Summary
يصف لنا طريقة للتحديد الكمي لتجميع البروتينات تجمعات. لدينا تفاصيل البروتوكول لينتيفيرال الناجمة عن توليد خط الخلية مستقرة والتصوير الآلي [كنفوكل]، وتحليل الصور من المجاميع البروتين. كتطبيق توضيحية، قمنا بدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة في تشجيع تجميع SOD1 بطريقة تعتمد على وقت وجرعة.
Abstract
التصلب العضلي الجانبي (المرض) هو مرض الأعصاب قاتلة التي يمكن أن تسببها الطفرات موروثة في الجينات ترميز فائق أكسيد النحاس والزنك الفاءق 1 (SOD1). حالة عدم الاستقرار الهيكلي من SOD1 والكشف عن تضمينات SOD1 إيجابية في المرضى الذين يعانون المرض الأسرية تؤيد دور سببية محتملة SOD1 تجمعات و/أو مجمعة في باثولوجيا المرض. في هذه الدراسة، يصف لنا تطوير التحليل يستند إلى الخلية مصممة لقياس القوى المحركة لتجميع SOD1 في الخلايا الحية بالمحتوى العالي من فحص النهج. استخدام ناقلات لينتيفيرال، ونحن إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن SOD1 A4V البرية من نوع ومتحولة معلم مع بروتين فلوري الصفراء، وتبين أن كلا من البروتينات وأبديت في سيتوسول دون أي بادرة للتجميع. من المثير للاهتمام، فقط SOD1 A4V ستابلي المعرب عنها في HEK-293، ولكن ليس في خطوط الخلايا U2OS أو SY5Y ش، شكلت المجاميع عند بروتوزوم مثبط للعلاج. ونحن تبين أنه من الممكن للتحديد الكمي للتجميع على أساس تحليل الجرعة والاستجابة لمختلف بروتوزوم مثبطات، وتتبع الحركية الكلية لتشكيل بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري. ويدخل نهجنا إمكانية التحديد الكمي لأثر حدوث طفرات المرض على الدور SOD1 في تشكيل إجمالي، فضلا عن الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تحول دون تجميع SOD1 A4V.
Introduction
يتم تجميع البروتين تجمعات مجموعة البروتينات تصل عملية بيولوجية من خلالها وقد تكون بمثابة العوامل المسببة في أمراض الأعصاب (الداء النشواني). وصف تجميع البروتين ضروري لفهم دور المجاميع في خلل الخلوية، وكذلك كما هو الحال في تسهيل اكتشاف العوامل الجديدة التي تؤثر في ظهور الأمراض. التصور من معلم fluorescence البروتينات في الخلايا الحية هي طريقة قوية والتي قد تساعد في تطوير فحوصات تنطبق على المحتوى العالي من الفحص (HCS)1،2،،من34.
ويعتبر التصلب العضلي الجانبي (المرض) مرض بروتيوباثيك الناجمة عن وجود تجمعات البروتينات مع الميل إلى تجميع وتتراكم في الخلايا العصبية الحركية في ALS الأسرية (مارا) ومتفرقة ALS (قرضاً)5،6 . وترتبط مجموعة فرعية من ~ 20% حالات مارا مع المهيمنة الطفرات في الجينات ترميز الإنزيم سيتوسوليك المضادة للأكسدة اكتب الفاءق فائق أكسيد النحاس والزنك (SOD1) 17،8. قد اقترحت العديد من الأسباب المحتملة لهذا الخلل وراثيا المشتقة، بما في ذلك التغيرات في هيكل ووظيفة SOD1 المتغيرات، مثل الاستقرار الشاذة، وزيادة معدل تطور، والميل إلى إجمالي9، 10. جدير بالذكر أن الخاصية تم التحقق منها ويمكن أن تكون سامة فقط مشتركة بين كلا الخيارين SOD1 المرتبطة بالمرض والبرية من نوع (WT) SOD1 ميل المتزايد إلى تشكيل المجاميع البروتين مجزأة أو تضمينات البروتينية11،12 . هو إصرار بوليوبيكويتيناتيد المسخ تجمعات SOD1، وتدهورت بسبب نظام ubiquitin-بروتوزوم. نتيجة لذلك على مستوى منخفض من تثبيط النشاط بروتوزوم يؤدي إلى تراكم متحولة SOD1 المجاميع13،14، أي تشكيل هياكل غير متبلور تتألف من مكونات قابلة للذوبان التي يمكن أن تتبادل مع القابلة للذوبان متحولة SOD1 في سيتوسول15. في طافرة SOD1 خاصة، A4V (ألانين في كودون 4 تغيرت إلى فالين) هو الطفرة المسببة للمرض الأكثر شيوعاً، ويؤدي إلى نيوروديجينيريشن السريع مع وقت متوسط البقاء على قيد الحياة أقل من 2 سنوات بعد ظهور المرض16. وقد SOD1 A4V المتحلل، ميل متزايد مونوميريزي وتجميعها وتشكيل المسام اميلويد؛ تتشابه مجاميعه مثل المسام المسام اميلويد أخرى أشكال سلاحف المرتبطة بالمرض، مثل α-سينوكلين وبيتا-اميلويد بروتين17. دراسة ديناميات تراكم SOD1 المجمعة، تظل أساليب لرصد أشكال SOD1 الإجمالية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان التي ستوضع.
