten aangeblazen en gedissocieerde tumor biopsieën, evenals cellen van cultuur en hun lysates.
Meten van de variatie in eiwit overvloed over een celpopulatie is belangrijk bij het bepalen van de heterogeniteit in reactie, bijvoorbeeld aan een drug en zal helpen bij het verstrekken van inzicht in de cellulaire functies en trajecten, beoordeling van de subpopulaties en hun gedrag, alsmede identificatie van zeldzame gebeurtenissen dat anders zou worden gemaskeerd door bulk methoden. Dit protocol beschrijft hoe kan produceren en gebruiken van microarrays van de adresseerbare druppel kwantitatief bepalen de overvloed van de transcriptie factor p53 in menselijke kankercellen en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van p53 in reactie op chemotherapeutische geneesmiddelen. Het doel eiwit wordt bepaald door de keuze van vastleggen en detectie van antistoffen en kan worden gewijzigd om meer of andere doelen. Instructies om te bouwen van een eenvoudige apparaat opnemen een concentrische mondstuk van algemene lab verbruiksartikelen aan handmatig array 10 nL druppels afgetopt met olie. De volledige experimentele proces wordt beschreven waarbij elke druppel is vervolgens geladen met een enkele cel, die vervolgens is lysed en de uitdrukking van eiwit met enkel molecuul resolutie met behulp van microscopie van TIRF vastgesteld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding
-
Maken van chips en print antilichaam microarrays
- Een zelfklevende siliconen/acryl isolator hechten aan een dekglaasje aan matiemaatschappij ter ondersteuning van een microarray antilichaam. Dit is de chip genoemd.
Opmerking: Verschillende oppervlakte chemicaliën zijn getest op hun geschiktheid met adresseerbare druppels. 5 oppervlakte oplossingen moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor alternatieve vangen agenten. ADM isolatoren commercieel beschikbaar zijn of kunnen worden geproduceerd door laser snijden acryl (CAD bestand voor isolator in dit werk gebruikt als een download wordt verstrekt; zie het Aanvullende codebestand). - Zet de microarrayer en stelt u de luchtvochtigheid op 75%.
Opmerking: relatieve vochtigheid vermindert verdamping van oplossing om te printen vanaf de microarray pin en vermindert de variatie van de intra - en intersite - spot. - Reinig de microarray pin PIN schoonmaakvloeistof voor 5 min door met ultrasone trillingen. Spoel de pin met ultra pure water met behulp van een fles van wassen en drogen met behulp van stikstof.
Opmerking: Schorten de pin dat alleen het onderdompelen van de pin-tip. Een microscoopglaasje met een adequaat geboorde gaten set zal helpen als een pin-houder kan niet worden verkregen. - Breng 5 mL print buffer bestaande uit 3 × saline-Natriumcitraat (SSC) buffer, 1.5 M betaïne aangevuld met 0,01% natrium dodecyl sulfaat (SDS). Bewaren bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
- Ter voorbereiding van een oplossing om te printen, ontdooien anti-p53 antilichaam (p53/Mdm2 ELISA kit; Zie de tabel van materialen) aliquots opgeslagen bij-80 ° C. Meng het 1:1 met print buffer om een eindconcentratie van 0,5 mg/mL. Laden van 5-10 µL van oplossing om te printen in een 384 well-plate met behulp van een micropipet en plaats in het microarrayer.
- Laden chips geassembleerd in stap 1.1.1 tot de microarrayer. Het programma van de microarrayer af te drukken van vlekken op de coördinaten die zijn gedefinieerd door het midden van elk putje van de isolator.
Opmerking: Microarrayers dienst een aantal, voornamelijk propriëtaire software en zodat de lezer aangemoedigd wordt om de relevante literatuur te raadplegen. De microarray die nodig zijn voor de ADM isolator featured in de bijbehorende CAD-bestand in stap 1.1.1 bestaat uit rechthoekige elementen; de relevante afstanden worden geleverd. - Opslaan van de chips in luchtdichte containers en wikkel met folie. Bewaren bij 4 ° C tot 6 weken.
Opmerking: De folie is om elke foto-schade te voorkomen. Opslag bij 4 ° C beperkt het afbraak tempo van biomoleculen en eventuele schadelijke reacties die ter vermindering van microarray activiteit kunnen fungeren. De luchtdichte kunt chips om equilibreer tot kamertemperatuur voor gebruik zonder condensatie vormen op het oppervlak van de chip. Neem contact op met microarray afdrukken exploits oppervlaktespanning en hechting tussen de print oplossing en de print substraat tot vlekken. Vooraf afdrukken of bevlekken is normaal vereist om overtollige oplossing van de microarray pin uniform formaat plekken opleveren. Gooi niet de opofferende vooraf print dekglaasje aan omdat het gebruikt kan worden om te beoordelen van de kwaliteit van de partij.
- Een zelfklevende siliconen/acryl isolator hechten aan een dekglaasje aan matiemaatschappij ter ondersteuning van een microarray antilichaam. Dit is de chip genoemd.
-
Voorbereiding spuiten, buizen en concentrische nozzle voor de verstrekking van de adresseerbare druppels
- Demonteren van 100 µL (voor de waterige druppel) en 1 mL (voor de overkoepelende olie) glas Hamilton spuiten en spoel delen met gedestilleerd H2O.
- Een 100 mm lengte van 150 µm feed ID/360 µm OD gesmolten siliciumdioxide buizen door middel van een 40 mm lengte van 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA buis totdat het steekt door 2 mm. Dit zal het vormen van de concentrische mondstuk.
- Breng een dunne laag van Cyanoacrylaat lijm aan het einde van een 10 µL pipette uiteinde en invoegen in de 40 mm stuk van 1,0 mm ID/1/16 "OD PFA buis. Indien nodig, verplaatst de gesmolten siliciumdioxide buis te handhaven een 2 mm uitsteeksel op het mondstuk voor de zelfklevende sets.
- Het andere uiteinde van de gesmolten siliciumdioxide capillaire invoegen aan het einde van een 200 mm lengte van 0.014" ID/0.062" OD PTFE buis en sluit deze aan op een 100 µL Hamilton spuit gevuld met 4% runderserum eiwit (BSA) in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (PBSA).
