Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aggregation fehlgefaltete Proteine. Unsere Protokolldetails Lentivirale induzierte stabile Zellgeneration Linie, automatisierte konfokale Bildverarbeitung und Bildanalyse von Proteinaggregaten. Als anschauliche Anwendung haben wir untersucht die Wirkung kleiner Moleküle bei der Förderung der SOD1-Aggregation in einer Zeit und Dosis-abhängigen Weise.
Abstract
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödliche Neurodegenerative Erkrankung, die durch vererbte Mutationen im gen Kodierung Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) verursacht werden können. Die strukturelle Instabilität des SOD1 und die Erkennung von SOD1-positiver Einschlüsse in familiärer ALS-Patienten unterstützt eine mögliche ursächliche Rolle für fehlgefaltete und/oder aggregierte SOD1 ALS Pathologie. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung eines zellbasierte Assays entwickelt, um die Dynamik der SOD1-Aggregation in lebenden Zellen zu quantifizieren durch hohen Gehalt screening Ansätze. Mit Lentivirale Vektoren, erzielten wir stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck Wildtyp und Mutanten A4V SOD1 getaggt mit gelb fluoreszierende Protein und festgestellt, dass beide Proteine im Cytosol ohne Anzeichen einer Aggregation zum Ausdruck gebracht wurden. Interessanterweise nur SOD1 A4V stabil ausgedrückt in HEK-293, aber nicht in U2OS oder SH-SY5Y Zelllinien gebildet Aggregate Proteasom-Inhibitor Behandlung. Wir zeigen, dass es möglich ist, basierend auf Dosis-Wirkungs-Analyse der verschiedenen Proteasom-Inhibitoren Aggregation zu quantifizieren und Aggregat-Formation Kinetik von Time-Lapse Mikroskopie zu verfolgen. Unser Ansatz stellt die Möglichkeit der Quantifizierung des Effekts ALS Mutationen auf die Rolle des SOD1 in Aggregatbildung sowie screening für kleine Moleküle, die SOD1 A4V Aggregation verhindern.
Introduction
Proteinaggregation ist ein biologischer Prozess, durch den misfolded Proteine Gruppe auf und kann als Erreger bei neurodegenerativen Erkrankungen (Amyloidose) handeln. Charakterisierung von Proteinaggregation ist unerlässlich für das Verständnis der Rolle von Aggregaten in zellulären Dysfunktion ebenso wie bei die Entdeckung der neuen Faktoren, die Einfluss auf den Beginn der Pathologie, zu erleichtern. Die Visualisierung der Fluoreszenz-markierten Proteine in lebenden Zellen ist eine leistungsfähige Methode, die bei der Entwicklung von Assays für high Content screening (HCS)1,2,3,4unterstützen kann.
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) gilt als eine Proteopathic Erkrankung, die durch die Anwesenheit von fehlgefaltete Proteine mit der Neigung zu aggregieren und reichern sich in motorischen Neuronen in familiäre ALS (fALS) und sporadisch ALS (sALS)5,6 . Eine Teilmenge von ~ 20 % der Fälle fALS sind verbunden mit dominanten Mutationen im gen Kodierung der cytosolischen antioxidative Enzym Kupfer-Zink-Superoxid-Dismutase Typ 1 (SOD1)7,8. Mehrere mögliche Ursachen für diese genetisch abgeleiteten Dysfunktion sind vorgeschlagen worden, einschließlich Änderungen in der Struktur und Funktion des SOD1-Varianten, z. B. abweichende Stabilität erhöhte sich entfaltenden Rate und Neigung zur aggregierten9, 10. Vor allem, die einzige geprüfte und potentiell toxische Eigenschaft geteilt durch beide ALS verknüpft SOD1-Varianten und Wildtyp (WT) SOD1 ist eine erhöhte Neigung zu unterteilte Proteinaggregaten oder proteinhaltige Einschlüsse11,12 . Fehlgefaltete mutierte SOD1, ist beharrlich Polyubiquitinated und durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Infolgedessen führt ein niedriges Niveau der Hemmung der Proteasom-Aktivität zur Anhäufung von mutierte SOD113,14, aggregiert die amorphe Strukturen der löslichen Komponenten zusammengesetzt, die mit löslichen mutierte SOD1 austauschen können in der Zellflüssigkeit15. In bestimmten, SOD1 Mutanten A4V (Alanin am Codon 4 geändert, Valin) ist die am häufigsten ALS verursachende Mutation und führt zu schnellen Neurodegeneration mit eine durchschnittliche Überlebenszeit von weniger als 2 Jahre nach Krankheit Beginn16. Biochemisch, hat SOD1 A4V eine zunehmende Tendenz zu monomerize, zu aggregieren und zu bilden Amyloide Poren; die Pore-ähnliche Aggregate sind ähnlich wie Amyloid Poren der anderen Krankheit verbunden mutierten Formen, wie z. B. α-Synuclein und β-Amyloid-Protein17. Um die Dynamik des SOD1-Aggregat Anhäufung zu studieren, noch Methoden zur Überwachung von löslicher und unlöslicher SOD1 zusammengefasster Forms entwickelt werden.