أننا أظهرنا سابقا، باستخدام التصوير بخلية يعيش و transfected الخلايا HEK-293 عابر مع نيون SOD1 معلم البروتين، أن الطفرات المرتبطة بالمرض يضر SOD1 ثنائي وتجميع11. على الرغم من أن أنظمة تعبير عابر يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن نتائج قصيرة الأجل الجينات overexpression البيولوجية، قد تكون أساليب توفير تكامل مستقرة من الجينات المرغوبة المفضل للتنمية المقايسة. على هذا النحو، تقدم ناقلات لينتيفيرال القدرة على إضفاء تعبير الجينات الطويلة الأجل والتنظيم في خلايا الثدييات 18. في هذه الدراسة، ركزنا على توليد خطوط الخلايا مستقرة ترانسدوسيد مع المؤتلف lentivirus تحمل وزن والمسخ SOD1 المفتاحية بروتين فلوري الصفراء (يفب). استخدام خلية يعيش التصوير المجهري والكمي الآلي لتجميع SOD1، آثار وكمياً SOD1 تجميع الأحداث على تثبيط بروتوزوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنتاج lentivirus
ملاحظة: إنتاج والتلاعب المتجهات لينتيفيرال نفذت وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث التي تشمل المؤتلف المعاهد الوطنية للصحة (NIH) الحمض النووي. بلازميد الترميز البرية من نوع والمسخ A4V SOD1 المفتاحية يفب المحسن (SOD1WT-يفب و SOD1A4V-يفب) وصف كيم وآخرون. 11 كلا المنتجات الانصهار الجينات تم تضخيمه استخدام زوج التمهيدي PCR 5 ′-أتكجتكتاجاكاككاتجكجاكجاجتكجتجتجك-3 ′ و 5 ′-تاجكج ككجكتاكتجتاكاجكتكجتككاتجكك-3 ′ وإدراجها في CMV U3 بتريب-دلتا بلازميد 19 استخدام مواقع تقييد زهوي وبسرجي. في التجارب السابقة، تم تقسيم الخلايا HEK-293T بنسبة 1:4 إلى 1:6 كل يومين. تجنب أكثر من 20 من الممرات والحفاظ على الخلايا في أقل 60% يساعد على كونفلوينسي لضمان الكفاءة تعداء جيدة.
- في اليوم 1، تقسيم الخلايا HEK-293T في التقاء 30-40% في صفيحة زراعة الأنسجة قطرها 10 سم (3 × 10 6 خلايا/طبق) في 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة (دميم عالية-جلوكوز 10% FBS و 4 مم L-الجلوتامين) لإنتاج الفيروس.
- تبقى لوحة زراعة الأنسجة قطرها 10 سم في حاضنة 2 CO (37 درجة مئوية، 5% CO 2) بين عشية وضحاها.