Opmerking: Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan oppervlakken en kan worden verloren of gedenatureerd. BSA wordt gebruikt om te 'blokkeren' oppervlakken om te minimaliseren van niet-specifieke binding door sacrificially te binden aan deze oppervlakken. - Plaats een 400 mm lengte van 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP Slangen in een 200 µL pipette uiteinde totdat het een afdichting vormt. Breng een dunne laag van Cyanoacrylaat lijm aan een andere 200 µL pipette uiteinde en dit in de eerste tip de buis vast op zijn plaats te duwen. Het open uiteinde van de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing verbinden met een 1 mL Hamilton spuit gevuld met minerale olie.
- De 200 µL pipette uiteinde vergadering invoegen het 10 µL pipette uiteinde van de concentrische verstuiver. Plaats de injectiespuiten in aparte injectiespuit pompen omdat zij moeten onafhankelijk worden geëxploiteerd.
- Vul de spuit 100 µL met 4% PBSA blokkerende oplossing. Opnieuw koppelen en leegmaken van de 'waterig' buis met de blokkerende oplossing. Herhaal dit twee keer voor een totaal van 3 flushes.
- Vul de spuit 100 µL met 0,125 µg mL-1 detectieantilichaam (anti-p53 antilichaam (-1) voorzien van Alexa 488) 4% PBSA en opnieuw aansluit buizen. Blokkerende oplossing in de buizen vervangen door verstrekking 25 µL detectie antilichaam oplossing.
- Spoel de "olie" slang met minerale olie tot alle leidingen en het mondstuk wordt gevuld met olie. De 1 mL spuit met minerale olie bijvullen en opnieuw aansluit buis. Beveilig de vergadering van de slang en mondstuk aan een XYZ manipulator.
-
Bereiden van microinjector en micromanipulator
Let op: Onderstaande stappen maken specifieke verwijzing naar de componenten van de microinjector en micromanipulator apparatuur opgegeven in de tabel van materialen, maar in het algemeen gelden voor een dergelijk apparaat.- Monteer de microinjector door het aanbrengen van de drukslang en de capillaire houder.
- Langzaam draaien de zuiger wijzerplaat totdat de minerale olie volledig de lijn vult.
- Monteer de capillaire houder in de vertaling hoofd mount.
- Fix het capillair in de capillaire houder met het hoofd van de grip.
- Pipetteer een oplossing van 4% PBSA in één van de putten van de isolator.
- Vertalen met behulp van de micromanipulator en de tip van het capillair onderdompelen in de oplossing.
- Langzaam vullen het capillair met 4% PBSA en verlof te blokkeren gedurende 10 minuten.
- Verwijder de microcapillary en de vertaling-module draaibaar, zodat de vergadering duidelijk van de chip is.
2. vorm van de adresseerbare druppels en belasting met afzonderlijke cellen
- Formulier adresseerbare druppels
- Beveilig de chip in het werkgebied van de Microscoop.
Opmerking: De Microscoop is een omgekeerde fluorescentie geautomatiseerde Microscoop staat enkel molecuul TIRF met uitgerust een een gecodeerde XY-fase en een elektron te vermenigvuldigen met de camera van de charge - coupled apparaat (EM-CCD). - De Microscoop fase coördinaten van elke plek in de array gebruikmakend van de controle-software voor geautomatiseerde Microscoop opnemen.
- De XYZ-manipulator aangezet in het stadium van de Microscoop. Plaats het mondstuk onder een hoek van 50-60°. Zorg ervoor dat de verstuiver voldoende lengte en ruimen van bouwterreinen tot de chip. Stel de 'waterig' en 'olie' syringe pompen om afzien van 10 nL op 100 µL/min en 5 µL op 100 µL/min, respectievelijk.
Opmerking: Tijdens de voorbereiding, de waterige oplossing aan het hoofd van de verstuiver kan drogen. - Afzien waterige oplossing totdat een kraal van vloeistof zichtbaar aan het hoofd van de verstuiver is. Schar met een doekje stof vrij om het te verwijderen.
Opmerking: Afhankelijk van het aantal onderzochte voorwaarden, behouden een aantal putten om te dienen als reservoirs voor cellen. Voor een enkele cel/lijntype volstaat een enkele reservoir. - Met behulp van de software van de controle van de geautomatiseerde Microscoop, zet de Microscoop fase coördinaten naar de plek van een antilichaam in de matrix en de focus op het dekglaasje aan oppervlak.
- Voorzichtig niet te verstoren, de plek, met behulp van de manipulator XYZ, uitlijnen van de glazen capillaire tip van de concentrische verstuiver aan de kant van de antilichaam-spot en afzien van 10 nL van waterige oplossing. Zonder te bewegen de stadia, afzien 5 µL van olie Cap de waterige oplossing. Langzaam verhogen van de verstuiver duidelijk van de druppel en verplaatsen naar het volgende goed.
- Herhaal stap 2.1.6 voor alle antilichaam spots in de matrix.
- Na 30 min, het imago van alle spots in de array met behulp van de software van de controle van de geautomatiseerde Microscoop om te bepalen van de achtergrond van afzonderlijke moleculen gebonden aan elke antilichaam ter plaatse vóór het laden van de cellen.
- Beveilig de chip in het werkgebied van de Microscoop.
- Laden van de adresseerbare druppels met cellen
- De cel cultuur kolven verwijderen uit de incubator en losmaken van cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing.
Opmerking: In deze studie, de BE menselijke Colón carcinoom-cellijn werd gebruikt en gekweekt met behulp van de Dulbecco bewerkt Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v/v) foetale runderserum (FBS) in een incubator CO2 . - Indien nodig, vlek fluorescently cellen.
- Resuspendeer de cellen in een oplossing van 0,125 μg/mL detectieantilichaam (anti-p53 antilichaam (-1) voorzien van Alexa 488) in 10% FBS in L-15 media. Om ervoor te zorgen de schorsing van een enkele cel, de cell oplossing wordt gefiltreerd door een 40 µm toonhoogte cel zeef.
- Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en verdunnen of concentraat de oplossing van de cel tot een concentratie van 25-400 × 103 cellen/mL. Dit zorgt ervoor dat cellen sediment met voldoende ruimte om comfortabel het manipuleren van de microcapillary.
- Afzonderlijke cellen in de adresseerbare druppels uit het reservoir van de cel met behulp van de micromanipulator en de microcapillary laden.
Opmerking: Niet-aanhanger cellen kunnen worden geladen in bulk in de micropipet en één voor één in de adresseerbare druppels afgeleverd. Ondanks blokkerende oppervlaktebehandeling, zal aanhangend cellijnen dikwijls niet-specifiek vasthouden aan de binnenwand van het glas microcapillary worden verloren. - Met behulp van een 10 × doelstelling observeren, gebruiken de microinjector om een eencellige gecombineerd in de microcapillary van het reservoir van de cel.
