用于活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集体形成高内涵定量的检测方法开发

摘要

我们介绍了一种定量检测错误折叠蛋白质聚集的方法。本方案详细描述了慢病毒诱导的稳定细胞系构建、自动化共聚焦成像以及蛋白质聚集体的图像分析。作为一个示例性应用，我们研究了小分子在时间和剂量依赖性条件下促进SOD1聚集的作用。

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，可由编码铜锌超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因发生遗传性突变引起。SOD1的结构不稳定性以及在家族性ALS患者中检测到SOD1阳性包涵体，提示错误折叠和/或聚集的SOD1可能在ALS的病理过程中发挥致病作用。在本研究中，我们描述了一种基于细胞的检测方法的开发过程，该方法通过高内涵筛选技术定量分析活细胞中SOD1聚集的动力学变化。利用慢病毒载体，我们构建了稳定表达野生型和突变型A4V SOD1（与黄色荧光蛋白融合）的细胞系，发现这两种蛋白均在细胞质中表达，且未出现任何聚集迹象。有趣的是，仅在HEK-293细胞中稳定表达的SOD1 A4V在蛋白酶体抑制剂处理后形成聚集物，而在U2OS或SH-SY5Y细胞系中则未观察到此现象。我们证明，可通过多种蛋白酶体抑制剂的剂量-反应分析定量聚集程度，并利用延时显微镜追踪聚集物形成的动力学过程。本方法为定量评估ALS突变对SOD1在聚集形成中作用提供了可能，同时也可用于筛选抑制SOD1 A4V聚集的小分子化合物。

引言

蛋白质聚集是一种生物学过程，错误折叠的蛋白质通过该过程聚集在一起，可能成为神经退行性疾病（淀粉样变性）的致病因子。表征蛋白质聚集对于理解聚集体在细胞功能障碍中的作用，以及促进发现影响病理发生的新因素至关重要。在活细胞中对荧光标记的蛋白质进行可视化是一种强大的方法，有助于开发适用于高内涵筛选（HCS）的检测技术^1,2,3,4。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）被认为是一种由错误折叠蛋白引起的蛋白质病，这些蛋白具有在家族性ALS（fALS）和散发性ALS（sALS）患者的运动神经元中聚集和累积的倾向^5,6。约20%的fALS病例与编码细胞质抗氧化酶铜锌超氧化物歧化酶1型（SOD1）的基因发生显性突变相关^7,8。针对这种遗传性功能障碍，已提出多种可能机制，包括SOD1突变体在结构和功能上的改变，例如稳定性异常、解折叠速率增加以及聚集倾向增强^9,10。值得注意的是，目前唯一被证实且可能具有毒性的共同特征是ALS相关SOD1突变体与野生型（WT）SOD1均表现出更强的形成区室化蛋白聚集体或蛋白包涵体的倾向^11,12。错误折叠的突变型SOD1会持续被多聚泛素化，并通过泛素-蛋白酶体系统降解。因此，蛋白酶体活性即使受到轻微抑制，也会导致突变型SOD1聚集体的累积^13,14，这些聚集体形成无定形结构，由可溶性组分构成，能够与细胞质中的可溶性突变SOD1进行交换¹⁵。其中，SOD1突变体A4V（第4位密码子的丙氨酸变为缬氨酸）是最常见的致病突变，可导致快速的神经退行性病变，发病后平均生存时间不足2年¹⁶。生化研究表明，SOD1 A4V更易发生单体化、聚集并形成淀粉样孔道结构；其类孔状聚集体与其他疾病相关突变蛋白（如α-突触核蛋白和β-淀粉样蛋白）的淀粉样孔道相似¹⁷。为了研究SOD1聚集体累积的动力学过程，目前仍需建立可监测可溶性与不溶性SOD1聚集体形式的方法。

我们先前利用活细胞成像技术以及瞬时转染了荧光蛋白标记的 SOD1 的 HEK-293 细胞，已证明与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的突变会损害 SOD1 的二聚化并促进其聚集¹¹。尽管瞬时表达系统可提供有关短期基因过表达生物学效应的有用信息，但在检测方法开发中，更倾向于采用可实现目的基因稳定整合的技术。因此，慢病毒载体能够实现哺乳动物细胞中长期且可调控的基因表达¹⁸。在本研究中，我们重点构建了稳定细胞系，并利用携带黄色荧光蛋白（YFP）标记的野生型（WT）和突变型 SOD1 的重组慢病毒进行转导。通过活细胞成像显微镜结合 SOD1 聚集的自动定量分析，我们在蛋白酶体活性被抑制的条件下诱导并量化了 SOD1 的聚集事件。