Wir haben bereits gezeigt, mit live Cell Imaging und HEK-293-Zellen transfiziert vorübergehend mit fluoreszierenden Protein-Tags SOD1, dass ALS-assoziierten Mutationen SOD1 Dimerisierung und Aggregation11beeinträchtigt. Obwohl transiente Expressionssysteme nützliche Informationen über den biologischen Ausgang des kurzfristigen gen Überexpression bereitstellen können, können Methoden, die eine stabile Integration der gewünschten Gene für Assay-Entwicklung vorzuziehen. Als solche bieten Lentivirale Vektoren die Möglichkeit, langfristige und regulierten Genexpression auf Säugerzellen 18verleihen. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von stabilen Zelllinien mit rekombinanten Lentivirus Lager WT ausgestrahlt und mutierten SOD1 getaggt mit gelben fluoreszierenden Proteins (YFP). Mit live Cell imaging Mikroskopie und automatisierte Quantifizierung der SOD1-Aggregation, wir ausgelöst und quantifiziert SOD1-Aggregation-Veranstaltungen bei der Hemmung des Proteasoms.
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Protocol
1. Lentivirus Produktion
Hinweis: die Produktion und Bearbeitung von Lentivirale Vektoren erfolgte nach den Richtlinien des National Institute of Health (NIH) für Forschung am rekombinanten DNA. Die Plasmid-Codierung, in denen der Wildtyp und A4V mutierte SOD1 mit verstärkten YFP (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP) markiert sind in Kim Et al. beschrieben. 11 beide Gene Fusion Produkte wurden verstärkt mit Hilfe der PCR Primerpaar 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ und 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ und in der pTRIP-Delta U3 CMV eingefügt Plasmid 19 mit XhoI und BsrGI Restriktionsschnittstellen. In früheren Experimenten wurden die HEK-293T Zellen in einem Verhältnis von 1:4 bis 1:6 alle zwei Tage aufgeteilt. Vermeidung von mehr als 20 Passagen und Wartung von Zellen weniger 60 % confluency hilft, gute Transfektion Effizienz zu gewährleisten.
- On Tag1, HEK-293T Zellen am Zusammenfluss von 30-40 % in einem Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Teller (3 x 10 6 Zellen/Gericht) in 10 mL Zellkulturmedium (High-Glukose DMEM mit 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für Virus Produktion teilen.
- Halten die 10 cm Durchmesser Gewebekultur Platte über Nacht in eine CO 2 Inkubator (37 ° C, 5 % CO 2).
- Am Tag2, bereiten Sie eine DNA-Transfektion Lösung enthält 10 µg Lentivirale Vektoren (pTRIP-Delta U3 CMV - SOD1WT-YFP oder -SOD1A4V-YFP) zusammen mit der Lentivirale Verpackung Plasmide (5 µg pVSVg; 10 µg pCMV-dR8.71) () Abbildung 2A) 20. 125 µL 1 M CaCl 2 hinzufügen und stellen Sie die Lautstärke auf 500 µL mit destilliertem Wasser. Sanft fügen 500 µL 0,05 M HEPES in die Mischung und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Ersetzen HEK-293T Zellen Medium mit 10 mL vorgewärmten frisches Kulturmedium antibiotikafreien gemischt mit 1 mL DNA-Transfektion Lösung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO 2.
- Am 3. Tag, ersetzen Sie die Zelle überstand mit frischem Nährmedium.
- Am Tag 4, Ernte den Überstand in ein 15 mL Tube und Zentrifuge für 5 min bei 500 X g, die toten Zellen und Schutt zu entfernen. Weiter zu reinigen Sie den Überstand indem man es durch einen 0,45 µm-Filter mit einer großen 60 mL Spritze. Sofort in Einweg-Aliquote (300 µL), und bei-80 ° c lagern Damit maximale Produkt Tätigkeit, einen Gefrier-Tau-Zyklus zu vermeiden.