- Slaan de micromanipulator fase coördinaten als met behulp van een elektronische manipulator stadium of handmatig opmerking de z-positie.
- De micropipet worden ingetrokken door te vertalen naar boven om te wissen de hoogte 1 mm van de chip. Handmatig uitvoeren dit met een joystick of automatisch met behulp van de 'Eject' functie van een elektronische manipulator stadium.
- Set die de fase coördineert aan dat een adresseerbare druppel de met behulp van software van de controle van de Microscoop geautomatiseerde. 'Injecteren' de micropipet door het terug te zenden naar de opgeslagen (of genoteerd) z-positie. Dit handmatig uitvoeren met een joystick of automatisch als met behulp van een elektronische manipulator stadium.
Opmerking: De microcapillary zal doorboren de overkoepelende olie en in het waterige gedeelte van de adresseerbare druppel bevindt. - Afzien van de cel in de adresseerbare druppel met behulp van de microinjector. Het volume van een 10 nL adresseerbare droplet zal met minder dan 1% toenemen.
- 2.2.5-2.2.9 voor de resterende adresseerbare druppels verlaten sommige gratis voor de experimentele controle waar adresseerbare druppels bevatten geen een cel herhalen
Opmerking: Een eenvoudiger alternatief voor het laden van afzonderlijke cellen in het adresseerbare druppels met behulp van een microcapillary en micromanipulator is ter vervanging van de oplossing in stap 1.2.8 met een oplossing van detectieantilichaam in 4% PBSA met cellen met een concentratie over de volgorde van 10 5 cellen/mL, overeenkomend met 1 cel/10 nL. Eencellige bezetting zullen Poissonian en de concentratie van de cel moet worden geoptimaliseerd.
- De cel cultuur kolven verwijderen uit de incubator en losmaken van cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing.
- Lyse cellen en afbeelding matrix
- Afbeelding cellen in druppeltjes met helderveld microscopie, met inbegrip van eventuele fluorescentie imaging.
Opmerking: Imaging duurt ongeveer 3 min om het imago van ~ 100 druppels met behulp van een geautomatiseerde Microscoop. Imaging uitvoeren met een 60 NB = 1,49 olie-immersie doelstelling. Geen filters zijn vereist voor helderveld imaging overwegende dat standaard filter sets worden gebruikt voor fluorescentie imaging. - Het imago van alle spots in de array met behulp van één molecuul TIRF microscopie.
Opmerking: Instellingen zijn gebruikt zoals in stap 2.3.1 met een gespecialiseerde TIRF filter set. Deze beelden worden vervolgens geanalyseerd in sectie 3 om de achtergrond van afzonderlijke moleculen gebonden aan elke vlek antilichaam voorafgaand aan cellysis. Enkel molecuul geschikt zijn met behulp van totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie duurt ongeveer 5 min om het imago van ~ 100 plekken. - Focus op een cel in een adresseerbare druppel. Volledige optische lysis bereiken door te focussen op een enkele 6 ns laser pulse (golflengte 1064 nm, pulse energieën 14.1 ± 0,3 µJ per puls) dicht bij de locatie van de cel.
Opmerking: De laser pols stelt een groeiende cavitatie-zeepbel die schaar de cel en bevrijdt van cellulaire bestanddelen in het volume van de druppel. 4 , 31 de mechanische processen als gevolg van lysis van de laser-geïnduceerde niet storen de interface van de olie-water bij lage pulse energieën. Lysis van de optische duurt meestal ongeveer 20-30 min 100 cellen lyse. Zoals besproken in de sectie discussie, zijn er een aantal alternatieve methoden lyse van afzonderlijke cellen als de lysis van de optische setup niet mogelijk is. - Herhaal voor alle cel-bevattende adresseerbare druppels verlaten 5 gratis voor de experimentele controle waar adresseerbare druppels een un-lysed cellen bevatten.
- Opmerking de tijd waartegen elke cel is lysed.
Opmerking: Deze tijden zal worden gebruikt om individuele bindende curven voor elke plek in stap 3.1.9 lossen. Vaak volstaat het om op te merken van de momenten waarop de eerste en de laatste cel zijn lysed en schatten de rest veronderstelling dat een adequaat consistent tijd tussen lysis van de gebeurtenissen. - Verwerven van één molecuul beelden met behulp van TIRF microscopie van alle spots elke 10 min voor de eerste 30 min vervolgens elke 20 min. voor een verdere 60 min. Als alleen geïnteresseerd in de hoeveelheid eiwit gebonden aan evenwicht, het imago van alle spots na de chip gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Opmerking: De tijd om te bereiken evenwicht zal afhangen van het volume van de druppel en de verwantschappen van de antilichamen die gebruikt in de test. TIRF microscopie wordt uitgevoerd met behulp van een laser excitatie bron op = 488 nm en 1,5 mW vermogen gemeten op de opening van de achterkant met een optisch Energiemeter. Enkel molecuul afbeeldingen zijn verworven door het instellen van de overname-instellingen op de EM-CCD-camera aan 900 ms Acquisitietijd, 16-bits digitalisering 1 MHz uitlezing tempo en een EM krijgen factor 10. De isolator kan hergebruikt worden door het zorgvuldig verwijderen van het dekglaasje aan.
- Afbeelding cellen in druppeltjes met helderveld microscopie, met inbegrip van eventuele fluorescentie imaging.
3. de gegevensanalyse
-
Enkel molecuul tellen (niet-overbelast/digitale regeling)
- Fiji (of Matlab), voor elke niet-overbelast antilichaam plek gebruikt, laad de afbeelding vóór lysis (achtergrond, BKD) verworven.
Opmerking: De bewerkingen in de volgende stappen worden rechtlijnig uitgevoerd met behulp van software van de analyse van de afbeelding van Fiji. Een handleiding kan worden gevonden op de volgende link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - Selecteer de afbeelding van de BKD in Fiji. Onder het menu "Afbeelding" Selecteer "Duplicate" te dubbele BKD. Selecteer de dubbele afbeelding en onder de "proces > Filters", selecteer "Gaussian Blur" en geef een 50 pixel straal.
- De BKD-afbeelding afvlakken zodat er een effectieve uniforme intensiteit verdeling van de lichtbron van excitatie door het verdelen van de BKD-beeld door het beeld wazig BKD, productie van BKD_FLAT.