方案

1. 慢病毒生产

注意：慢病毒载体的制备与操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）关于重组DNA研究的指导原则进行。编码与增强型黄色荧光蛋白（YFP）融合的野生型及A4V突变型SOD1（SOD1WT-YFP和SOD1A4V-YFP）的质粒，详见Kim 等¹¹。两种基因融合产物均使用PCR引物对5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′和5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′进行扩增，并通过XhoI和BsrGI限制性酶切位点插入至pTRIP-delta U3 CMV质粒¹⁹中。在前期实验中，HEK-293T细胞每两天以1:4至1:6的比例传代。避免传代次数超过20代，并将细胞维持在低于60%汇合度，有助于确保较高的转染效率。

1. 第1天，在10 cm直径的组织培养皿中，将HEK-293T细胞以30–40%汇合度进行传代（每皿3 × 10⁶个细胞），加入10 mL细胞培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清和4 mM L-谷氨酰胺），用于病毒生产。
2. 将10 cm直径的组织培养皿置于CO₂培养箱中（37 °C，5% CO₂）过夜培养。
3. 第2天，配制DNA转染液：包含10 µg慢病毒载体（pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP 或 -SOD1A4V-YFP）以及慢病毒包装质粒（5 µg pVSVg；10 µg pCMV-dR8.71）（图2A）²⁰。加入125 µL 1 M CaCl₂，用去离子水定容至500 µL。轻柔加入500 µL 0.05 M HEPES，室温孵育10分钟。
4. 将HEK-293T细胞的培养基更换为10 mL预热的新鲜无抗生素培养基，并与1 mL DNA转染液混合，于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。
5. 第3天，弃去细胞上清液，更换为新鲜培养基。
6. 第4天，收集上清液至15 mL离心管中，以500 × g离心5分钟，去除死细胞和碎片。使用60 mL大容量注射器将上清液通过0.45 µm滤器进一步纯化。立即分装为单次使用量（300 µL/管），于-80 °C保存。为保持产物最高活性，避免反复冻融。

2. 慢病毒转导

1. 将待感染的细胞系（HEK-293细胞和SH-SY5Y细胞：每孔5 × 10⁵个细胞；U2OS细胞：每孔1 × 10⁵个细胞）以60%汇合度接种于6孔组织培养板中，每孔加入2 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。
2. 将6孔组织培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
3. 从-80 °C冰箱中取出冷冻的慢病毒，每次使用前在冰上解冻一份 aliquot；切勿再次冷冻。
4. 在病毒解冻的同时，将适用于目标细胞系的含血清细胞培养基预热。待病毒完全解冻后，在新的1.5 mL离心管中用DMEM制备一系列稀释液（1:3、1:10、1:30和1:100）。
5. 用低血清培养基将各管体积补至1 mL。
6. 向1 mL病毒/培养基混合液中加入2 µL Polybrene（储存浓度为4 µg/µL），通过移液充分混匀，然后将1 mL混合液加入细胞中。与病毒共孵育24小时。
7. 移除含病毒的培养基，更换为含10% FBS的正常DMEM培养基。将细胞维持在37 °C、5% CO₂条件下培养。
8. 观察细胞生长情况，每两天更换一次培养基。当细胞达到汇合状态时，将6孔板中的细胞扩增至直径10 cm的组织培养皿中。
9. 待细胞充分扩增后，将1.5 × 10⁴个细胞接种至384孔检测板中，每孔50 µL DMEM培养基，通过显微镜检测YFP标记蛋白的表达水平。若YFP标记蛋白的细胞表达信噪比≥3，则制备相应细胞系的细胞储备液。

3. 蛋白酶体抑制剂对蛋白质聚集的时间依赖性效应

注意：使用自动显微镜进行图像采集（参见材料）。

1. 在384孔平底板上，每孔加入0.25 µL DMSO或溶于100% DMSO中的蛋白酶体抑制剂（ALLN，2 mM）。
2. 在相同的检测板中，每孔手动接种1.5 × 10⁴个细胞，加入50 µL DMEM培养基。蛋白酶体抑制剂（ALLN）的终浓度应为10 µM。
3. 将显微镜系统环境控制单元设置为37 °C和5% CO₂。实验装置示意图见图3。
4. 以宽场荧光模式操作显微镜，使用软件设置如下：长工作距离20X物镜，非共聚焦模式，每孔拍摄4个视野，拍摄间隔为1小时。每次运行结束后，所采集的图像将自动上传至服务器。

4. 活细胞中YFP表达的延时成像及图像分析（单通道）

注意：以下步骤描述了软件的应用（例如，哥伦布）

1. 选择适当的算法来分割主要对象（细胞质和聚集体）。如有需要，调整背景阈值和对比度参数（图4）。
2. 使用“find cells”功能并设置YFP荧光强度通道的个体阈值为0.1来计数细胞。使用“find spots”算法检测聚集体，设定相对YFP斑点强度>0.2，分裂系数为1.0。