- في اليوم 2، تعد حلاً تعداء الحمض النووي الذي يحتوي على 10 ميكروغرام من ناقلات لينتيفيرال (دلتا بتريب U3 CMV-SOD1WT-يفب-أو SOD1A4V-يفب) جنبا إلى جنب مع لينتيفيرال التعبئة والتغليف (البلازميدات (5 ميكروغرام من بفسفج؛ 10 ميكروغرام من بكمف-dR8.71) الشكل 2 (أ)) 20-إضافة 125 ميليلتر كاكل 1 م 2، وضبط مستوى الصوت إلى 500 ميليلتر باستخدام الماء المقطر. إضافة 500 ميليلتر من 0.05 "م حبيس" في الخليط برفق واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- استبدال HEK-293T الخلايا المتوسطة مع 10 مل المعالجون مسبقاً الطازجة المتوسطة ثقافة خالية من المضادات الحيوية مختلطة مع 1 مل الحمض النووي تعداء الحل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
- في اليوم 3، تحل محل الخلية طافية مع الطازجة الثقافة المتوسطة. حصاد
- في يوم 4، المادة طافية في أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 غرام x لإزالة الخلايا الميتة والحطام. كذلك تنقية المادة طافية بتمرير ذلك من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر استخدام المحاقن كبيرة 60 مل. فورا الاستغناء عن إلى مختبرين تستخدم مرة واحدة (300 ميليلتر)، وتخزينها في-80 درجة مئوية. للمحافظة على النشاط المنتج كحد أقصى، وتجنب دورة تجميد أذاب.
2. توصيل لينتيفيرال
- تقسيم خط الخلية تصاب في التقاء 60% (ش-SY5Y؛ وخلايا HEK-293 5 × 10 5 خلايا كل بئر و U2OS؛ 1 × 10 5 خلايا كل بئر) في صفيحة زراعة الأنسجة 6-جيدا في 2 مل من وسائط الإعلام دميم وتستكمل مع 10% FBS.
- إبقاء لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية في 5% CO 2 بين عشية وضحاها.
- إزالة lentivirus المجمد من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد قاسمة على الجليد قبل كل استخدام؛ وعدم تجميد.
- في حين أن الفيروس هو ذوبان الجليد، الحارة المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على المصل متوافقة مع خط الخلية للفائدة. حالما يتم إذابة الفيروس تماما، إعداد مجموعة من تخفيف (1:3، 01:10، 01:30، و 1: 100) في دميم في أنبوب [ميكروفوج] جديدة 1.5 مل.
- إحضار وحدة التخزين في الأنابيب إلى 1 مل مع انخفاض مصل وسائط الإعلام-
- إضافة 2 ميليلتر من بوليبريني (في مخزون من 4 ميكروغرام/ميليلتر) إلى 1 مل من الفيروسات/وسائل الإعلام. مزيج جيد من قبل بيبيتينج وإضافة 1 مل مخلوط إلى الخلايا. احتضان الخلايا مع الفيروس ل 24 h.
- قم بإزالة الوسائط الفيروس واستبدال وسائط دميم العادي وتستكمل مع 10% FBS. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO 2-
- رصد نمو الخلايا وتغيير وسائل الإعلام ثقافة كل يومين. في التقاء، توسيع الطبق 6-جيدا في طبق استنبات الأنسجة قطرها 10 سم.
- بمجرد توسيع نطاق الخلايا بما فيه الكفاية، معلم البذور 1.5 × 10 4 خلايا كل بئر في 50 ميليلتر وسائل الإعلام دميم على لوحات المقايسة 384-جيدا للتحقق من مستوى التعبير يفب البروتين بالفحص المجهري. إذا كان معلم يفب التعبير الخلية البروتين يظهر نسبة الإشارة إلى الضوضاء ≥ 3، إعداد مخزون الخلية لخط الخلية المقابلة.
3. الوقت تأثير مثبط بروتوزوم تعتمد على تجميع البروتين
ملاحظة: إجراء الحصول على الصور مجهر الآلي باستخدام (انظر المواد).