- Onder "Proces" Selecteer "afbeelding calculator...", de operatie "Kloof", geven de beelden vereist, en selecteren van de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
- Door 1 af te trekken van elke pixel in de afbeelding ("proces > Math", selecteer "Aftrekken..." en geef een waarde van 1). De intensiteit van de gemiddelde pixel moet 0 zijn.
Opmerking: Field afvlakken en afgevlakte achtergrondafbeeldingen gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd, omdat de som van alle pixels 0 moet zijn en eventuele resterende offset meer rechtlijnig kan worden gecompenseerd. - Selecteer een 50 × 50 pixel pixelgebied in een van de 4 hoeken van het beeld van de BKD_FLAT. Het meten van de standaarddeviatie van de pixel-intensiteit (σ) door "Analyseren" en "Maatregel" te selecteren.
Opmerking: De samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten. Hiermee bepaalt u de achtergrond van de off-plek waar er is onwaarschijnlijk dat een hoge dichtheid van afzonderlijke moleculen. Het gebied te meten kan handmatig worden geselecteerd met behulp van het standaard menu selectie extra of door de macro code "makeRectangle (x, y, breedte, hoogte)"; Hiermee maakt u een rechthoekige selectie, waarbij de x- en y argumenten zijn de coördinaten (in pixels) van de linkerbovenhoek. - De beeld-drempel ingesteld op 3σ en maak een binaire SM_MASK.
- Onder "Afbeelding > aanpassen", selecteer "Drempel..." en de lagere drempel ingesteld op 3σ.
Opmerking: Pixels waarvan de waarde zijn onder de drempel zijn ingesteld op nul en pixels overschrijding van de drempel is ingesteld op 1. De drempel zal bepalen het vertrouwen waarmee thresholded pixels deel uitmaken van een enkel molecuul.
- Onder "Afbeelding > aanpassen", selecteer "Drempel..." en de lagere drempel ingesteld op 3σ.
- In de gesegmenteerde afbeelding SM_MASK, set intensiteit de pixelwaarden op nul voor alle objecten die niet over een grootte van 4-9 pixel2 en een cirkelvormigheid van 0,5 beschikken - 1 door te selecteren "Analyseren" gevolgd door "Analyseren Particles" en de grootte en de cirkelvormigheid op te geven.
Opmerking: De pixelgrootte moet worden geoptimaliseerd voor andere fluorophores en Microscoop set ups. Vanwege het type camera ruis enkele pixels boven deze drempel kunnen worden en niet ondanks de niet afzonderlijke moleculen worden weggegooid. De pixel groottecriterium worden correct dergelijke pixels genegeerd. Afzonderlijke moleculen zijn in het algemeen circulaire vorm. Overwegende dat de waarde 0 naderen geeft aan een steeds langwerpige vorm, duidt een waarde van de cirkelvormigheid van 1 een perfecte cirkel. De overige objecten zijn afzonderlijke moleculen en kunnen worden geteld. Een masker kan worden ingesteld op de afbakening van het gebied van de spot te plaatse discrimineren en off-plek telt per frame. Dit is makkelijker voor frames die zijn verworven in latere tijden wanneer er een voldoende signaal plaatse die vervolgens kan worden toegepast naar eerdere frames. - Voor dezelfde niet-overbelast antilichaam plek, laden en herhaal stappen 3.1.1 - 3.1.7 voor alle afbeeldingsframes opgenomen als een reeks van time-resolved lysis van de post verworven. Gebruik de lysis tijden genoteerd in stap 2.3.5. te corrigeren bindende curven.
- Fiji (of Matlab), voor elke niet-overbelast antilichaam plek gebruikt, laad de afbeelding vóór lysis (achtergrond, BKD) verworven.
-
Enkel molecuul tellen (verstopt/analoge regeling)
- Herhaal stap 3.1.1 - 3.1.8 ter berekening van de gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul, voordat u verdergaat.
- Vermenigvuldig de beelden BKD_FLAT en SM_MASK voor de productie van een afbeelding waarbij niet-nulzijnde pixelwaarden geassocieerd met afzonderlijke moleculen worden.
- Om uit te voeren, onder het menu "Proces", selecteer "Afbeelding calculator...", geef de bewerking "Vermenigvuldigen" en de beelden vereist en selecteer de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
- Som van alle intensiteitswaarden van de pixel door het selecteren van "Analyseren" en vervolgens "Maatregel"; de samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten. Delen door het aantal getelde afzonderlijke moleculen per stap 3.1.8 voor het berekenen van de gemiddelde intensiteit per één molecuul.
- Voor een overbelaste antilichaam plek, laden de afbeelding verworven na lysis en plat met een onscherpe achtergrond beeld per stap 3.1.2 en 3.1.3.
- Elke pixel in de afgevlakte afbeelding aftrekken door 1 ("proces > Math", selecteer "Aftrekken..." en geef een waarde van 1)
- Selecteer een 50 × 50 pixel pixelgebied in een van de 4 hoeken van het beeld en de standaarddeviatie van de pixel-intensiteit (σ) meten. Zie stap 3.1.5 voor details.
- Een binaire Afbeeldingsmasker maken door het instellen van de drempel van de afbeelding op 3σ en intensiteit pixelwaarden ingesteld op nul van objecten met een grootte van minder dan 4 pixel2. Om uit te voeren, onder het menu "Analyseren", selecteer "Analyseren Particles" en geef de grootte en de cirkelvormigheid.
- De afgevlakte overbelaste antilichaam plek afbeelding te vermenigvuldigen met de binaire Afbeeldingsmasker.
- Om uit te voeren, onder het menu "Proces", selecteer "Afbeelding calculator...", geef de bewerking "Vermenigvuldigen" en de beelden vereist en selecteer de vakken "Create new window" en de "32-bits (float) resultaat."
- Som van de resterende intensiteiten van de pixel door het selecteren van "Analyseren" gevolgd door "Maatregel"; de samenvatting van de statistieken van de selectie zal worden gepresenteerd in een venster met resultaten.
- De som van pixel intensiteiten door de intensiteit van de gemiddelde enkel molecuul voor het berekenen van het aantal afzonderlijke moleculen gebonden aan de drukke plek te verdelen.
-
De kalibratiekromme voor absolute kwantificering
- Herhaal de punten 1 en 2 vormen 10 nL adresseerbare druppeltjes met de detectieantilichaam in 4% PBSA oplossing verrijkt met een bekende concentratie recombinant eiwit.
