Summary
여기 선물이 주소 드롭릿 microarrays (Adm), 작은 물방울 배열 기반 메서드 단일 셀에 절대 단백질 풍부를 확인할 수 있습니다. Adm의 기능 인간 암 세포 선에서 종양 억제기 단백질 p53의 표현에이 특성을 설명 합니다.
Abstract
종종 세포 행동 및 세포질 응답 마스킹 복잡 한 인구 내의 풍부한 단일 셀 동작 결과 평균으로 많은 세포의 반응을 함께 풀링된는 인구 수준에서 분석 된다. 단일 셀 단백질 검출 및 정량화 기술 최근 몇 년 동안에 주목할 만한 영향을 만들었습니다. 여기는 주소 드롭릿 microarrays는 실용적이 고 유연한 단일 세포 분석 플랫폼에 설명 합니다. 이 연구는 단일 셀 해상도 대상 단백질의 절대 복사 번호 수 있습니다 측정 하는 방법을 설명 합니다. 종양 억제기 p53 아닌 건강 한 p53 식 패턴을 전시 총 경우의 50% 이상으로 인간의 암에 가장 일반적으로 돌연변이 유전자입니다. 프로토콜을 식에 변화를 정확 하 게 결정을 단일 분자 해상도 10 nL 방울은 단일 인간의 암 세포는 격리 하 고 p53 단백질의 복사본 수를 측정 만드는 단계를 설명 합니다. 에 모든 셀 형식을 기본 자료를 포함 하 여 관심사의 어떤 대상 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 메서드를 적용할 수 있습니다.
Introduction
이 방법의 목표는 단일 셀 해상도 세포 인구에서 대상 단백질의 풍부에 있는 변화를 결정 하는. 단일 세포 분석은 전통적인 앙상블 생 화 확 적인 방법으로 사용할 수 없는 혜택을 제공 합니다. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 첫째, 단일 셀 수준 작업 전통 앙상블 생 화 확 적인 기술로 발생 하 셀 인구는 평균에 의해 그렇지 않으면 손실 될 것 이라고 그의 풍부한이 캡처할 수 있습니다. 대부분 작업 말 생 화 확 적인 방법의 사용 대량, 요구, 그들은 종종 할 때, 결과 생산 하는 세포의 수백만. 물론, 전체 세포 인구를 평가의 결과에 따라 다릅니다 여러 가지 요인, 예를 들어 단백질 식 단백질 풍부의 분포의 몇 가지 중요 한 기능을 놓칠 수 있습니다에서. 실용적인 관점에서 단일 셀 기술의 필요한 감도 있도록 생물 소재도 기능에 더 민감한 대량 기술에 대 한 충분 하지 않은 양의 작업 가능. 이것의 핵심 예제 희귀 한 종류의 세포 등 순환 종양 세포 (CTCs) 어디 그릴 10 CTCs 단일 7.5 mL 혈액에 존재 수도 보다도 가난한 전조 outlook 환자에 대 한 연구 이다. 6 여기 우리 항 체 microarray에 인쇄 된 항 체 기반 분석 결과 기름 덮인 방울 고용 감소 볼륨을 사용 하 여 단일 셀 단백질 측정을 수행 하는 데 필요한 방법론을 제시.
미세 물방울 플랫폼은 높은 처리량, 다양 한 생 화 확 적인 분석 실험을 수행 하기 위해 개별 방울에서 두 번째, 및 격리, 그리고 심지어 경작, 단일 셀 수 있는 방울의 수천을 생성할 수 있습니다. 드롭릿 기반 기술을 단일 세포 분석, 크게의 힘에 의해 주 었는 DropSeq10 와 inDrop11를 포함 하 여 주목할 만한 최근의 예제와 함께7,,89 증폭 기술입니다. 제한 된 양의 재료와 단백질에 대 한 증폭의 아무 방법 단일 셀 proteomics 특히 어려운 게.
방울 다양 한 방법으로 분석할 수 있습니다 그리고 형광 현미경 검사 법은 널리 사용 되 고 있다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 같은 단일 분자 기술을 형광 분자를를 탁월한 신호 대 잡음 비율을 시각화할 수 있습니다. 12 사라져 필드의 지 수 감퇴 때문만 fluorophores 높은 표면 (100nm의 순서 대로)에 흥분 TIRF에 만드는 복잡 한 혼합물에서 대상 분자의 소량을 검출에 좋은 전략. TIRF의 고유의 광학 단면 강도 또한 세척 단계를 방지 하는 데 도움이 하 고 시험 시간 및 복잡성의 한계. 그러나, TIRF 평면 서피스를 요구 하 고 TIRF 현미경 흐름에 작은 방울에 적용의 예 포함 이미지를 평면 표면 형성. 13 이 단일 셀 proteomic 기술을 종종 디자인 표면 움직일 캡처 에이전트 microarray 형태로 주위 미세 칩. 4 , 14
방울, 평면 표면, 소위 드롭릿 microarrays에 배열에서 형성 될지도 모른다. 15 , 16 , 17 편리 하 게 인덱스, 쉽게 시간이 지남에 모니터링, 개별적으로 다루어야 하 고, 필요한 경우 검색 하면 공간적 배열에 방울을 조직. 드롭릿 microarrays는 독립형 또는 microwell 구조에 의해 지원 되는 칩 당 요소 수천 마이크로 반응 기의 높은 밀도 얻을 수 있습니다. 18 , 19 , 20 그들은 형성 될지도 모른다 액체 처리 로봇, 잉크젯 관측 병, 순차적 증 착에 의해 microarrayers21,22,23,,2425, 문의 26 또는 그들은 superhydrophillic와 같은 표면에 자기 조립 수 명소 superhydrophobic 표면에 무늬. 27 , 28 , 29
염두에 두고 이러한 고려 하 여 지정 드롭릿 Microarrays (Adm) 양적 다양성, 공간적 접근성 및 드롭릿 microarrays의 감소 볼륨을 단일 분자 TIRF 현미경의 감도와 결합 하도록 설계 되었습니다. 단백질 풍부를 측정 합니다. 5 Adm 다음 증발을 방지 하기 위해 기름으로 출장 하는 항 체 microarray에 단일 셀을 포함 하는 작은 물방울 microarray를 형성 하는 단일 세포 분석 가능 작은 물방울의 볼륨은 온 칩 valving 연속 흐름 마이크로에 의해 그렇지 않으면 달성 될 것 이다 샘플 손실을 방지 하기 위해 개별. 30 단일 셀에서 대상 단백질의 절대 크기가 매우 작습니다. 그러나, 작은 물방울의 감소 볼륨 수 있습니다 상대적으로 높은 지역 농도 샌드위치 항 체 분석 결과 사용 하 여 검색-뚜렷한 지역에서 또는 표면에 묶는 단백질을 캡처에 자리 항 체 움직일 수 에 붙일 이라는 탐지 항 체 방울 볼륨에 존재. 레이블 없는 접근 방식으로 (즉 단백질 대상 직접 표시 될 필요가 없습니다), Adm 처리 혈액 등의 기본 소스에서 세포 분석에 일반적으로 적용 되는, 잘 문화에서 셀 뿐만 아니라 aspirates와 해리 종양 생 검 필요 하 고 그들의 lysates입니다.