- الاستغناء عن 0.25 ميليلتر من المانع [دمس] أو بروتوزوم حله في [دمس] 100% (اللن, 2 مم) على ألواح قاع مسطح 384-جيدا- الاعتداء الإعلامي
- يدوياً بذور 1.5 × 10 4 خلايا كل بئر في 50 ميليلتر من دميم على نفس اللوحة. ينبغي أن يكون تركيز مثبط (اللن) بروتوزوم النهائية 10 ميكرون.
- إعداد وحدة التحكم البيئي نظام المجهر إلى 37 درجة مئوية و 5% CO 2. لقطة شاشة لبرنامج الإعداد التجريبية هو المبين في الشكل 3-
- تشغيل المجهر في وضع الأسفار الميدانية على نطاق واسع، باستخدام البرنامج مع الإعدادات التالية: LWD 20 × الهدف، وضع غير [كنفوكل]، حقول 4/جيدا، مع فاصل زمني التقاط لمدة ساعة. في نهاية كل تشغيل، يتم تحميل الصور التي تم التقاطها تلقائياً إلى الملقم.
4. وقت التصوير مرور للتعبير يفب في الخلايا الحية، وصورة التحليل (قناة واحدة)
ملاحظة: تصف الخطوات التالية تطبيق البرمجيات (مثل كولومبوس).
خوارزمية- حدد المناسبة لتقسيم الكائنات الأولية (سيتوسول ومجاميع). إذا لزم الأمر، ضبط خلفية العتبة وتباين المعلمات ( الشكل 4).
- حساب عدد الخلايا باستخدام ' العثور على خلايا ' مع حد فردية من 0.1 للقناة كثافة يفب. تحديد المجاميع باستخدام ' العثور على بقع ' الخوارزمية بكثافة بقعة يفب نسبي > 0.2 ومعامل تقسيم 1.0.
5. جرعة استجابة تأثير مثبطات بروتوزوم على تجميع البروتين في الخلايا الحية الملون لما نوى (قناتين)
ملاحظة: الحصول على الصور باستخدام مجهر الآلي أداء. تحديد نطاق تركيز مثبطات بروتوزوم (اللن وابوكسوميسين و MG132) استناداً إلى القيمة 50 IC المتوقعة لضمان تناسب منحنى أمثل.
لوحة تخفيف المسلسل- تحضير المركبات في روبلين تخزين 384-جيدا بالمعيار 1:3 إضعاف السلسلة. تأكد من خلط تخفيف المركب جيدا لضمان دقة تركيزات المركب.
- الاستغناء عن 0.25 ميليلتر من مثبطات بروتوزوم على لوحات مسطحة القاع سوداء فارغة 384-جيدا المقايسة. نحن نستخدم معالج سائل مجهزة برأس 384-الشعرية القادرة على نقل كميات.
- البذور 1.5 × 10 4 خلايا كل بئر في 50 ميليلتر دميم وسائل الإعلام على ألواح المقايسة. احتضان لوحات الفحص في 37 درجة مئوية و 5% CO 2 ل 24 h.
- إضافة 10 ميليلتر دميم وسائط الإعلام (استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية) وتلطيخ الحل (هويشت 33342 في مخزون من 10 ملغ/مل) واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 شن
- مايكروونالتغلب على تشغيل البرامج. ويرد في الشكل 6 لقطة شاشة لبرنامج الإعداد التجريبية. حدد " التكوين " علامة التبويب، وحدد 20 × الهدف ونوع اللوحة الصحيحة. ضمان " طوق " يتم تعيين إلى القيمة الصحيحة على هدف السماح التركيز السليم مع أنواع مختلفة من لوحة.
- حدد " المجهر " علامة التبويب تعريف التعرض 1 يفب (488 الليزر) والتعرض 2 هويشت (405 الليزر). تنشيط عامل التصفية على حد سواء التعرض وتعيين التعرض 1 كاميرا 1 والتعرض 2 للكاميرا 2. تعيين أوقات التعرض إلى ms ~ 800 للتعرض 1 و ms ~ 40 للتعرض 2-
- تحديد التعرض 1. تعيين ارتفاع التركيز إلى 0 ميكرومتر. حدد " التركيز ". مرة واحدة وتركز، الكشف عن الكاميرا 1. ضبط ارتفاع التركيز تحسين التعرض للطائرة، وانقر فوق " أن ارتفاع ". تغيير أوقات التعرض والليزر السلطة لإعطاء كثافة بكسل كحد أقصى من ~ 3000. حفظ معلمات التعرض. تكرار للتعرض 2-
- تحديد " "تعريف التجربة" " علامة التبويب إنشاء تخطيط وسبليت. سحب وإسقاط التخطيط ذات الصلة، والتعرض، صورة مرجع وملف سكيوكروب، وسوبلايوت. حفظ التجربة.