2. Lentivirale Transduktion
- die Zelle Trennlinie an 60 % Einmündung ansteckungsverdächtigen (HEK-293-Zellen und SH-SY5Y; 5 x 10 5 Zellen pro Bohrloch und U2OS; 1 x 10 5 Zellen pro Well) in einer Gewebekultur 6-Well-Platte in 2 mL DMEM Medien ergänzt mit 10 % FBS.
- Halten die Gewebekultur 6-Well-Platte in einem Inkubator 37 ° C um 5 % CO 2 Übernachtung.
- Entfernen Sie die gefrorenen Lentivirus von-80 ° C Gefrierschrank und eine aliquote auf dem Eis vor jedem Gebrauch auftauen; nicht wieder einfrieren.
- Während der Virus Auftauen ist, warm das Zellkulturmedium, enthält das Serum kompatibel mit der Zell-Linie von Interesse. Sobald das Virus vollständig aufgetaut ist, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen (1:3, 01:10, 01:30 und 1: 100) in DMEM in einem frischen 1,5 mL Microfuge Rohr.
- Bringen Sie die Lautstärke in den Rohren zu 1 mL mit reduzierten Serum Medien.
- Add 2 µL des Polybrene (bei einem Bestand von 4 µg/µL) zu 1 mL der Virus/Medien. Mischen Sie gut durch pipettieren und die Zellen fügen Sie 1 mL der Mischung hinzu. Inkubation der Zellen mit dem Virus für 24 h
- Entfernen Sie die Virus-Medien und ersetzen Sie mit normalen DMEM Medien ergänzt mit 10 % FBS. Halten die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO 2.
- Das Wachstum der Zellen zu überwachen und ändern die Nährmedien alle zwei Tage. Am Zusammenfluss, erweitern die 6-Well-Schale in einer Gewebekultur 10 cm Scheibendurchmesser.
- , Wenn die Zellen ausreichend erweitert wurden, 1,5 x 10 4 Samenzellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf 384-Well-Assay Platten Ausdruck der die YFP zu überprüfen, das Protein von Mikroskopie getaggt. Wenn die YFP Proteinexpression Zelle markiert zeigt ein Signal-Rausch-Verhältnis ≥ 3, bereiten Sie Zelle bestand für die entsprechende Zellinie.
3. Zeit-abhängige Wirkung der Proteasom-Inhibitor auf Proteinaggregation
Hinweis: Bildaufnahme mit einem automatisierten Mikroskop durchführen (siehe Material).
- 0,25 µL DMSO oder Proteasom-Inhibitor, aufgelöst in 100 % DMSO (ALLN, 2 mM) auf Flachboden 384-Well-Platten zu verzichten.
- Manuell 1,5 x 10 4 Samenzellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf demselben assay Platte. Die Endkonzentration der Proteasom-Inhibitor (ALLN) sollte 10 µM.
- Richten Sie das Mikroskop Umwelt Anlagensteuerung auf 37 ° C und 5 % CO 2. Ein Screenshot von der Versuchsanordnung ist in Abbildung 3 dargestellten.
- Betreiben das Mikroskop im weiten Feld Fluoreszenz-Modus, mit Hilfe der Software mit den folgenden Einstellungen: LWD 20 X Ziel, nicht-konfokale Modus, 4 Felder/Brunnen, mit einem Capture-Intervall von einer Stunde. Am Ende jeder Fahrt aufgenommenen Bilder automatisch auf den Server hochgeladen werden.
4. Zeit Ablauf Bildgebung für YFP Ausdruck in lebenden Zellen und Bildanalyse (Einkanal)
Hinweis: die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Software (z.B. Columbus).
- Wählen Sie den entsprechenden Algorithmus zur Segmentierung der Primärobjekte (Zytosol und Aggregate). Bei Bedarf passen Sie Parameter zur Schwelle "und" Kontrast von Hintergrund ( Abbildung 4).
- Anzahl Zellen mit ' Zellen finden ' mit einem individuellen Schwellenwert von 0,1 für die YFP Intensität Kanal. Bestimmen Aggregate mit ein ' Flecken zu finden ' Algorithmus mit einer relativen YFP spot Intensität > 0,2 und eine Spaltung Koeffizient der 1.0.