약물에 응답, 예를 들어에 결정에 중요 하다 단백질 풍부에서 셀 인구 변화 측정 및 세포 기능 및 통로, 평가 부분 모집단에 대 한 통찰력을 제공 하는 데 도움이 됩니다 및 그들의 행동 뿐만 아니라, 그렇지 않으면 대량 방법으로 마스크는 드문 이벤트를 식별. 이 프로토콜 생산 주소 드롭릿 microarrays를 사용 하 여 양적 인간 암 세포에서 전사 인자 p53의 풍부를 결정 하는 방법을 설명 하 고 p53 화학요법 약물에 대 한 응답에서의 역할을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다. 대상 단백질 캡처 및 탐지 항 체의 선택에 의해 결정 되 고 더 또는 다른 목표를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 기름으로 뒤덮인 10 nL 방울 수동으로 배열 하 일반 실험실 소모품에서 동심 노즐 통합 간단한 장치를 구축 안내 됩니다. 전체 실험 과정은 각 방울 lysed 다음 단일 셀와 단일 분자 해상도 TIRF 현미경을 사용 하 여 결정 하는 단백질의 표현 로드 그것에 의하여 설명 합니다.
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Protocol
1입니다. 준비
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칩 및 인쇄 항 체 microarrays
- 항 체 microarray를 지원 하기 위해 기능성된 coverslip를 접착 실리콘/아크릴 아이 솔 레이 터를 연결 합니다. 이 칩을 이라고 합니다.
참고: 다양 한 표면 화학 주소 방울과 그들의 적합성에 대 한 테스트 되었습니다. 5 표면 화학 대체 캡처 에이전트 최적화 할 수 있습니다. ADM 절연체 상업적으로 사용할 수 있습니다 또는 레이저 커팅 아크릴에 의해 생성 될 수 있습니다 (CAD 파일 아이 솔 레이 터가이 작품에 사용 되는 다운로드로 제공, 추가 코드 파일을 참조). - microarrayer에 스위치와 습도 75%로 설정.
참고: 상대 습도 microarray 핀에서 인쇄 솔루션의 증발을 감소 하 고 내 고 남북 spot 변이 감소 시킨다. - Ultrasonication 여 5 분에 대 한 솔루션을 청소 하는 핀에 microarray 핀을 청소 하십시오. 매우 순수한 물 세척 병을 사용 하 여 핀을 헹 구 고 건조 한 질소를 사용 하 여.
참고:만 담가 핀 끝으로 핀을 일시 중단 합니다. 구멍의 적절 하 게 드릴된 세트와 현미경 슬라이드 핀 홀더를 얻을 수 없는 경우 도움이 됩니다. - 인쇄 버퍼 3 × 염-나트륨 시트르산 (SSC) 버퍼, 1.5 M betaine 0.01% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)와 보완의 구성의 5 mL을 확인 합니다. 4 ° C에서 불명확 하 게 저장 합니다.
- 인쇄 솔루션을 준비, 안티-p53 항 체를 녹여 (p53/Mdm2 ELISA 키트, 재료의 표 참조) aliquots-80 ° c.에 저장 된 그것은 1:1 믹스 0.5 mg/mL의 최종 농도에 인쇄 버퍼. 384 잘 플레이트는 micropipette를 사용 하 여 인쇄 솔루션의 5-10 µ L을 로드 하 고는 microarrayer에.
- 부하 칩은 microarrayer에 단계 1.1.1에서에서 조립. 관광 명소는 아이 솔 레이 터의 각각의 센터에 의해 정의 된 좌표에 인쇄 microarrayer 프로그램.
참고: Microarrayers 사용 범위, 주로, 독점 소프트웨어는 사용자가 관련 된 문학을 상담 하는 것이 좋습니다 그래서. Microarray 단계 1.1.1에서에서 동반 CAD 파일에 등장 하는 ADM 아이 솔 레이 터에 필요한 구성 요소의 사각형; 관련 거리 제공 됩니다. - 밀폐 용기에 칩을 저장 하 고 호 일로 포장. 6 주까지 4 ° C에를 저장할.
참고: 사진-손해를 방지 하기 위해 호 일이입니다. 4 ° C에서 저장 생체 및 microarray 활동을 감소 시키기 위하여 행동 할지도 모른다 어떤 해로운 반응의 저하 속도 제한 합니다. 밀폐 용기에는 칩을을 칩 표면에 형성 하는 결로 없이 사용 하기 전에 실내 온도에 equilibrate 수 있습니다. 연락처 microarray 인쇄 표면 장력 및 인쇄 솔루션 및 관광 명소를 생산 하는 인쇄 기판 사이의 접착을 이용 한다. 사전 인쇄 또는 blotting는 일반적으로 균일 하 게 크기의 관광 명소를 microarray 핀에서 과잉 솔루션을 제거 해야 합니다. 희생 미리 인쇄 coverslip 일괄 품질을 평가 하기 위해 사용할 수 있기 때문에 버리지 마십시오.
- 항 체 microarray를 지원 하기 위해 기능성된 coverslip를 접착 실리콘/아크릴 아이 솔 레이 터를 연결 합니다. 이 칩을 이라고 합니다.
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주사기, 준비 주소 방울 분배 배관 및 동심 노즐
- (대 한 수성 방울) 100 µ L를 분해 및 1 mL (상한 석유)에 대 한 해밀턴 주사기 유리 부품 증류수 H2o. 린스
- 150 µ m의 100 m m 길이 피드 ID/360 µ m OD 융합 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 길이 통해 실리 카 튜브 "OD PFA 튜브 2 m m 돌출 될 때까지. 이 동심 노즐을 형성할 것 이다.
- 10 µ L 피 펫 팁의 끝에 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고 1.0 m m ID/1/16의 40 m m 조각으로 삽입 "OD PFA 튜브. 필요한 경우, 접착제 세트 전에 노즐에서 2mm 돌출을 유지 하기 위해 융합 된 실리 카 튜브를 재조 정할.
- 용융 실리 카 모 세관의 다른 쪽 끝의 0.014"ID/0.062 200mm 길이의 끝에 삽입" PTFE 튜빙 마약 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (PBSA)이 4% 소 혈 청 배 젖 (BSA) 채워진 해밀턴 주사기 100 µ L를 연결.
참고: 단백질과 다른 생 화 확 적인 종 표면에 비 특히 묶는 수 고 하거나 수 있습니다 수 손실 변성. BSA는 '차단' 표면 sacrificially 그 표면에 바인딩하여 일반적인 바인딩 최소화 하는 데 사용 됩니다. - 그것은 물개를 형성 될 때까지 200 µ L 피 펫 팁에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 400 m m 길이 삽입 합니다. 또 다른 200 µ L 피 펫 팁을 cyanoacrylate 접착제의 얇은 층을 적용 하 고이 자리에는 튜브를 해결 하기 위해 첫 번째 팁으로 밀어. 미네랄 오일으로 채워진 해밀턴 주사기 1ml에 1.0 m m ID/2.0 m m OD FEP 튜브의 열린 끝을 연결 합니다.
- 동심 노즐의 10 µ L 피 펫 팁에 200 µ L 피 펫 팁 어셈블리를 삽입 합니다. 별도 주사기 펌프에 주사기를 장소 그들은 독립적으로 운영 될 필요가 있을 것 이다.