- تحديد " "التجربة التلقائية" " علامة التبويب، والحصول على الصور. في نهاية كل تشغيل، يتم تحميل الصور التي تم التقاطها تلقائياً إلى الملقم.
6. صورة تحليل الصورتين قناة
- تحديد خوارزمية برنامج لتجزئة الكائنات الأولية (نويات، سيتوسول، ومجاميع) ( الشكل 7).
- حدد الأسلوب الذي شرائح الأنوية بدقة بالفحص البصري لكائنات مجزأة. سيتم استخدام الكائنات الملطخة هويشت في القناة 1 (Ch1) لتحديد عدد الخلايا. تلطيخ يفب من المسخ SOD1-A4V في القناة 2 (Ch2) سيستخدم لتحديد مقدار المجاميع.
- حساب عدد الخلايا باستخدام ' العثور على نواة ' الخوارزمية كمناطق تلطيخ هويشت > 20 ميكرومتر 2، مع عامل انقسام 7.0، عتبة فردية من 0.40، وعلى النقيض من > 0.10.
- إنشاء جدول البيانات وتحديد المفوضية الأوروبية 50 لكل من المركبات تستخدم ' الانحدار غير الخطية ' المعادلة في برامج الرسوم البيانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خط الخلية مستقرة المدرة باستخدام لينتيفيروس: الاستراتيجية العامة لرصد المجاميع البروتين SOD1 يتضح في الشكل 1. في خطوة أولى، ونحن إنشاء ناقل تعبير لينتيفيرال لإيصال الجينات مستقرة SOD1 في خطوط الخلايا (الخطوة 1). بين الموجهات لينتيفيرال ترميز المعلمة يفب WT SOD1 و SOD1 A4V (يفب SOD1WT و SOD1A4V-يفب، على التوالي) مع مغلف والتعبئة وأعدت والبلازميدات (الشكل 2A). عند توصيل لينتيفيرال (الخطوة 2) الخلية ظلت خطوط المختبرة (HEK-293 و U2OS و SH-SY5Y) مستويات التعبير عالية صحية، أظهر (الشكل 2)، والطويلة الأجل يفب وصفها بغض النظر عن شكل SOD1. من المثير للاهتمام، لا وزن لا طافرة SOD1 المعرب عنها في خطوط الخلايا الثلاث التي أظهرت تجميع مرئية، على النقيض من الطراز الخلوي تعبير عابر سبق اختبار11.
خلية مستقرة Validating خطوط التجميع SOD1 ودراسة ديناميتها: لتحريك تشكيل SOD1 الكلي إلى تراكم الخلوية لتجمعات SOD1 المسخ، استخدمنا مثبط بروتوزوم اللن (وتسمى أيضا كالبين الأول والثاني المانع؛ كي = 190 و 220 نانومتر على التوالي)، وتم التحقق من صحتها قبل استخدام نموذج خلوية تعبير11SOD1 عابرة. تم بحث التجميع SOD1 مع خطوط الخلايا HEK-293، و U2OS، و SY5Y ش ترانسدوسيد SOD1WT-يفب ويفب SOD1A4V. المعالجة بمثبطات بروتوزوم اللن (10 ميكرون) لترقية 24 ساعة بشدة تراكم المجاميع SOD1A4V-يفب في HEK-293 الخلايا (الشكل 2). ومع ذلك، تم العثور على لا التجميع في SOD1WT-يفب ترانسدوسيد تم العثور على خطوط الخلايا ومستويات منخفضة جداً من التجميع في U2OS وخطوط الخلايا SH-SY5Y SOD1A4V-يفب ترانسدوسيد يفب SOD1WT و SOD1A4V-يفب (الشكل 2). بناء على هذه الملاحظات، استخدمنا الوقت الفاصل بين الفحص المجهري للتحقيق دينامية تشكيل تجميع يفب SOD1A4V الناجمة عن تثبيط بروتوزوم (الخطوة 3، الرقم 3) والتحديد الكمي لتجميع SOD1A4V-يفب الأسفار يفب واحد باستخدام قناة كشف عن الخلايا والمجاميع في الخلايا الحية (الخطوة 4، الرقم 4). خلايا المصنف في وجود وغياب اللن، ورصد لمدة 50 ساعة (الشكل 5A). لدينا ظروف تجريبية، وجدنا تشكيل الإجمالية الناجمة عن اللن التوصل إلى هضبة في 24 ساعة وظلت مستقرة خلال ال 12 ساعة القادمة. نظهر أن كثافة الخلايا انخفض إلى حد كبير بعد 28 ساعة نتيجة لتأثير السامة للخلايا من اللن، بينما زاد عدد الخلايا في هذه التجربة السلبية المعالجة [دمس].