5. Dosis-Antwort-Wirkung von Proteasom-Inhibitoren auf Proteinaggregation an lebenden Zellen gebeizt für ihre Kerne (zwei Kanäle)
Hinweis: führen Sie mit einem automatisierten Mikroskop Bildaufnahme. Bestimmen den Konzentrationsbereich der Proteasom-Inhibitoren (ALLN, Epoxomicin und MG132) basierend auf dem erwarteten IC 50 Wert um eine optimale Kurve Sitz zu gewährleisten.
- Prepare Verdünnungsreihen von Verbindungen auf einem 384-Well Storage Polypropylen Platte durch den Standard Verdünnungsreihe 1:3. Achten Sie darauf, die zusammengesetzten Verdünnungen mischen gut um sicherzustellen, dass die zusammengesetzte Konzentrationen korrekt sind.
- Auf 0,25 µL Proteasom-Inhibitoren auf leere flach-Boden schwarz 384-Well-Assay Platten verzichten. Wir verwenden einen liquiden Handler, ausgestattet mit einem 384-Kapillare Kopf fähig Bände zu übertragen.
- Samen 1,5 x 10 4-Zellen pro Bohrloch in 50 µL DMEM Medien auf Assay Platten. Inkubieren der Assay-Platten bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 24 Std.
- Fügen Sie 10 µL DMEM Medien (bei 37 ° C vorgewärmt) mit Färbelösung (Hoechst 33342 auf einen Bestand von 10 mg/mL) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 min.
- Starten die microsBetriebssoftware zu bewältigen. Ein Screenshot von der Versuchsanordnung ist in Abbildung 6 dargestellt. Wählen Sie die " Konfiguration " Registerkarte, und wählen Sie 20 X Objektiv und die richtige Plattenart. Stellen Sie sicher " Kragen " befindet sich auf den richtigen Wert auf das Ziel, so dass korrekte Fokussierung mit verschiedenen Plattenarten.
- Wählen Sie die " Mikroskop " tab. definieren Exposition 1 als YFP (488 Laser) und Exposition 2 als Hoechst (405 Laser). Aktivieren Sie den Filter auf beiden Belichtungszeiten und Kamera 1 und 2 gegenüber Kamera 2 weisen Sie Exposition 1 zu. Belichtungszeiten auf ~ 800 ms für Exposition 1 gesetzt und ~ 40 ms für Exposition 2.
- Select Exposition 1. Legen Sie Fokus Höhe auf 0 µm. Select " Fokus ". Nachdem sich konzentriert, setzen Sie Kamera 1. Die Fokus-Höheneinstellung zur Optimierung der Belichtung Ebene und klicken auf " Höhe ". Ändern Sie die Belichtungszeiten und laser-Kraft, um eine maximale Pixel-Intensität von ~ 3.000 geben. Belichtungsparameter zu retten. Wiederholte Exposition 2.
- Select " Experiment Definition " tab. erstellen Sie ein Layout und Sublayout. Drag & drop die entsprechenden Layout, Belichtung, Referenzbild, Skewcrop Datei und Sublayout. Speichern Sie das Experiment.
- Select " automatische Experiment " Registerkarte, und Bilder zu erwerben. Am Ende jeder Fahrt aufgenommenen Bilder automatisch auf den Server hochgeladen werden.
6. Bildanalyse von zwei-Kanal-Bilder
- Wählen Sie den Softwarealgorithmus zur Segmentierung der Primärobjekte (Kerne, Zellflüssigkeit und Aggregate) ( Abbildung 7).
- Wählen Sie die Methode, die Kerne genau durch Sichtkontrolle der segmentierten Objekte Segmente. Hoechst-gefärbten Objekte in Kanal 1 (Ch1) werden verwendet werden, um die Anzahl der Zellen bestimmen. Die YFP Färbung von das mutierte SOD1-A4V in Kanal 2 (Ch2) verwendet wird, um die Menge von Aggregaten bestimmen.
- Graf Zellen unter Verwendung der ' Kerne zu finden ' Algorithmus als Hoechst-Färbung Regionen > 20 µm 2, mit einem Split-Faktor von 7.0, eine individuelle Schwelle von 0,40 und einen Kontrast > 0,10.
- Die Datentabelle erstellen und bestimmen EG 50 für jede der Verbindungen mit den ' nicht-lineare Regression ' Gleichung in der Grafik-Software.