- Uitvoeren van een reeks van de concentratie van 102- 107 recombinante eiwitten per druppel door het variëren van de bekende concentratie van recombinante eiwitten aan de oplossing toegevoegd. Het wordt aanbevolen te werken in termen van aantal eiwitten per druppel kalibreren eencellige gegevens eenvoudig maken.
- Gebruik de concentratie reeks gegevens in stap 3.3.2 kalibreren van een enkel molecuul telt per plek om eiwit overvloed per druppel en door uitbreiding eiwit overvloed per eencellige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De absolute basale eiwit exemplaaraantal van p53 werd bepaald met de resolutie van de eencellige in een menselijke Colón kanker cellijn, BE cellen. We laten zien hoe p53 expressie kan variëren in de verschillende ordes van grootte en tonen een zwak positieve correlatie tussen de cel grootte en eiwit exemplaaraantal binnen de rust BE-celpopulatie.
Adresseerbaar Droplet Microarrays worden gevormd wanneer waterige druppels zijn afgeleverd op antilichaam plek locaties en met olie afgetopt. Hier, ondersteunen de druppels een gevoelige p53 eiwit bepaling. Coverslips zijn gekleed met capture antilichaam vlekken met behulp van een contact microarrayer en een pincode. Het anti-p53 vangen antilichaam is ontleend aan een commerciële ELISA testkit. De afdrukvoorwaarden waren zodanig dat capture plekken ongeveer 100 µm in diameter met een capaciteit van de maximale vangst van 6.2 ± 0,5 x 105 eiwitten per plek waren. 32
Het gebruik van een isolator gebonden aan het dekglaasje aan maakt een hogere dichtheid van druppels worden gevormd omdat het beperkt de verspreiding van olie naar nabijgelegen antilichaam vangen plekken. In elk putje van de isolator worden druppels gevormd door de verstrekking van een waterige oplossing, die vervolgens wordt afgetopt met olie om te voorkomen dat verdamping (figuur 1A). Een minimale hoeveelheid olie achterwege worden gelaten om het kapje van de druppel; het is echter handig af te zien van een bedrag welke vullingen elke isolator nou precies zodanig dat het oppervlak van de olie is vlak voor imaging. Isolatoren zijn commercieel gekapt of gemaakt door laser snijden-acrylplaten. Siliconen isolatoren zijn beschikbaar voorgesneden putten in een matrix van 4 x 6 (n = 24) maar kan worden aangepast aan een array van 4 x 11 (n = 44) met behulp van een biopsie of multi gat lederen punch. De laser gesneden isolator in figuur 1B bevat een matrix van 100 zeshoekige putten, elk met een maximale diameter van 2.89 mm, een scheiding van de centrum-naar-midden van 3.9 mm en een hoogte van 0,5 mm. De druppels kunnen worden opgeslagen en voor langere tijd (maximaal 3 maanden waargenomen) stabiel blijven.
Druppels zijn gemaakt, handmatig met behulp van een apparaat huis-gebouwde, wat zich vertaalt een concentrische buis mondstuk (Figuur 1 c), die is aangesloten op twee injectiespuit pompen (figuur 1A). Het mondstuk van de concentrische buis bestaat uit een gesmolten siliciumdioxide capillaire, die de waterfase uitdeelt, gevoed door een korte lengte van de buis PEEK, die de olie-fase uitdeelt. Met behulp van een Microscoop, de verstuiver is afgestemd op de plek van een antilichaam en de pompen zou eerst het afzien van de waterige oplossing onmiddellijk gevolgd door de olie (figuur 1E, stappen 1-4). Zodra alle druppels in de ADM worden gevormd, worden een microinjector en micromanipulator (Zie de tabel van materialen) gebruikt voor het laden van elke druppel met een eencellige (Figuur 1 d). De micropipet zou vangen een cel uit een reservoir van cellen, afgeleverd in een van de putjes op de chip, vertaald worden naar een droplet goed en dan penetreren het GLB olie te leveren van de cel in de waterige druppel (Figuur 1 d, stap 5-8).
Alle spots binnen de druppels zijn beeld voorafgaand aan cellysis en worden gebruikt voor het bepalen van de mate van niet-specifieke binding aan de vlekken (figuur 2A). Afzonderlijke cellen zijn volledig lysed (met inbegrip van nucleus) met behulp van optische methoden. 31 lysis van de optische berust op de shearing kracht voor een groeiende laser pulse-geïnduceerde cavitatie bubble te verstoren van de cellen. Zorg moet worden gemaakt dat de olie-water-interface niet gestoord worden door deze processen door beperking van de puls-energieën en storten van cellen uit de buurt van de olie/water-interface. Zodra de cellen zijn lysed, de matrix image is gemaakt door TIRF microscopie met behulp van een geautomatiseerde Microscoop; frames zijn verworven om 10 min voor 30 min en vervolgens elke 20 min. voor een verdere 60 min. De voorwaarden, zoals de affiniteit van het antilichaam, eiwit diffusie en druppel volume, zijn zodanig dat bindende evenwicht is bereikt binnen de overname 90 min. Een typische eencellige pulldown is afgebeeld in figuur 2A.
Het proces van de beeldanalyse bepalen dat de één molecule telt is schematisch afgebeeld in figuur 2B. Beelden van de vlekken worden ofwel beschouwd als niet-overbelast, waar doel eiwitconcentratie is zodanig dat afzonderlijke moleculen zijn goed gescheiden en gemakkelijk onderscheiden, of verstopt, waar de eiwitconcentratie doel is hoger en één molecuul beelden overlapping en zijn niet langer individueel te onderscheiden. Aangezien het TIRF excitatie profiel ongelijk is, is het van cruciaal belang dat alle verworven beelden flat-veld gecorrigeerd worden. Gaussiaans vervagen wordt toegepast op een niet-overbelast frame, die fungeert als een vloeiend filter verwijderen detail en ruis en een afbeelding met het gemiddelde Profiel van de TIRF excitatie Profiel produceert. Deze verwerkte schijfkopie kan worden gebruikt om de oorspronkelijke afbeelding 'plat'. Voor niet-overbelast beelden, waar, zelfs op evenwicht, zijn er een paar afzonderlijke moleculen, kan een frame worden verwerkt om op te lossen zelf. Deze benadering is niet toepasbaar op een drukke plek, waar afzonderlijke moleculen dichtbevolkte de plek bezetten en vereist een achtergrondafbeelding aan te schaffen voor het afvlakken. Afgevlakte frames zijn dan thresholded voor pixels met intensiteiten ten minste 3 keer de standaarddeviatie achtergrond plus haar gemiddelde waarde. Afzonderlijke moleculen worden vervolgens automatisch gedetecteerd door het identificeren van 4-9 geclusterde pixels met cirkelvormigheid hoger dan 0,5 met behulp van de analysefuncties van deeltje van Fiji. Van de resultaten, kan de gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul worden berekend. Het wordt gebruikt om te bepalen van het aantal afzonderlijke moleculen op een drukke plek door het verdelen van de antilichaam plek totale intensiteit door de bekende gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul. Deze stappen kunnen worden geautomatiseerd met behulp van Scripteditor van Fiji.