جزيء صغير الذي المفوضية الأوروبية 50 لتكوين التجميع باستخدام SOD1 الخلية نموذج: خلايا معربا عن SOD1A4V-يفب يعاملون بطريقة تعتمد على الجرعة مع مثبطات بروتوزوم جزيء صغير. استخدمنا علامة نووية لتسمية خط الخلية يفب SOD1A4V، ومفيد للكشف الكلي داخل المقصورة سيتوسول. وفي الواقع، منذ كل خلية تحتوي على نواة، بتجزئة الأنوية واستخدامها كالبذور في مستجمعات المياه تقسيم الخلايا، هو تجزئة السيتوبلازم مبسطة21. كنا تلطيخ هويشت، الذي يعرف لا سمية عند استخدامها لفترة قصيرة الأجل وفي تركيزات منخفضة22، الظروف التي لم تستخدم في الفاصل الزمني السابق تصوير التجربة. بعد 24 ساعة من استزراع الخلايا وجود مثبطات بروتوزوم، SOD1A4V-يفب الخلايا كانت ملطخة هويشت الحل (10 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقائق. القادم اكتسبناها الصور fluorescence هويشت ويفب استخدام هدفا غ 20 X 0.4 (الخطوة 5، الشكل 6). باستخدام خوارزمية تحليل صورة الذي يأخذ في الاعتبار في نواة الخلية وتوزيع SOD1A4V-يفب، حللت الخلايا باستخدام برمجيات تحليل الصورة (الخطوة 6، رقم 7). وحددت الكائنات الملطخة هويشت العارضة شدة الفلورسنت المناسبة أعلاه الخلفية والخصائص المورفولوجية حجم نويات (العرض والطول والمنطقة) ومصنفة حسب تجزئة الصورة. واستخدمت قناع النووية المستمدة من تلطيخ هويشت لتتبع توزيع بقعة SOD1A4V-يفب الدانية داخل منطقة سيتوسوليك الخلية وتحديد وجود أو عدم وجود المجاميع. استناداً إلى الكشف عن نوى والبقع، حسبت نسبة المجاميع اكتشاف مقابل الخلايا. لتحديد حساسية الفحص لدينا، نحن كمياً بعد تجميع الخلايا SOD1A4V-HEK يفب-293 تعامل مع ثلاثة مثبطات بروتوزوم مختلفة (اللن و MG132 وابوكسوميسين) بطريقة تركيز جرعة مما مكن تركيب البيانات الكمية و قمنا بحساب قيم EC50 ± 6.53 1.17، 0.17 ميكرون ± 0.03 ± 0.06، و 0.03 اللن و MG132 وابوكسوميسين، على التوالي (8B الشكل). وكان كمياً سمية النسبي لجميع مثبطات بروتوزوم ثلاثة بقياس عدد الخلايا ملتصقة المتبقي في البئر المسمى بصبغ هويشت. ووجدنا أن عدد مجموع الخلايا تميل إلى الانخفاض في التصدي للآثار المركبة، كما يتضح من المفوضية الأوروبية50 قيم مماثلة من 6.58 ± 1.06، ± 0.03، و 0.05 ± 0.01 ميكرومتر 0.19 اللن و MG132 وابوكسوميسين، على التوالي.