- 4 %PBSA 차단 솔루션으로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 다시 연결 하 고 차단 솔루션 '수성' 튜브를 플러시. 총 3 플러시를 두 번 반복 합니다.
- 4 %PBSA 다시 연결 튜브에서 0.125 µ g mL-1 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)로 100 µ L 주사기를 채우십시오. 펜스 25 튜브에 차단 솔루션 대체 µ L 탐지 항 체 솔루션.
- 모든 튜브와 노즐 기름으로 채우고 때까지 미네랄 오일 '석유' 튜브를 플러시. 미네랄 오일 1 mL 주사기를 리필 하 고 다시 연결 하는 튜브. 튜브와 노즐 어셈블리는 XYZ 조작자를 보안 합니다.
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Microinjector 및 micromanipulator 준비
참고: 아래 단계 microinjector와 micromanipulator 기구 자료 테이블에에서 지정 된 구성 요소에 특정 참조를 확인 하지만 일반적으로 이러한 장치에 적용 되는.- microinjector 압력 관과 모 세관 홀더를 연결 하 여 조립.
- 미네랄 오일 완전히 라인을 채우고 때까지 천천히 피스톤 다이얼을 돌립니다.
- 번역 헤드 마운트에 모 세관 홀더를 탑재 합니다.
- 모 세관 홀더 그립 헤드와 모 세관을 수정 했다.
- 4%의 솔루션을 플라스틱 PBSA는 아이 솔 레이 터의 우물 중 하나에.
- micromanipulator를 사용 하 여 번역 하십시오 하 고 솔루션으로 모 세관의 끝을 젖어.
- 천천히 4 %PBSA 떠나 10 분 동안 차단 하는 모 세관을 채우십시오.
- microcapillary을 추출 하 고 어셈블리는 칩의 명확한 번역 모듈을 회전.
2. 양식 주소 방울 및 부하 단일 셀
- 양식 주소 방울
- 현미경 단계에 칩을 보호 합니다.
참고: 현미경은 자동된 현미경 단일 분자 TIRF의 장착 거꾸로 형광은 인코딩된 XY 스테이지 및 전자 전 하 결합 소자 카메라 (EM-CCD) 멀티. - 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 각 명소의 현미경 스테이지 좌표를 기록 합니다.
- 현미경 단계에 XYZ 조작자를 설정 합니다. 50-60 °의 각도에서 노즐을 배치 합니다. 노즐에 충분 한 길이 칩 도달 클리어런스 확인 합니다. '수성'과 '기름' 주사기 펌프 10 분배 설정 100 µ L/min과 100 µ L/분, 5 µ L에서 nL 각각.
참고: 준비, 동안 노즐의 머리에서 수성 해결책 수 있습니다 건조 됩니다. - 액체의 구슬 노즐의 머리에 표시 될 때까지 용액을 분배. 그것을 제거 하는 먼지 무료 지우기와 소량.
참고: 조사 조건 수에 따라 다양 한 웰 스 셀에 대 한 저수지 역할을 보유 합니다. 단일 셀 라인/형식에 대 한 단일 저수지 충분 합니다. - 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열 및 초점에서 항 체 자리에 coverslip 표면에 현미경 스테이지 좌표 설정.
- 방해 하지 않도록 주의 자리, XYZ 조작자를 사용 하 여 항 체의 측면에는 동심의 유리 모 세관 끝 및 10 분배 수성 해결책의 nL. 단계를 이동 하지 않고 수성 해결책을 뚜껑에 기름의 5 µ L를 분배 합니다. 천천히 노즐은 물방울의 명확한 올리고 잘 다음 이동.
- 배열에 있는 모든 항 체 관광 명소 2.1.6 단계를 반복 합니다.
- 30 분 후 각 항 체 세포를 로드 하기 전에 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 자동된 현미경 제어 소프트웨어를 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
- 현미경 단계에 칩을 보호 합니다.
- 로드 셀 주소 지정이 가능한 방울
- 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 제거 하 고 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리.
참고:이 연구 될 인간 결 장 암 세포 라인 그리고 사용 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) CO2 배양 기에서 보충을 사용 하 여 양식. - 필요한 경우 셀 얼룩 놓여있는지.
- 10%에서 0.125 μ g/mL 탐지 항 체 (안티-p53 항 체 (마-1) 알 렉 사 488로 분류)의 솔루션에 셀 resuspend FBS L-15 미디어에서. 단일 세포 현 탁 액을 위해 40 µ m 피치 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 필터링 합니다.
- hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 희석 또는 25-400 × 103 셀/mL의 농도에 셀 솔루션을 집중. 그러면 그 셀 앙금 편안 하 게는 microcapillary 조작에 충분 한 간격으로.
- 단일 셀 micromanipulator microcapillary를 사용 하 여 셀 저수지에서 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 로드 합니다.
참고: 비 부착 한 세포는 micropipette에 대량에서 로드할 수 있습니다 및 주소 지정이 가능한 작은 물방울으로 하나 하나를 적절 하 게. 표면 차단 치료에도 불구 하 고 부착 세포는 비 특히 유리 microcapillary 안 벽에 충실 하 여 손실 될 경향이 있습니다. - 10 × 목표를 사용 하 여 관찰 하는 microinjector를 사용 하 여 단일 셀을 셀 저수지에서 microcapillary로 발음.
- 전자 조작 단계를 사용 하 여 경우 micromanipulator 무대 좌표를 저장 하거나 수동으로 z 위치를 참고.
- 칩의 1 m m 높이를 위쪽으로 그것을 번역 하 여는 micropipette 철회. 조이스틱이 나 전자 조작 무대의 '꺼내기' 기능을 사용 하 여 자동으로 이것을 수동으로 수행 합니다.
- 그는 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 사용 현미경 제어 소프트웨어 자동 스테이지 좌표를 설정 합니다. ' 주사 '는 micropipette 저장 (또는 언급) z 위치를 반환 하 여. 조이스틱 또는 자동으로이 수동으로 수행 전자 조작 단계를 사용 하는 경우.
참고: microcapillary는 상한 기름 피어스 되며 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 수성 부분 내에서 찾을 수 있습니다. - 분배는 microinjector를 사용 하 여 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 셀. 10 nL 주소 지정이 가능한 작은 물방울의 볼륨 1% 미만 증가 합니다.
- 어디 주소 방울 셀을 포함 하지 않는 일부 실험 제어에 대 한 무료 두고 나머지 주소 방울에 대 한 2.2.5-2.2.9를 반복 합니다.
참고: 주소 지정이 가능한 방울 micromanipulator를 microcapillary를 사용 하 여 단일 셀 로드 간단한 대안 농도 10의 순서에 4 %PBSA 포함 세포 항 체 검출의 솔루션으로 단계 1.2.8에서에서 솔루션을 대체 하는 5 셀/mL, 1 셀/10에 해당 nL. 단일 셀 인 Poissonian 되며 셀 농도 최적화 될 필요가 있을 것 이다.
- 인큐베이터에서 세포 배양 플라스 크를 제거 하 고 트립 신/EDTA 솔루션을 사용 하 여 셀을 분리.