Een concentratie-serie is uitgevoerd om te bepalen van de graaf van één molecuul bij evenwicht in de druppels met een bekende concentratie van recombinante p53 proteïne (figuur 3A). De omstandigheden zijn zodanig dat de vangst antilichaam plekken een fractie van het totale target-eiwit, ongeveer 1% in de regio van lineariteit vangen (voor 10-5-108 eiwitten per druppel R2 = 0.99). Het niveau van niet-specifieke binding in de druppels is 187 ± 60 moleculen. De resultaten van de eencellige pulldowns kunnen dan worden omgezet om distributies van absolute eiwit exemplaaraantal per cel. Figuur 3B toont de verdeling van de absolute p53 eiwituitdrukking in één BE cellen met behulp van ADMs. P53 eiwituitdrukking in de BE-cellen, die worden aangenomen dat kan genetisch identiek of vergelijkbaar, is een stochastisch proces. De verdeling is Gamma-achtige - asymmetrische en unimodale met een lange staart. Bijgevolg het gemiddelde (1.82 × 106 eiwitten) kan het overschatten van de modale eiwit overvloed (bin 0 - 5.0 × 105 eiwitten), en de standaarddeviatie (1,88 × 106 eiwitten) niet volledig vast te leggen aan de kenmerken van de verdeling. Deze verdeling is een voorbeeld van het belang van eencellige metingen te vangen de heterogeniteit van eiwit expressie in de cel bevolking, die anders verloren zou gaan als gemiddeld met bulk metingen. Aanvullende parameters voor elke cel kunnen worden gemeten. Hier, wordt het volume van de cel geschat door het meten van de diameter van elke cel voorafgaand aan cellysis in de druppel en ervan uitgaande dat de cel is ongeveer bolvormig. Figuur 3 c geeft een vergelijking van p53 absolute eiwit exemplaaraantal in één BE cellen als een functie van de celgrootte van de. Er is een tendens voor grotere cellen hebben een hogere totale p53 exemplaaraantal. Interessant, is het mogelijk uit de distributie dat er coördinatie tussen p53 expressie en celgrootte is omdat er lijkt een minimale p53 exemplaaraantal per cel; de mechanismen waarmee dit ontstaat moet echter verder onderzocht worden.
Figuur 1: adresseerbare Droplet Microarray apparatuur en Chip. (een) druppels zijn afgezien handmatig met behulp van een 3-as manipulator te vertalen van een concentrische buis mondstuk. De waterige droplet wordt aangeboden op specifieke locaties in een microarray antilichaam gevolgd door de aftopping van de olie. (b) de isolator maakt een hogere dichtheid van adresseerbare druppels op de drager vervagen door beperking van de verspreiding van de olie. Isolatoren kunnen worden geproduceerd door laser snijden 0.5 mm-acrylplaten. Op de steun van de visualisatie van de druppels, blauwe voedsel kleuren kleurstof wordt gestort met behulp van het apparaat in een). Schaal bar 10 mm, verzonken schaal bar 1 mm. (c) de concentrische buizen-mondstuk adresseerbare druppels worden gevormd kunt, gemonteerd zoals in stap 1.2 van het protocol. (d) een microinjector en micromanipulator worden gebruikt om de cellen isoleren in afzonderlijke adresseerbare droplets, bereid zoals in stap 1.3 van het protocol. (e) de grote stappen in het proces van maken en laden adresseerbare druppels wordt weergegeven. Een antilichaam plek is gelokaliseerd met behulp van een gecodeerde vertaling stadium (1) waar het puntje van de capillaire buis wordt uitgelijnd (2) en de waterige (3) dan olie (4) onderdelen worden aangeboden. Afzonderlijke cellen kunnen worden geladen met behulp van een glas microcapillary (5-8) die herhaaldelijk kan pakken de waterige druppel (7) en een cel (8) storten. Schaal bars 100 µm. De rode pijl in (5) en (8) wijst de geïsoleerde eencellige en de inzet van (8) toont de geïsoleerde eencellige bij hoge vergroting (schaal bar 10 µm). Gedeelten van dit cijfer is gewijzigd van referentie12, gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Image analyse stappen. Elke plek in de matrix is periodiek beeld door TIRF microscopie tot evenwicht (tEq) (90 min voor p53 assay) is bereikt. De tijd van evenwicht, is afhankelijk van t in oplossing, evenals de verwantschappen van de antilichamen paar voor de gerichte proteïne. a) enkel molecuul TIRF microscopie voorbeeldafbeeldingen van de achtergrond, alsmede een voorbeeld eencellige pulldown (schaal bars 20 μm). Verzonken vlak beeld toont een vergroot gedeelte van de achtergrondafbeelding met sommige afzonderlijke moleculen gemarkeerd met rode pijlen (schaal bar 5 μm). b) schets van de beeldanalyse die zijn beschreven in stap 3 van het protocol. Kortom, er zijn twee brede regimes waar de vlekken kunnen worden beschouwd als niet-overbelast, enkele moleculen zijn schaars, en overbelaste, waar de dichtheid van afzonderlijke moleculen is zodanig dat er aanzienlijke overlap en kan niet langer worden afzonderlijk identificeerbare. Een cruciale stap in de beeldanalyse is veld afvlakken om het effect van het profiel van de niet-uniforme intensiteit van de excitatie-laser verwijdert. In het digitale tellen regime, worden afzonderlijke moleculen rechtstreeks, geïdentificeerd op basis van hun intensiteit en vorm parameters. In de analoge regeling tellen, wordt het aantal afzonderlijke moleculen berekend door het meten van de totale plek intensiteit op evenwicht en te delen door de gemiddelde intensiteit van een enkel molecuul, dat is bekend van het digitale tellen regime. Stappen kunnen rechtlijnig in ImageJ om de gegevens te analyseren worden geautomatiseerd. De onderste deelvenster reeks beelden toont accumulatie van doel eiwit op de antilichaam-opname ter plaatse; Aanvankelijk, vlekken zijn niet verstopt (t-1) Overwegende dat als doel eiwit zich op de plek van het antilichaam ophoopt, de afzonderlijke moleculen kunnen steeds verstopt (tn) tot evenwicht is bereikt (teq). Opmerking dat een plek niet-overbelast blijft of wordt overbelast is afhankelijk van een aantal factoren, met name de overvloed van doel eiwitten in het volume van de analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Single celgegevens. Absolute kwantificering wordt bereikt met behulp van een ijkcurve. (een) één molecuul graven zijn gemaakt met behulp van bekende concentraties van recombinante eiwitten. Dit is een kalibratiekromme en wordt gebruikt voor het converteren van één molecuul geteld op elke plek om aantal doel eiwitten in het volume van de analyse en vandaar enkele cel exemplaaraantal. De horizontale rode onderbroken lijn geeft het niveau van niet-specifieke binding van 187 ± 60 moleculen. De foutbalken worden één standaarddeviatie van het gemiddelde van 3 experimentele loopt. De onderbroken lijn geeft 100% detectie van eiwit. (b) een verdeling van de eencellige basale p53 eiwituitdrukking in BE kankercellen wordt weergegeven waarin u een gamma-achtige lange-tailed verdeling waar p53 eiwituitdrukking in sommige cellen aanzienlijk hoger is dan de modale waarde is. (c) Scatter plot van p53 eiwit exemplaaraantal per cel als functie van cel volume tonen hoe eiwit expressie varieert in functie van de celgrootte van de. Gedeelten van dit cijfer werden aangepast van 12 en gereproduceerd met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adresseerbaar Droplet Microarrays is een gevoelige en uitbreidbare methode voor het kwantitatief bepalen de absolute exemplaaraantal van eiwit in een enkele cel.