رقم 1. سير العمل والجدول الزمني لتوليد خط الخلية وتحليل محتوى عالية (HCA) لتجميع البروتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. وزن SOD1 وتوليد خط مستقر A4V.
(أ) رسم تخطيطي لناقلات لينتيفيرال والتغليف (البلازميدات التعبئة ويات) لتوليد لينتيفيروس SOD1 A4V نوع البرية والمسخ. (ب) تحديد الصور [كنفوكل] من ثلاث خلايا (HEK-293 و U2OS و SH-SY5Y) ترانسدوسيد مع نوع البرية lentivirus SOD1 (WT) والمسخ SOD1 (A4V). (ج) علاج الصور التمثيلية لثلاث خلايا مستقرة 24 ساعة مع مثبط بروتوزوم، اللن (10 μm). SOD1A4V-يفب المجاميع وتبين أن وفرة الحالية (الأسهم الحمراء) في HEK-293، ولكن قليلة موجودة في الخلايا U2OS أو SH-SY5Y. الصور تم الحصول عليها باستخدام هدفا X 20. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. أربعة الخطوات اللازمة لتحليل الصورة من التجميع باستخدام قناة يفب للكشف عن الخلايا والمجاميع.
(1) استيراد الصور من نظام تخزين وتحليل البيانات الصورة. (2) حدد البحث الخلايا لعد الخلايا. (3) حدد "البحث عن النقاط" لتحديد المجاميع. (4) تحديد النتائج استناداً إلى كل خوارزمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5. تثبيط بروتوزوم مما يؤدي إلى تراكم المجاميع يفب SOD1A4V في خلايا HEK-293.
(أ) تحديد الصور [كنفوكل] SOD1A4V-HEK يفب-293 الخلايا تعامل مع 10 ميكرون من اللن. (ب) التحليل الكمي لتشكيل التجميعية التي يسببها مع اللن (10 μm) وخلية تحسب بطريقة تعتمد على الوقت. الصور تم الحصول عليها هدفا LWD 20 X كل 60 دقيقة الحجم باستخدام شريط = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. شاشة طلقة مجموعة تجريبية حتى لاثنين قناة اقتناء (يفب وهويشت). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7. أربعة الخطوات اللازمة لتحليل الصورة SOD1 المجاميع والخلايا المسمى مع يفب وهويشت.
(1) إدخال الصور من نظام تخزين وتحليل البيانات الصورة. (2) حدد البحث نواة لعد الخلايا. (3) حدد "البحث عن النقاط" لتحديد المجاميع. (4) تحديد النتائج استناداً إلى كل خوارزمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 8. التحليل الكمي لتجميع SOD1 A4V وتركيز مثبط بروتوزوم تعتمد على الجرعة.
(أ) هنا يقدم الصورة وأسلوب التحليل الكمي للبقع وخلية تحسب باستخدام نظام تحليل الصورة كولومبوس. الصور المقابلة لقناتين الفلورسنت محددة إلى هويشت (Ch1) واقتنى تسلسلياً يفب (Ch2). وحددت تجزئة الصورة الملطخة هويشت الكائنات (إلى اليسار). تم تطبيق قناع النووي (وسط) مشتقة من خوارزمية البحث نويات "حساب عدد الخلايا، متبوعاً بقناع بقعة (يمين)" البحث عن النقاط "الخوارزمية المستخدمة للكشف عن المجاميع. (ب) جرعة الدراسة استجابة لتأثير مثبطات بروتوزوم على تجميع طافرة SOD1 A4V، مما يدل على مرتبة50 EC متغير من 6.53 ميكرومتر، اللن، إلى 0.17 ميكرون ل MG132، و 0.03 ميكرون اكسبوكسوميسين. تحديد الصور [كنفوكل] للمسخ بروتوزوم A4V SOD1 تعامل بتركيز50 EC. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك نهجين رئيسيين لتوليد خطوط الخلايا مستقرة. يستغرق عدة أسابيع الأولى ويتطلب التحديد تعداء ومقاومة عابرة موجهات الدنا الجينومي بلازميد المتكاملة. الثاني يأخذ بضع ساعات من خلال استخدام lentivirus، مما يجعل هذا البروتوكول قابلاً للتعبير الفعال عن البروتين المستهدف في عدة أسطر الخلية مع جهد محدود. وكان ناقل CMV رحلة19 ناقل المطرد لاستخدامها، مع كفاءة توصيل المصانة والتعبير التحوير مستقرة. لدهشتنا، أظهرت خطوط الخلايا الثلاث التي تم إنشاؤها بوصف لا تجميع مرئية للمسخ SOD1، خلافا للبروتوكول التجريبي يستند التعبير عابر سابق11. ومن المرجح أن تعبير عابر تفضل تجميع البروتين كما أنها تنتج أعلى تعبير البروتين في فترة قصيرة نسبيا من الزمن. عند تعداء عابر، نظام ubiquitin – بروتوزوم، الذي يحط من قدر أغلبية بروتينات، تصل إلى نقطة التشبع الذي قدرته للحط من البروتينات المعرضة لتجميع الاستفادة التامة. ومع ذلك، نؤكد أن خطوط مستقرة على الأرجح استنساخ الحالة الفسيولوجية التي يتم التعبير عن البروتينات عند مستوى ثابت نسبيا الذي يتطابق مع القضاء على تجمعات البروتين عن طريق بروتوزوم، أوتوفاجوسومي-يحلول، و الرقابة. على الرغم من أن الأحداث الرئيسية التي أدت إلى المرض لا تزال غير معروفة، الشيخوخة فيما يتصل بانخفاض النشاط لنظام بروتوزوم أوبيكويتين، هو عامل خطر كبير23. كما يتضح من أعمالنا المقايسة الخلوية، يعزز تثبيط بروتوزوم بتجميع تجمعات البروتين (SOD1 A4V). على هذا النحو، هذا التحليل يخلق فرصاً جديدة الشاشة لتفعيل جزيء صغير من أوتوفاجي مما يشير إلى مسار أو الشبكة وصي. والواقع أن هذا السبيل لتحريض وصي يبدو واعداً، كما يتضح من التقرير من كيران et al. ، تبين أن المعاملة مع محفز المشارك للحرارة وجد استجابة صدمة لها فوائد علاجية بتمديد عمر SODG93A 24من الفئران.
من المهم أن نذكر أن هناك عثرات قليلة في الاعتبار قبل استخدام هذا الفحص. كما هو الحال مع البروتوكول الأمثل المقايسة، وجدنا أن تركيزات [دمس] 1% أو أعلى يزيد متوسط كثافة يفب المقاسة في أعمالنا المقايسة. ولذلك من المهم تقليل التركيز [دمس] 0.5% لتجنب أي الحرفية هذه. وعلاوة على ذلك، اختيار عدسة التكبير وكثافة الخلية في لوحة الفحص هامة النظر إلى تحسين متانة المقايسة.
وقد أظهرنا في هذه الدراسة، أن استخدام نظام لينتيفيرال، خط الخلية SOD1A4V-HEK يفب-293 أيضا مناسبة لرصد متحولة SOD1 A4V تشكيل الكلية بناء على تحريض من مثبطات بروتوزوم. دراسة تجمعات البروتين والتجميع أساسية لفهم آليات بروتينوباثيس. على الرغم من أن أدوات البحث لتحليل البروتين التجميع قد توسعت في العقود الماضية، نهج فعالة لكشف وتحديد التجميع مطلوبة لجزيئات الشاشة التي تحظر تشكيل التجميعية. هذا العمل يوفر بروتوكول مفصل للتحليل والدراسات لتجميع البروتين. نأمل، مع الدعم من HCS، أمازيغية واستعمال المواد الكيميائية أو مكتبات كريسبر/siRNA، هذا العمل ينبغي أن تفتح سبلاً جديدة لاكتشاف الهدف المداواة أو رواية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنحه ممولة من الحكومة الكورية (مسيب) (جبهة الخلاص الوطني-2014K1A4A7A01074642)، وبرنامج دعم العلماء الفردية الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) (جبهة الخلاص الوطني-2013M3A9B5076486/جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