- Lyse 세포 및 이미지 배열
- 모든 형광 이미지를 포함 하 여 명시 야 현미경을 사용 하 여 작은 물방울에 이미지 셀.
참고: 영상 ~ 100 방울 자동된 현미경을 사용 하 여 이미지를 약 3 분 걸립니다. 이미지를 수행 60 나 = 1.49 기름 침수 목표. 아니 필터는 명시 이미징 반면 형광 이미징에 사용 되는 표준 필터 집합 필요 합니다. - 단일 분자 TIRF 현미경을 사용 하 여 배열에 있는 모든 관광 명소 이미지.
참고: 특수 TIRF 2.3.1 단계에서 필터 집합 설정이 사용 됩니다. 이러한 이미지 세포 전 각 항 체 자리에 바인딩된 단일 분자의 배경을 결정 하는 3 절의 이후에 분석 됩니다. 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미징 이미지 ~ 100 관광 명소를 약 5 분 걸립니다. - 셀 주소 지정이 가능한 작은 물방울에 초점. 단일 6 초점을 맞춤 으로써 완전 한 광 세포 달성 ns 레이저 펄스 (파장 1064 nm, 펄스 당 펄스 에너지 14.1 ± 0.3 µJ)는 셀의 위치에 가까운.
참고: 레이저 펄스 확대 공동 현상 거품을 그가 위 셀 설정 하 고 세포 성분 물방울 볼륨으로 줘 라. 4 , 31 레이저 유도 세포로 인해 기계적 프로세스 낮은 펄스 에너지에서 오일-물 인터페이스를 방해 하지 마십시오. 광 세포는 일반적으로 100 세포를 lyse 약 20-30 분 걸립니다. 토론 섹션에서 설명 했 듯이, 광 세포 설치 가능 하지 않은 경우 단일 세포를 lyse 대체 방법 수가 있습니다. - 모든 포함 하는 셀 주소 지정이 가능한 방울 떠나 5 실험 제어에 대 한 무료 주소 방울 취소 lysed 세포를 포함 하는 어디에 대 한 반복 합니다.
- 참고는 각 셀이 lysed 시간.
참고:이 시간 단계 3.1.9에서에서 각 명소에 대 한 개별 바인딩 곡선을 해결 하기 위해 사용 됩니다. 종종 주의 시간 때 첫 번째 및 마지막 셀 lysed는 나머지 가정 세포 이벤트 사이 적절 하 게 일관 된 시간을 추정 하는 충분 하다. - 첫 번째 30 분 후 추가 60 분 마다 20 분 마다 10 분의 모든 관광 명소의 TIRF 현미경을 사용 하 여 단일 분자 이미지를 취득 합니다. 평형에 바인딩된 단백질 양에 관심만 실 온에서 90 분 동안 칩 잠복기 후 모든 관광 명소를 이미지.
참고: 평형에 도달 하는 시간 방울 볼륨 및 분석 결과에서 사용 하는 항 체의 친 화력에 따라 달라 집니다. TIRF 현미경 레이저 여기 소스를 사용 하 여 수행 됩니다 = 488 nm와 1.5 mW 파워 광 파워 미터를 사용 하 여 다시 조리개에서 측정 되. 단일 분자 이미지 900 수집 시간, 1 MHz 판독 속도에서 16-비트 디지털화를 안에 CCD 카메라에 수집 설정을 설정 하 여 인수 하 고 그들 10 얻을. 아이 솔 레이 터는 coverslip 신중 하 게 제거 하 여 다시 사용할 수 있습니다.
- 모든 형광 이미지를 포함 하 여 명시 야 현미경을 사용 하 여 작은 물방울에 이미지 셀.
3. 데이터 분석
-
단일 분자 (비-정체/디지털 정권)을 계산
- 피지 (Matlab), 어떤 혼잡 비 항 체 자리에 대 한 using, 세포 (배경, BKD) 전에 취득 하는 이미지를 로드 합니다.
참고: 다음 단계에서 작업 straightforwardly 수행 됩니다 피지 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 사용자 가이드 다음 링크 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html에서 찾을 수 있습니다. - 피지에서 BKD 이미지를 선택 합니다. "이미지" 메뉴에서 "중복" 중복 BKD를 선택 합니다. 중복 이미지 선택 및 "과정 > 필터"에서 "가우스 덩어리 죠" 하는 것을 선택 하 고 50 픽셀 반경을 지정.
- BKD 이미지 흐리게 BKD 이미지를 생산 하는 BKD_FLAT에 의해 나누어 여기 광원의 효과적인 균일 강도 분포 되도록 BKD 이미지를 평평.
- "프로세스" 선택 "이미지 계산기...", 이미지 필요한 작업 "나누기"를 지정 하 고 선택 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
- 1 이미지에서 각 픽셀을 뺍니다 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정). 평균 픽셀 강도 0 이어야 합니다.
참고: 병합 필드 하 고 이후 모든 픽셀의 합계 0 이어야 하 고 모든 나머지 오프셋 수 있습니다 더 straightforwardly 보상 평면화 된 배경 이미지를 쉽게 확인할 수 있습니다. - BKD_FLAT 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 합니다. "분석"과 "측정"을 선택 하 여 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정 합니다.
참고: 선택 영역 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 이 자리에서 배경 결정 단일 분자의 높은 밀도 될 것입니다. 기본 메뉴 선택 도구를 사용 하 여 측정 위치를 수동으로 선택할 수 있습니다 하거나 실행 매크로 코드 "makeRectangle (x, y, 너비, 높이)"; 이 사각형 선택 영역을 만듭니다 어디 x 및 y 좌표 (픽셀)의 왼쪽된 위 모퉁이 인수. - 3σ로 이미지 임계값을 설정 하 고 SM_MASK 이진 이미지를 만듭니다.
- "이미지 > 조정" 아래 "임계값..."를 선택 하 고 3σ로 더 낮은 임계값을 설정 합니다.
참고: 픽셀 임계값 값은 0으로 설정 되 고 임계값을 초과 하는 픽셀을 1로 설정 됩니다. 임계값은 thresholded 픽셀 단일 분자에 속하는 자신감을 결정할 것입니다.
- "이미지 > 조정" 아래 "임계값..."를 선택 하 고 3σ로 더 낮은 임계값을 설정 합니다.
- 세그먼트 이미지 SM_MASK, 4-9 픽셀2 의 크기 및 0.5-순환 하는 개체의 0 설정된 픽셀 휘도 값에에서 1 "분석"을 선택 하 여 다음 분석 입자 크기와 원형 지정.