Beperking van het niveau van niet-specifieke binding is (NSB) kritisch in het protocol bij het bereiken van een limiet van detectie mogelijk zo laag. Eiwitten en andere biochemische soorten kan niet-specifiek binden aan een aantal interfaces aanwezig binnen de druppels — het dekglaasje aan oppervlak, het antilichaam ter plaatse en de olie/water-interface. Eiwitten kunnen verloren gaan door het partitioneren in de interface of de olie zelf. We hebben aangetoond dat 4% BSA aanwezig in de waterige druppel NSB van eiwitten met de antilichamen die in het protocol vermelde te beperken. Alternatieve eiwitten doelen en de antilichamen gebruikt om hen te ontdekken is mogelijk blokkeren alternatieven, dergelijke niet-ionogene detergentia of compatibel oppervlakteactieve stoffen. Gefluoreerde oliën kunnen ook worden getest voor hun geschiktheid in de overkoepelende olie bijeenkomen. In dergelijke gevallen moeten de aanvullende overwegingen zoals de kritische micel-concentratie en de dichtheid van de overkoepelende olie worden gemaakt.
De ongewassen afdrukken buffer, die op elke plek locatie blijft na arraying aids in uitlijning. Bij de neerlegging in eerste instantie de druppels, moet zorg men zich niet krassen of beschadiging van de antilichaam-plek door het uiteinde van de verstuiver van concentrische buizen. Bij het ontwikkelen van de methode verder, kan een fluorescente kleurstof worden doped in het antilichaam afdrukken buffer die naast het vangen antilichaam wordt geblokkeerd. Hierdoor zouden voor wassen en het blokkeren van stappen worden uitgevoerd voordat de druppel arraying; echter, een dergelijke stap zou noodzakelijkerwijs niet vereist als met behulp van geautomatiseerde methoden voor druppel arraying die zoals inkjet drukmethoden.
Het oppervlak van de commercieel geproduceerde coverslips die druppels worden gevormd is bekleed met een hydrofiel polymeer en de waterige druppels geproduceerd op hen met een volume van 10 nL hebben een diameter van 751 ± 42 mm. Er is een limiet aan hoeveel de gedeponeerde druppel het oppervlak moet nat of spreads te wijten aan het gewicht van de overkoepelende olie aangezien hieronder een minimumdikte er is verhoogde optische spreiding van de TIRF excitatie laser. Het scatter verhoogt het gemiddelde niveau van de achtergrond en kan overstemmen signaal bij het opsporen van afzonderlijke moleculen. De antilichaam-plek moet ook worden gevestigd uit de buurt van de rand van de druppel omdat het laserlicht excitatie kan gedeeltelijk of volledig staking een gebied buiten de waterige druppel. De kritische hoek voorwaarde zal niet langer worden voldaan voor de glas-olie-interface in tegenstelling tot de glas-water-interface opvallend licht.
Als u wilt bepalen kwantitatief de overvloed aan eiwit het aantal afzonderlijke moleculen gebonden aan een plek moeten worden bepaald door beeldanalyse. Bepalen van de totale hoeveelheid eiwit in de oplossing van het tellen van enkel molecuul een kalibratiekromme is vereist en de techniek moet absoluut kwantitatieve in staat stelt.
U wilt minimaliseren photobleaching, vlekken zijn niet beeld voortdurend en de TIRF excitatie laser bron macht wordt geminimaliseerd. Het protocol zoals gepresenteerd is gebruikt met succes voor photostable fluorophores zoals de Alexa Fluor kleurstoffen. Alternatieve fluorophores kan worden gebruikt maar photobleaching moet worden beoordeeld en het imaging protocol aangepast indien nodig. Het totale aantal afzonderlijke moleculen per frame kan worden afgeplot tegen de tijd om te reproduceren de bindende curve, hoewel dit zeker niet nodig is dat als bindende kinetiek niet gewilde en imaging, volstaat een enkel frame bij evenwicht.
Hoewel er een verplichting van twee hoge affiniteit antilichamen is, resulteert dit in een zeer gevoelige en zeer specifiek assay, cruciaal voor metingen op het niveau van één cel. De antilichamen van de p53 gebruikt in dit protocol zijn goed geoptimaliseerd voor het opsporen van gratis p53 van afzonderlijke cellen. Het doel-eiwit wordt bepaald door de keuze van antilichamen en kan op een aantal manieren worden gewijzigd: 1, zowel de afvang en detectie antilichamen kunnen worden vervangen om het binden van alternatieve doelstellingen; 2, de detectieantilichaam kan worden vervangen om de sonde van eiwit-eiwitinteractie of posttranslationele modificaties aan het eiwit gebonden aan het antilichaam vastleggen, bijvoorbeeld bepalen de fosforylatie status van gevangengenomen p53; 3, multiplexed testen kunnen worden bereikt door het afdrukken van meerdere vangen antilichaam plekken in de nabijheid — afdrukken van een 3 × 3 plek matrix is mogelijk binnen 10nL druppels. Natuurlijk, voor een wijziging van doel eiwit een aantal antilichaam schermen, moeten besturingselementen en optimalisaties plaatsvinden.