5. 蛋白酶体抑制剂对活细胞中蛋白质聚集的剂量反应效应（细胞核染色，双通道）

注意：使用自动化显微镜进行图像采集。根据预期的IC₅₀值确定蛋白酶体抑制剂（ALLN、Epoxomicin和MG132）的浓度范围，以确保获得最佳的曲线拟合。

1. 在384孔聚丙烯储存板上，使用标准的1:3系列稀释法配制化合物的梯度稀释液。确保充分混匀化合物稀释液，以保证化合物浓度准确。
2. 将0.25 µL蛋白酶体抑制剂分配至空的黑色平底384孔检测板中。我们使用配备可转移微小体积液体的384通道毛细管头的液体处理仪进行操作。
3. 在检测板的每孔中加入50 µL DMEM培养基，接种1.5 × 10⁴个细胞。将检测板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
4. 向每孔加入10 µL预热至37 °C的含染色液的DMEM培养基（Hoechst 33342储备液浓度为10 mg/mL），室温孵育10分钟。
5. 启动显微镜操作软件。图6展示了实验设置的截图。选择"配置"选项卡，选择20X 物镜及正确的板型。确保物镜上的"校正环"设置为对应值，以便在不同板型下实现正确聚焦。
6. 选择"显微镜"选项卡。将曝光1设置为YFP（488激光），曝光2设置为Hoechst（405激光）。在两个曝光通道上均启用滤光片，并将曝光1分配给相机1，曝光2分配给相机2。将曝光时间分别设置为曝光1约800 ms，曝光2约40 ms。
7. 选择曝光1。将聚焦高度设为0 µm。点击"聚焦"。聚焦完成后，启动相机1曝光。调整聚焦高度以优化曝光平面，然后点击"记录高度"。调节曝光时间和激光功率，使最大像素强度约为3,000。保存曝光参数。对曝光2重复上述步骤。
8. 选择"实验定义"选项卡。创建布局和子布局。拖放相关的布局、曝光、参考图像、斜切裁剪文件和子布局。保存实验设置。
9. 选择"自动实验"选项卡并开始采集图像。每次运行结束后，所捕获的图像将自动上传至服务器。

6. 双通道图像的图像分析

1. 选择用于分割主要对象（细胞核、细胞质和聚集体）的软件算法（图7）。
2. 通过目视检查分割结果，选择能够准确分割细胞核的方法。通道1（Ch1）中Hoechst染色的对象将用于确定细胞数量；通道2（Ch2）中突变型SOD1-A4V的YFP染色将用于确定聚集体的量。
3. 使用“寻找细胞核”算法进行细胞计数，设定Hoechst染色区域>20 µm²，分裂因子为7.0，单独阈值为0.40，对比度>0.10。
4. 创建数据表，并利用绘图软件中的“非线性回归”方程计算每种化合物的EC₅₀ 值。

结果

利用慢病毒生成稳定细胞系：监测 SOD1 蛋白聚集物的整体策略如图1所示。首先，我们构建了一种慢病毒表达载体，用于将 SOD1 基因稳定地导入细胞系（步骤1）。构建了两种分别编码 YFP 标签的 SOD1 WT 和 SOD1 A4V 的慢病毒载体（分别为 SOD1WT-YFP 和 SOD1A4V-YFP），并与包装质粒和包膜质粒一同制备（图2A）。经慢病毒转导后（步骤2），所测试的细胞系（HEK-293、U2OS 和 SH-SY5Y）均保持良好生长状态，表现出高水平表达（图2B），且无论 SOD1 的形式如何，YFP 标记均可持续长期存在。有趣的是，在这三种细胞系中，无论是野生型还是突变型 SOD1 均未出现明显的聚集现象，这与此前测试的瞬时表达细胞模型不同¹¹。

讨论

生成稳定细胞系主要有两种方法。第一种方法需要数周时间，涉及瞬时转染以及对基因组整合的质粒DNA载体进行抗性筛选。第二种方法则通过使用慢病毒在数小时内完成，使得该方案能够以较少的工作量实现目标蛋白在多种细胞系中的有效表达。TRIP-CMV载体¹⁹是一种持续性良好的载体，具有稳定的转导效率和稳定的外源基因表达。令我们意外的是，所获得的三种细胞系均未出现突变型SOD1的明显聚集现象，这与先前描述的基于瞬时表达的实验方案形成对比¹¹。很可能是因为瞬时表达在相对较短的时间内产生较高的蛋白表达水平，从而更易导致蛋白聚集。在瞬时转染后，负责降解大多数蛋白质的泛素-蛋白酶体系统会达到饱和状态，其降解易聚集蛋白的能力被完全占用。然而，我们认为稳定细胞系更可能模拟生理状态，即蛋白以相对恒定的水平表达，并与通过蛋白酶体、自噬体-溶酶体途径以及胞吐作用清除错误折叠蛋白的过程相平衡。尽管导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）的初始事件仍不清楚，但与泛素蛋白酶体系统活性下降相关的衰老是一个重要的风险因素²³。正如我们的细胞检测所示...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
表霉素（Epoxomicin, C28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell 软件	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Operetta	Perkin Elmer	OPRT1288
Harmony 成像软件	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Columbus 图像分析软件	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell 液体处理系统	CyBio AG	OL 3387 3 0110