참고: 픽셀 크기 다른 fluorophores 및 현미경 세트에 대 한 최적화를 할 수 있습니다 ups. 카메라 노이즈 유형 때문 단일 픽셀이이 임계값 이상 있을 수 있으며 단일 분자 되지에 불구 하 고 폐기 하지. 픽셀 크기 기준 올바르게 이러한 픽셀을 삭제 것입니다. 단일 분자는 일반적으로 모양에서 원형. 반면 값이 0에 접근 이면 점점 더 길쭉한 모양을 진원도 값 1 완벽 한 원을 나타냅니다. 나머지 개체는 단일 분자 고 계산 될 수 있습니다. 자리에 자리 를 차별의 영역을 구분 하는 마스크를 설정할 수 있습니다 고 자리에서 프레임 당 계산. 이것은 최신 시간에서 획득 하는 프레임에 대 한 쉽게 이전 프레임에 적용할 수 있는 충분 한 신호 자리에 있을 때. - 같은 비 혼잡 항 체 자리에 대 한 로드 하 고 단계 3.1.1-모든 이미지 프레임 3.1.7 캡처한 시간 해결 시리즈 인수 게시물 세포로 반복 합니다. 2.3.5 단계에 세포의 용 해 시간을 사용 합니다. 모든 바인딩 곡선 수정
- 피지 (Matlab), 어떤 혼잡 비 항 체 자리에 대 한 using, 세포 (배경, BKD) 전에 취득 하는 이미지를 로드 합니다.
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단일 분자 (정체/아날로그 정권)을 계산
- 계속 하기 전에 단일 분자의 평균 강도 계산 하려면 단계 3.1.1-3.1.8 반복 합니다.
- BKD_FLAT 및 SM_MASK에 의하여 0이 아닌 픽셀 값은 단일 분자와 관련 있는 이미지 생성 이미지를 곱하면 됩니다.
- 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
- "분석" 그리고 "측정";를 선택 하 여 모든 픽셀의 강도 값 합계 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다. 단계 단일 분자 당 평균 강도 계산 하는 3.1.8에 의하여 계산된 단일 분자의 수로 나눕니다.
- 어떤 혼잡 한 항 체 자리에 대 한 로드 이미지 획득 후 세포 평평 하 게 단계 3.1.2와 3.1.3에 의하여 흐린된 배경 이미지와 함께.
- 1에 의해 병합 된 이미지에서 각 픽셀을 빼기 ("과정 > 수학", "빼기..."를 선택 하 고 값 1 지정)
- 이미지의 4 모서리에 50 픽셀 × 50 픽셀 영역을 선택 하 고 픽셀 강도 표준 편차 (σ)를 측정. 3.1.5 자세한 단계를 참조 하십시오.
- 3σ에 이미지 임계값을 설정 하 여 바이너리 이미지 마스크를 만들고 크기와 개체의 0 미만 4 픽셀2픽셀 강도 값을 설정 합니다. 을 수행 하려면, "분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 크기 및 원형 지정.
- 병합 된 혼잡 한 항 체 자리 이미지를 바이너리 이미지 마스크에 곱하십시오.
- 을 수행 하려면, "프로세스" 메뉴에서 "이미지 계산기...", "곱하기" 운영과 필수, 이미지 지정 선택한 상자 "만들기 새 창"와 "32-비트 (부동) 결과."
- "분석"을 선택 하 여 나머지 픽셀 농도의 합계 다음 "측정"; 선택 항목의 요약 통계 결과 창에 표시 됩니다.
- 혼잡 한 자리에 바인딩된 단일 분자의 수를 계산 하기 위해 평균 단일 분자 강도 의해 픽셀 농도의 합계를 나눕니다.
-
절대 정량화에 대 한 교정 곡선
- 섹션 1과 알려진된 농도 재조합 단백질으로 아군 4 %PBSA 솔루션에서 10 nL 주소 방울 탐지 항 체를 형성 하는 2를 반복 합니다.
- 수행 하는 10의 농도 시리즈2-솔루션에 추가 하는 재조합 형 단백질의 알려진된 농도 변화 하 여 방울 당 107 재조합 단백질. 보정 단일 셀 데이터 간단 있도록 드롭릿 당 단백질의 수 작업 하는 것이 좋습니다.
- 3.3.2 어떤 단 하나 분자를 보정 단계에서 데이터 계산 농도 시리즈를 사용 하 여 자리 단백질 풍부한 방울 당 고 단일 셀 당 확장 단백질 풍부 하 당.
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Representative Results
P53의 절대 기저 단백질 복사본 수 인간 결 장 암 세포 선, 될 셀에에서 단일 셀 해상도로 결정 되었다. 어떻게 p53 식 여러 자릿수로 동안 다를 수 있으며 휴식 될 세포 인구 내에서 셀 크기와 단백질 복사 번호 약하게 긍정적인 상관관계를 보여 보여 줍니다.
주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 수성 방울 항 체 자리 위치에서 적절 하 게 석유와 때 형성 된다. 여기, 방울 민감한 p53 단백질 분석 결과 지원합니다. Coverslips 캡처 항 체 점이 연락처 microarrayer 핀을 사용 하 여 배열 됩니다. 안티-p53 캡처 항 체 상용 ELISA 테스트 키트에서 가져온 것입니다. 인쇄 조건 캡처 명소 했다 자리 당 6.2 ± 0.5 x 105 단백질의 최대 캡처 용량을 가진 직경에 있는 약 100 µ m 되도록 했다. 32
coverslip에 접착 하는 아이 솔 레이 터를 사용 하 여 가까운 항 체 캡처 명소 기름의 확산 제한 이후 형성 방울의 높은 밀도를 수 있습니다. 에 아이 솔 레이 터의 각 잘 방울 용액을 증발 (그림 1A)를 방지 하기 위해 기름으로 뒤덮인 다음 분배에 의해 형성 된다. 최소한의 기름 방울; 모자를 적절 수 있습니다. 그러나, 어떤 칠 각 아이 솔 레이 터 잘 정확 하 게는 기름 표면은 평면 영상에 대 한 금액을 분배 하 유용 합니다. 절연체는 상업적으로 공급 하거나 레이저 커팅 아크릴 시트에 의해. 실리콘 절연체는 4 x 6 배열에 사용 가능한 미리 잘라 우물 (n = 24) 하지만 4 x 11 배열에 변경 될 수 있습니다 (n = 44) 생 검 또는 다 구멍 가죽 펀치를 사용 하 여. 그림 1B 에서 아이 솔 레이 터를 절단 레이저 2.89 m m, 3.9 m m의 센터에 센터 별거와 0.5 m m의 높이의 최대 직경을 가진 각 100 육각 우물의 배열을 보여 줍니다. 작은 물방울 저장 될 수 있습니다 하 고 (최대 3 개월까지 관찰) 시간의 연장된 기간에 대 한 안정적인 유지.
방울 동심 튜브 노즐 (그림 1C), 두 개의 주사기 펌프 (그림 1A)에 연결 된 변환는 집에서 만든 기구를 사용 하 여 수동으로 만들어집니다. 용융 실리 카 모 세관, 기름 단계 dispenses 엿 봄 배관의 짧은 길이 통해 먹이 수성 단계 dispenses 동심 튜브 노즐 구성 됩니다. 현미경을 사용 하 여, 노즐 항 체 자리에 정렬 되 고 펌프 오일 (그림 1E, 단계 1-4) 바로 다음에 수성 솔루션 특 면 먼저 것이. ADM에 모든 방울 형성 된다, 일단 microinjector 및 micromanipulator (재료의 표 참조) 단일 셀 (그림 1D)와 각 방울 로드 하는 데 사용 됩니다. micropipette 셀 셀의 저수지에서 캡처하는 것 이라고, 칩에 우물에 적절 하 게, 물방울에 잘 번역 그리고 수성 물방울 (그림 1D, 5-8 단계)으로 셀을 전달 하기 위해 오일 캡 침투.