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Representative Results
Generierung von stabile Zelllinie Lentivirus verwenden: Die Gesamtstrategie für die Überwachung der SOD1-Protein-Aggregate ist in Abbildung 1dargestellt. In einem ersten Schritt erzielten wir ein Lentivirale Expressionsvektor SOD1 stabile gen Lieferung in Zelllinien (Schritt 1). Zwei Lentivirale Vektoren Codierung YFP getaggt SOD1 WT und SOD1 A4V (SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP, beziehungsweise) mit Verpackung und Umschlag Plasmide wurden vorbereitet (Abbildung 2A). Nach Lentivirale Transduktion (Schritt2) der Zelle blieb Linien getestet (HEK-293, U2OS und SH-SY5Y) gesund, zeigten hohe Expression Ebenen (Abbildung 2 b) und langfristige YFP Kennzeichnung unabhängig von der SOD1-Form. Interessanterweise WT weder mutierten SOD1 ausgedrückt in den drei Zelllinien, die sichtbare Aggregation, im Gegensatz zu den Transienten Expression cellular Modell zeigte zuvor getestet11.
Validating stabile Zelle Linien für SOD1-Aggregation und seiner Dynamik zu studieren: Wir verwendet um SOD1 Aggregatbildung auf zellulären Akkumulation von fehlgefaltete SOD1 Mutanten auszulösen, Proteasom-Inhibitor ALLN (auch genannt Calpain I und II-Hemmer; Ki = 190 und 220 nM bzw.), zuvor validierten mit einer vorübergehenden SOD1 Ausdruck cellular Modell11. SOD1 Aggregation wurde mit HEK-293, U2OS und SH-SY5Y Zelllinien ausgestrahlt mit SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP untersucht. Behandlung mit Proteasom-Inhibitor ALLN (10 µM) für 24 Stunden die Anhäufung von SOD1A4V-YFP Aggregate in HEK-293-Zellen (Abbildung 2) stark gefördert. Jedoch ergab keine Aggregation in SOD1WT-YFP ausgestrahlt, Zell-Linien und sehr niedrige Niveaus von Aggregation fand sich in U2OS und SH-SY5Y Zelllinien SOD1A4V-YFP ausgestrahlt SOD1WT-YFP und SOD1A4V-YFP (Abbildung 2). Aufgrund dieser Beobachtungen, verwendeten wir Zeitraffer-Mikroskopie, die Dynamik des SOD1A4V-YFP Aggregation Bildung induziert durch Proteasom-Hemmung (Schritt 3, Abbildung 3) zu untersuchen und zu quantifizieren, SOD1A4V-YFP Aggregation mit einer einzigen YFP Fluoreszenz Kanal, der mit dem Ausdruck ihrer Zellen und Aggregate in lebenden Zellen (Schritt 4, Abbildung 4) zu erkennen. Zellen wurden in an- und Abwesenheit von ALLN entkernt und für einen Zeitraum von 50 Stunden (Abb. 5A) überwacht. Unter unseren experimentellen Bedingungen fanden wir die Aggregatbildung induziert durch ALLN ein Plateau bei 24 Stunden erreicht und blieb über die nächsten 12 Stunden. Wir zeigen, dass Zelldichte erheblich nach 28 Stunden durch die zytotoxische Wirkung von ALLN, zurückgegangen während Handynummer in das DMSO-behandelten negative Experiment zugenommen.
Characterizing niedermolekularer EG 50 für Aggregation Bildung mit SOD1 Handy-Modell: Mit dem Ausdruck SOD1A4V-YFP Zellen wurden in einer Dosis-abhängigen Weise mit kleinen Molekül Proteasom-Inhibitoren behandelt. Wir haben einen nuklearen Marker SOD1A4V-YFP Zelllinie, beschriften, die was vorteilhaft für die aggregierte Erkennung in das Zytosol Fach ist. Da jede Zelle einen Zellkern enthält durch Segmentierung der Kerne und sie als Samen in der Wasserscheide Segmentierung der Zellen, nämlich Zytoplasma Segmentierung vereinfachte21. Früher Hoechst Färbung, die bekannt ist haben wir keine Toxizität bei Verwendung für einen kurzfristigen Zeitraum und bei niedrigen Konzentrationen22, Bedingungen, die nicht in der vorherigen Zeitraffer imaging Experiment verwendet wurden. Nach 24 Stunden der Zelle Kultivierung im Beisein von Proteasom-Inhibitoren waren mit Hoechst-Lösung (10 µg/mL) für 10 min SOD1A4V-YFP Zellen befleckt. Als nächstes haben wir Fluoreszenzbilder für