Verschillende methoden voor het lysing van afzonderlijke cellen zijn gemeld. 33 optische lysis is een chemicaliën-vrije benadering snel lyse van afzonderlijke cellen zonder wijziging van de inhoud van cellen en behoud van de integriteit van eiwitten en hun complexen. Chemische lysis met behulp van detergentia vormt een probleem voor de integriteit van de druppels bij het gebruik van minerale olie en kan interfereren met interacties tussen moleculen. 34 voor testen waar chemische lysis compatible het echter aantrekkelijk aanpak omdat het niet afhankelijk van apparatuur zoals lasers of micropatterned elektroden. 35
De druppels Toon vergelijkbare prestaties met alternatieve eencellige methoden. In de huidige generatie van druppeltjes met de voorgestelde p53-antilichamen, is het niveau van de NSB 187 ± 60 moleculen per plek. De graven van één molecuul vertonen sterke lineariteit (R2 = 0.99) in de regio verspreid over 105 –108 recombinante p53 eiwitten per druppel. Dit suggereert dat terwijl lagere niveaus van eiwitten in cellen worden gedetecteerd, er een limiet van kwantificatie van 105 p53 eiwitten is; Dit komt overeen met een enkel molecuul rekenen op de plekken van 901 ± 83. Dit is overwegend beperkt door de omvang van de druppels en adsorptie aan de interface. De prestaties van de p53-bepaling is zodanig dat wanneer uitgevoerd in een 10 nL volume enige 1.1 ± 0,2% van het totale target-eiwit wordt vastgelegd van de oplossing; Dit loopt op tot 85 ± 9% wanneer de vermindering van het volume van de analyse tot 0,2 nL. 36 door vermindering van het volume van de druppels naar beneden 1nL en het verminderen van adsorptie, er is potentieel met behulp van de opgegeven antilichamen tegen p53 in de verbetering van de limiet van detectie zodat < 50 eiwitten per cel. Daarom hebben adresseerbare druppels het potentieel om te worden gebruikt voor het meten van zeer lage overvloed eiwitten uit afzonderlijke cellen.
De serverprocessor van de druppels die worden geboden door het GLB gemakkelijk penetrable olie maakt het mogelijk het volume analyse cel opeenvolgend worden aangevochten. Het gebruik van een micropipet kan de injectie van een gewenste aantal cellen in elke druppel in een plug voor 10-20 pL, die niet aanzienlijk verhoogt het volume. Voor de chip getoond in figuur 1B met 100 wells, aan de vorm van druppels en laad ze met afzonderlijke cellen meestal duurt 75-90 min. laden cellen kan ook worden bereikt door het aanpakken van de druppel met behulp van de concentrische buizen mondstuk in plaats van de micropipet of met behulp van een oplossing met cellen wanneer in eerste instantie vormen de druppels. De laatste zou nuttig zijn in het beperken van het aantal stappen in het protocol, maar in beide gevallen, de bezetting per druppel een Poissonian verdeling zou volgen. Dit zou beperken het aandeel van eencellige gegevens per spaander; echter, druppels met nul of meerdere cellen zou dienen als besturingselementen. Een extra beperking bij het gebruik van de concentrische mondstuk aan adres druppels is dat het volume van de druppel in stappen van de 10nL zou toenemen. Met de voorgestelde wijzigingen boven dit kunnen worden verbeterd. Op de chip druppel microfluidics zijn geschikt voor het produceren van druppels op hoge frequentie en potentieel in automatisch gecombineerd met ADMs te produceren en te manipuleren druppels sequentieel deponeren ze in een planar array. Dit zou zeker het overwinnen van de beperkingen in de productie van ADMs terwijl ook het inschakelen van één molecuul uitlezing van druppels.
De mogelijkheid om elke individuele druppel heeft een scala aan toepassingsmogelijkheden. Wij hebben de mogelijkheid om opeenvolgend enkele cellen aangetoond. Het maakt ook verwijdering van lysis van de niet-afhankelijke cellulaire materiële post en post analyse door pipet voor analyse met behulp van andere methoden. Latere analyse zou voorbeelden van kwantitatieve PCR in real time of massa-spectrometrie.
Een van de huidige knelpunten voor laboratoria willen nemen een kwantitatieve benadering van eencellige eiwit analyse is de hoge technische barrière en de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur. Met ADMs, verkleind, kunnen hoge gevoeligheid analyses worden bereikt zonder de noodzaak voor schone kamerfaciliteiten te fabriceren microfluidic lab-on-a-chip apparaten. Experimenten worden niet beperkt door het ontwerp van de chip en hun volume en positie kunnen worden gewijzigd zonder de noodzaak voor het fabriceren van nieuwe modellen. Er is zeker ruimte voor verbetering in de vereenvoudiging van de techniek en het verlagen van de toetredingsdrempel voor eencellige analyse om slechts een microarrayer, zowel antilichaam en druppel microarrays en een fluorescentie microplate lezer, naar afbeelding wilt afdrukken.
Een aantal klinische toepassingen van eencellige analyse ontstaan, met name in de behandeling van kanker. Heterogeniteit van de tumor is een grote uitdaging om doeltreffende chemotherapie. In de ontwikkeling van de tumor, mutaties ontstaan steeds vaker en heterogeniteit kan leiden tot morfologische, genetische, en proteomic variabiliteit. Eencellige analyse is in staat om te lossen cellulaire heterogeniteit binnen een tumor en bieden een platform om te helpen beter te begrijpen en voorspellen van medicamenteuze resistentie en gids therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
ASR ontworpen experimenten, protocollen ontwikkeld en geanalyseerd gegevens. SC en PS cel grootte experimenten uitgevoerd. ASR en OC schreef het manuscript. De auteurs willen nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken de steun van Prof. David R. Klug voor het verstrekken van toegang tot apparatuur. De auteurs bedank de Imperial College geavanceerde Hackspace voor toegang tot de fabricage en prototyping faciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