방울 내의 모든 관광 명소 세포 전에 몇 군데 하 고 일반적인 바인딩 명소 (그림 2A)의 정도 확인 하는 데 사용 됩니다. 단일 세포는 완전히 (핵) 포함 lysed 광학 방법을 사용 하 여. 31 광 세포 세포를 방해 하는 확장 레이저 펄스 유도 공동 현상 거품의 전단 힘에 의존 합니다. 그 기름-물 인터페이스 방해 되지 이러한 프로세스에 의해 펄스 에너지를 제한 하 고 기름/물 인터페이스에서 셀을 입금 하 여 관리 되어야 합니다. 배열을은 TIRF 현미경 검사 자동된 현미경;를 사용 하 여 이미지 셀 lysed는 일단 프레임 마다 10 분 인수 후 추가 60 분 마다 20 분 30 분을. 항 체 친 화력, 단백질 보급 등 물방울 볼륨 상태는 90 분 인수 내에 도달 하면 평형 바인딩 되도록. 일반적인 단일 셀 풀 다운 그림 2A에 표시 됩니다.
이미지 분석을 단일 분자 계산의 과정은 그림 2B에서 개요로 묘사 된다. 관광 명소의 이미지 중 하나 간주 됩니다 비 혼잡, 어디 대상 단백질 농도 단일 분자 잘 분리와 쉽게 구별, 또는 혼잡, 대상 단백질 농도 높고 단일 분자 이미지 오버랩 하 고 더 이상 개별적으로 구별할 수 없습니다. TIRF 여기 프로필도 이므로, 그것은 중요 한 모든 이미지 플랫 필드 수정 될 인수입니다. 가우스 흐림 TIRF 여기 프로 파일의 평균 프로 파일 이미지를 생산 하 고 세부 사항 및 잡음 제거를 스무 딩 필터 역할을 하는 비 혼잡 프레임에 적용 됩니다. 이 처리 된 이미지는 원본 이미지를 '병합'을 사용할 수 있습니다. 어디, 평형, 에서도 몇 단일 분자는 비 혼잡 이미지 프레임 자체를 해결 하기 위해 처리할 수 있습니다. 이 방법은 단일 분자 자리를 차지 하는 곳에 밀집, 혼잡 한 자리에 적용 되지 않습니다 하며 병합에 대 한 획득 배경 이미지. 병합 된 프레임은 다음 픽셀 농도 적어도 3와 thresholded 번 배경 표준 편차와 평균 값입니다. 단일 분자 피지의 입자 분석 기능을 사용 하 여 0.5 보다 큰 순환으로 4-9 클러스터 된 픽셀을 식별 하 여 자동으로 검색 다음 됩니다. 결과 단일 분자의 평균 강도 계산할 수 있습니다. 그것은 단일 분자의 알려진된 평균 강도 의해 항 체 자리 총 강도 나누어 혼잡 한 자리에 단일 분자의 수를 결정 하는 데 사용 됩니다. 피지의 스크립트 편집기를 사용 하 여이 단계를 자동화할 수 있습니다.
농도 시리즈는 재조합 형 p53 단백질 (그림 3A)의 알려진 농도가 방울에 평형에 단일 분자 수를 결정 하기 위해 수행 됩니다. 조건이 되도록 캡처 항 체 명소 캡처 총 대상 단백질, 선형성의 지역에서 약 1%의 분수 (물방울 R2 당 105-108 단백질 = 0.99). 일반적인 바인딩 작은 물방울에서의 수준 187 ± 60 분자 이다. 단일 셀 pulldowns의 결과 셀 마다 절대 단백질 복사본 수의 배포판을 달성 하기 위해 다음 변환 수 있습니다. 그림 3B Adm을 사용 하 여 단일 될 셀의 절대 p53 단백질 발현의 분포를 보여줍니다. 유전자 동일 하거나 매우 유사한으로 간주 될 수 있습니다, 될 세포에서 P53 단백질 발현 확률 과정 이다. 분포는 감마-같은-비대칭 및 긴 꼬리를 가진 unimodal. 따라서, 평균 (1.82 × 106 단백질) 모달 단백질 풍부 (빈 0-5.0 × 105 단백질)과 대 수 그리고 표준 편차 (1.88 × 106 단백질) 완전히 분포의 특징을 포착 하지 않습니다. 이 분포는 그렇지 않으면 손실 될 때 대량 측정 평균 세포 인구에서 단백질 식의이 잡으려고 단일 셀 측정의 중요성의 예입니다. 각 셀에 대 한 추가 매개 변수를 측정할 수 있습니다. 여기, 셀 볼륨 세포는 작은 물방울에 앞서 각 셀 직경을 측정 하 고 대략 구형 셀 가정 하 여 추정 된다. 그림 3C 셀 크기의 기능으로 단일 될 세포에서 p53 절대 단백질 복사본 수의 비교를 보여줍니다. 번호가 더 높은 총 p53 복사 하 큰 셀에 대 한 경향이 있다. 흥미롭게도, 그것은 이후 셀; 당 최소 p53 복사 된 것 처럼 보인다 사이 p53 식 및 셀 크기 조정은 배포 가능 그러나,이 발생 하는 메커니즘 추가 조사 필요.
그림 1: 주소 지정이 가능한 물방울 Microarray 장치 및 칩. (한) 물방울 동심 튜브 노즐을 번역 하는 3 축 선 조작자를 사용 하 여 수동으로 적절 하. 수성 작은 물방울은 오일 상한 뒤 항 체 microarray의 특정 위치에 적절. (b)는 아이 솔 레이 터는 오일의 확산을 제한 하 여 기판에 어드레스 할 수 있는 방울의 높은 밀도를 수 있습니다. 절연체는 레이저 절단 0.5 m m 아크릴 시트에 의해 생성 될 수 있습니다. 물방울, 블루의 시각화를 돕기 위해 식용 색소 염료에서 장치를 사용 하 여 입금은 한). 10 m m, 삽입 규모 바 스케일 바 1 m m. (c) 동심 튜브 노즐 수 주소 방울 형성 될 프로토콜의 1.2 단계에서 조립. (d)는 microinjector와 micromanipulator 프로토콜의 1.3 단계에서 준비 된 개별 주소 방울으로 세포를 분리 하는 데 사용 됩니다. (e) 만들고 주소 방울을 로드 하는 과정에서 중요 한 단계에 표시 됩니다. 항 체 자리는 (1) 모 세관 튜브의 끝 정렬 (2)과 수성 (3) 다음 오일 (4) 구성 요소는 적절 하 게 인코딩된 번역 단계를 사용 하 여 있습니다. 단일 셀 반복적으로 수성 드롭릿 (7)를 해결 하 고 셀 (8) 입금 수 있는 유리 microcapillary (5-8)를 사용 하 여 로드할 수 있습니다. 규모는 100 µ m 바. (5)에서 빨간색 화살표와 (8) 고립 된 단일 셀을 강조 하 고 (8)의 삽입 높은 확대율 (눈금 막대 10 µ m)에서 격리 된 단일 셀을 보여줍니다. 이 그림의 부분 참조12, 화학의 왕 사회의 허가 의해 재생에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 이미지 분석 단계. 평형 (tEq) (p53 분석 결과 대 일 분)를 도달할 때까지 배열의 각 자리 TIRF 현미경 검사 법에 의해 몇 군데 주기적으로 이다. 평형 시간 t 솔루션 뿐만 아니라 대상된 단백질에 대 한 항 체의 쌍의 선호도에 따라 달라 집니다. a) 예제는 배경 뿐만 아니라 예를 들어 단일 셀 풀 다운 (스케일 바 20 μ m)의 단일 분자 TIRF 현미경 이미지. 삽입 된 이미지는 일부 단일 분자 (눈금 막대 5 μ m) 빨간색 화살표로 강조와 배경 이미지의 확대 부분을 보여 줍니다. b) 프로토콜의 3 단계에서 상세한 이미지 분석의 개요. 짧게, 두 개의 광범위 한 정권 어디 관광 명소 간주 될 수 없습니다 비 혼잡, 단일 분자는 부족, 및 혼잡 한, 단일 분자의 밀도 상당한 오버랩이 있다 고 수 없습니다 더 이상 단독으로 식별할 수 없습니다. 이미지 분석에 중요 한 단계는 여기 레이저의 비균일 강도 프로필의 효과 제거 하려면 필드 병합. 디지털 세 정권에서 단일 분자 식별 됩니다 직접, 그들의 강렬 및 모양 매개 변수를 기반으로. 아날로그 계산 정권, 단일 분자의 수 평형 및 디지털 세 정권에서 알려진 단일 분자의 평균 강도 나누어 총 자리 강도 측정 하 여 계산 됩니다. 단계는 straightforwardly ImageJ 데이터를 분석 하에 자동화 될 수 있습니다. 이미지의 하단 패널 순서 대상 단백질의 축적에 보여줍니다 항 체 캡처 자리; 처음에, 관광 명소 되지 않습니다 대상 단백질 항 체 자리에서 축적, 단일 분자 점점 될 수 있는 반면 (t1) 혼잡 평형 (teq)에 도달할 때까지 (tn) 혼잡. 참고 그 자리 유지 비 혼잡 또는 정체 되는 다 수 요인에, 특히에서 분석 볼륨에서 대상 단백질의 풍부를 따라 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 단일 셀 데이터. 절대 부 량 보정 곡선을 사용 하 여 이루어집니다. (a) 단일 분자 수 재조합 형 단백질의 알려진된 농도 사용 하 여 만들어집니다. 이 보정 곡선 분석 볼륨에서 대상 단백질의 수의 각 자리에서 계산 하는 단일 분자를 변환 하는 데 사용 하 고 따라서 단일 셀 복사 번호. 수평 빨간색 파선 187 ± 60 분자의 비 특정 바인딩의 수준을 나타냅니다. 오차 막대는 실험 3의 뜻에의 한 표준 편차를 실행. 파선된 선 단백질의 100% 탐지를 나타냅니다. (b) 단일 셀 기저 p53의 배포 될 암 세포에서 단백질 표정 모달 값 보다 상당히 높은 일부 세포에서 p53 단백질 표정 보여주는 긴 꼬리 같은 감마 분포 표시 됩니다. 단백질 표정 셀 크기의 기능으로 변화 하는 방법을 보여주는 셀 양의 기능으로 셀 당 p53 단백질 복사본 수의 (c) 분산형 줄거리. 이 그림의 일부를 12 에서 수정 하 고 허가로 재현 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays는 양적 단일 세포 내 단백질의 절대 복사본 수를 결정 하는 과민 하 고 확장 가능한 방법.
일반적인 바인딩 수준을 제한 (NSB)이 낮은 가능한 탐지의 한계를 달성 하는 프로토콜 내에서 중요 합니다. 단백질 및 다른 생 화 확 적인 종 방울 내의 인터페이스의 수에 비 특히 묶는 수 있습니다-coverslip 표면, 항 체 자리와 기름/물 인터페이스. 단백질은 인터페이스 또는 자체 기름으로 분할 하 여 손실 될 수 있습니다. 우리는 4 %BSA 수성 방울에는 NSB는 프로토콜에 지정 된 항 체를 사용 하 여 단백질의 제한 수 나타났습니다. 양자 택일 단백질 목표 및 그들을 검출 하는 데 사용 하는 항 체는 다른 차단 방법, 그러한 비 이온 세제 또는 호환 계면 필요할 수 있습니다. 불 오일 또한 상한 기름으로 봉사에서 그들의 적합성에 대 한 테스트할 수 있습니다. 이러한 경우, 임계 micelle 농도 및 상한 오일의 밀도 같은 추가 고려 되어야 합니다.
씻지 않은 인쇄 버퍼, 배열 정렬에 에이즈 후 각 자리 위치에서 남아 있는. 처음에 방울 입금, 해야 합니다 주의 스크래치 또는 항 체 자리를 피해 동심 튜브 노즐의 끝에 의해. 메서드 추가 개발, 형광 성 염료는 캡처 항 체 이외에 움직일 된다 항 체 인쇄 버퍼에 실수로 수 있습니다. 이것은 작은 물방울 배열; 전에 수행할 수 세척 및 단계를 차단 허용 그러나, 이러한 단계 않을 것 이다 반드시 필요한 경우 잉크젯 인쇄 방법 등을 배열 하는 작은 물방울의 자동화 된 방법을 사용 하 여.
친수성 고분자와 수성 방울 방울 형성 되는 상업적으로 공급된 coverslips의 표면 코팅 nL 751 ±의 직경을가지고 그들에 게 10의 양으로 생산 42 m m. 얼마나 입금된 방울 표면 젖은 해야 제한 또는 스프레드 상한 오일 이므로 최소 두께 아래의 무게로 인해 증가 TIRF 여기 레이저에서 광학 분산. 분산형 배경의 평균 수준을 증가 하 고 단일 분자를 감지 하는 경우 신호를 밖으로 익사 수 있습니다. 항 체 자리도 여기 레이저 빛 부분적으로 또는 완전히 수성 물방울 외부 영역 파업 이후 드롭릿 가장자리에서 위치 되어야 합니다. 중요 한 각도 조건 빛 눈에 띄는 유리-물 인터페이스 반대로 유리 오일 인터페이스에 대 한 더 이상 만난지 않습니다.
정량적 단백질 자리에 바인딩된 단일 분자의 수의 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석을 통해 결정 되어야 합니다. 총 확인 하려면 단일 분자 계산 보정 곡선에서에서 솔루션에서 단백질의 양을 필수 이며 절대적으로 양적 수 기법을 수 있습니다.
Photobleaching를 최소화 하기 위해 관광 명소는 하지 몇 군데 지속적으로 하 고는 TIRF 레이저 소스 전원을 최소화 됩니다. 제시 프로토콜 사용 되었습니다 성공적으로 photostable fluorophores에 대 한 알 렉 사 Fluor 염료와 같은. 대체 fluorophores 사용할 수 있습니다 하지만 photobleaching를 평가 해야 하 고 이미징 프로토콜 적응 필요한 경우. 비록이 확실히 필요한 평형에서 단일 프레임 충분 있다면 바인딩 활동 모색 및 이미징 바인딩 곡선을 재현 하는 시간에 대 한 프레임 당 단일 분자의 총 수를 그릴 수 있습니다.
두 높은 친 화력 항 체의 요구 사항이 있지만,이 매우 민감하고 매우 구체적인 분석 결과, 단일 세포 수준에서 측정을 위한 중요 한 결과. 이 프로토콜에 사용 된 p53 항 체 검출 하는 단일 셀에서 무료 p53에서 잘 최적화 됩니다. 대상 단백질 항 체의 선택에 의해 결정 되 고 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다: 1, 모두 캡처 및 탐지 항 체는 대체 대상; 바인딩할 대체 될 수 있습니다 2, 탐지 항 체는 단백질 단백질 상호 작용을 대체 될 수 있습니다 또는 포스트 번역 상 수정 단백질에 캡처 항 체를, 예를 들어 캡처된 p53;의 인 산화 상태 결정 3, 다중화 분석 실험은 여러 캡처 항 체 관광 명소 가까이에 인쇄 하 여 얻을 수 있습니다-3 × 3 인쇄 자리 배열 10nL 물방울 내에서 가능 하다. 물론, 어떤 대상 단백질 항 체 스크린의 번호 변경에 대 한 제어 및 최적화 해야 합니다 이루어져야.
단일 세포를 lysing 위한 여러 가지 방법은 보고 되었습니다. 33 광 세포는 급속 하 게 단백질 그리고 그들의 복합물의 무결성을 유지 하 고 셀의 내용을 변경 하지 않고 개별 세포를 lyse 화학 무료 방법입니다. 광 유를 사용 하 여 세제를 사용 하 여 화학 세포 작은 물방울의 무결성에 문제가 포즈와 분자 간의 상호 작용을 방해할 수 있습니다. 그러나 34 , 분석 화학 세포는 호환에 대 한 매력적인 접근 이다 레이저 또는 micropatterned 전극 등 장비에 의존 하지 않기 때문. 35
작은 물방울 대체 단일 셀 방법으로 대 등 한 성능을 보여줍니다. 제안 된 p53 항 체를 사용 하 여 작은 물방울의 현재 세대, NSB의 수준에서는 자리 당 187 ± 60 분자입니다. 단일 분자 수 전시 강한 선형성 (R2 = 0.99) 105-108 재조합 형 p53 단백질 방울 당에 걸쳐 지역에서. 이 단백질의 낮은 수준의 세포에서 검색 될 수 있습니다, 하는 동안 거기 105 p53 단백질;의 정량 한계는 제안 이 901 ± 83의 관광 명소에 대 한 단일 분자 횟수에 해당합니다. 이 작은 물방울 및 인터페이스에 흡착의 볼륨에 의해 주로 제한 됩니다. P53 분석 결과의 성과 총 대상 단백질의 0.2% 솔루션;에서 캡처한 10 nL 볼륨 유일한 1.1 ±에서 수행 하는 경우 이 때 0.2 분석 볼륨을 감소 85 ± 9% 증가 nL. 36 1nL 아래에 방울의 볼륨을 감소에 의해 흡착 감소, 잠재력이 있다 p53에 탐지의 한계를 개선 하는 지정 된 항 체를 사용 하 여 < 셀 당 50 단백질. 따라서, 주소 지정이 가능한 방울 단일 셀에서 매우 낮은 풍부한 단백질을 측정 하는 데 사용 될 수가 있다.
쉽게 꿰 뚫을 수 오일 캡에서 제공 하는 물방울의 접근성 셀 분석 볼륨을 순차적으로 도전 될 수 있습니다. micropipette 사용 하 여 볼륨을 크게 증가 하지 않습니다 10-20 pL의 플러그에 각 방울에 셀의 원하는 수 주입 수 있습니다. 표시 그림 1B 에서 100 우물, 작은 물방울을 형성 하 고 단일 세포로 일반적으로 그들을 로드 하는 75-90 분 로드 셀 칩 또한 동심는 micropipette 대신 노즐 튜브 또는 사용 하 여 사용 하 여 작은 물방울에 대응 하 여 얻을 수 있습니다에 대 한 한 처음 작은 물방울을 형성 하는 경우 셀을 포함 하는 솔루션입니다. 후자는 유용할 것 이다 단계 프로토콜에서, 두 경우에서의 수를 제한에 방울 당 인 Poissonian 배포 따라. 이 칩; 당 단일 셀 데이터의 비율을 제한할 것 이다 그러나, 방울 0 개 또는 여러 개의 셀을 컨트롤 역할을 것 이다. 주소 방울을 동심 노즐을 사용 하 여 추가 제한 물방울 볼륨 10nL 단위로 증가할 것 이다. 이 위의 제안 수정 향상 시킬 수 있습니다. 에 칩 물방울 마이크로 높은 주파수에서 방울을 생산 할 수 있으며 생산 방울을 조작 하 고 평면 배열에 순차적으로 입금 Adm 함께 자동으로 되 고 있는 잠재력을가지고 있습니다. 이 확실히 방울의 단일 분자 판독 하면서 또한 Adm의 생산에 한계 극복할 것 이다.
각 개별 물방울 주소 수 가능한 사용의 범위를 하고있다. 우리는 순차적으로 로드 하는 단일 셀 수를 증명 하고있다. 그것은 또한 다른 방법을 사용 하 여 분석에 대 한 피 펫에 의해 바인딩되지 않은 세포 소재 게시물 세포 및 게시물 분석의 제거를 허용 합니다. 이후 분석의 예 정량 실시간 PCR 또는 질량 분석 포함 됩니다.
단일 셀 단백질 분석 양적 접근 하고자 하는 실험실에 대 한 현재 병목 현상 중 하나입니다 높은 기술 장벽 및 특수 장비에 대 한 필요. Adm, 소형화와 높은 감도 분석 미세 칩에 실험실 장치를 조작 하는 클린 룸 시설에 대 한 필요 없이 구현할 수 있습니다. 실험은 칩의 디자인에 의해 제한 되지 않습니다 그리고 그들의 볼륨과 위치는 새로운 주인을 날조를 위한 필요 없이 변경 될 수 있습니다. 물론, 거기에 기술을 단순화 하 고 항 체 및 드롭릿 microarrays 그리고 형광 microplate 리더, 이미지를 인쇄 하려면 그냥 microarrayer 단일 세포 분석에 대 한 항목에 장벽을 낮추는에 개선에 대 한 범위가입니다.
많은 단일 세포 분석의 임상 응용, 특히 암 치료에에서 등장 하고있다. 종양이 효과적인 화학 요법에 대 한 주요 도전 이다. 돌연변이 주파수 증가 함께 발생 하는 종양 개발에서 및 형태학, 유전자,이 발생할 수 있습니다 및 proteomic 가변성. 단일 세포 분석은 종양 내에서 세포이 해결 하 고 이해 하 고 약물 저항 및 가이드 치료를 예측할 수 있도록 플랫폼을 제공할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
ASR는 실험 설계, 프로토콜을 개발 하 고 데이터를 분석. SC와 PS 셀 크기 실험을 수행. ASR와 OC는 원고를 썼다. 저자는 기꺼이 인정 하는 교수 데이비드 R. Klug의 지원 장비에 대 한 액세스를 제공 하고자 합니다. 저자는 제국 대학 고급 Hackspace 제조 및 프로토타이핑 시설에 대 한 액세스를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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