Hoechst und YFP mit einem 20 X 0,4-NA-Ziel (Schritt 5, Abbildung 6) erworben. Verwenden einen Bild-Analyse-Algorithmus, der die Zellkerne und SOD1A4V-YFP Verteilung berücksichtigt, wurden Zellen mit der Bildanalyse-Software (Schritt 6, Bild 7) analysiert. Hoechst-gefärbten Objekte ausstellen der entsprechenden fluoreszierenden Intensität über Hintergrund und die morphologischen Größe Merkmale einer Kerne (Breite, Länge und Fläche) wurden identifiziert und klassifiziert nach Bild Segmentierung. Die nukleare Maske von Hoechst Färbung abgeleitet wurde, die proximale SOD1A4V-YFP spot Verteilung innerhalb der cytosolischen Zellbereich zu verfolgen und zu bestimmen, das Vorhandensein oder Fehlen von Aggregaten verwendet. Basierend auf Erkennung von Kernen und Flecken, errechnete sich ein Verhältnis von Aggregaten im Vergleich zu Zellen erkannt. Um die Empfindlichkeit von unseren Test zu bestimmen, wir als nächstes quantifiziert Aggregation von SOD1A4V-YFP HEK-293-Zellen behandelt mit drei verschiedenen Proteasom-Inhibitoren (ALLN, MG132 und Epoxomicin) in einer Dosis-Konzentration-Weise, die Anpassung der quantifizierten Daten aktiviert und Wir berechnete EG50 Werte von 6,53 ± 1,17, 0,17 ± 0,06 und 0,03 ± 0,03 µM für ALLN, MG132 und Epoxomicin, bzw. (Abbildung 8 b). Die relative Toxizität für alle drei Proteasom-Inhibitoren wurde quantifiziert durch die Messung der Anzahl von adhärenten Zellen bleiben in den Brunnen mit Hoechst Farbstoff gekennzeichnet. Wir fanden, dass die gesamte Zellzahl als Reaktion auf zusammengesetzte Auswirkungen zu verringern, tendenziell wie ähnliche EG50 Werte von 6.58 ± 1.06, 0,19 ± 0,03 und 0,05 ± 0,01 µM für ALLN, MG132 und Epoxomicin, bzw. belegt.
Abbildung 1: Workflow und Zeitplan für die Zellinie Generation und hohe Inhaltsanalyse (HCA) Proteinaggregation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. SOD1 WT und A4V stabile Linie Generation.
(A) schematische Darstellung der Vektoren Lentivirale und Verpackung (Verpackung und Umschlag Plasmide) für Wildtyp und mutierte SOD1 A4V Lentivirus Generation. (B) ausgewählte konfokale Bilder von drei Zellen (HEK-293, U2OS und SH-SY5Y) ausgestrahlt mit dem Wildtyp Lentivirus SOD1 (WT) und mutierten SOD1 (A4V). (C) repräsentative Bilder aus drei stabilen Zellen für 24 h mit dem Proteasom-Inhibitor, ALLN (10µM) behandelt. SOD1A4V-YFP Aggregate fanden sich reichlich zu präsentieren (rote Pfeile) in HEK-293, aber dünn in U2OS oder SH-SY5Y Zellen vorhanden. Bilder wurden mit einem 20 X Objektiv erworben. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Die vier Schritte zur Bildanalyse der Aggregation über den YFP Kanal zur Erkennung von Zellen und Aggregate.
(1) importieren Sie Bilder aus dem Bild Daten-Speicherung und Analyse-System. (2) wählen Sie "Zellen suchen" zum zählen von Zellen. (3) wählen Sie "find Spots" Aggregate zu bestimmen. (4) Ergebnisse basierend auf jeder Algorithmus zu definieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Proteasom-Hemmung führt zur Anhäufung von SOD1A4V-YFP Aggregate in HEK-293-Zellen.
(A) ausgewählte konfokale Bilder SOD1A4V-YFP HEK-293-Zellen mit 10 µM von ALLN behandelt. (B) Quantitative Analyse der Aggregatbildung mit ALLN (10µM) induziert und Zelle zählt in einem Zeit-abhängigen Weise. Bilder erworben wurden, mit einem LWD 20 X Objektiv alle 60 min. Skala bar = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Screenshot des experimentellen Set up für zwei--Erwerb (YFP und Hoechst Kanal). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7. Die vier Schritte zur Bildanalyse von SOD1-Aggregate und Zellen mit YFP und Hoechst beschriftet.
(1) Bilder aus dem Bild Daten-Speicherung und Analyse-System. (2) wählen Sie "suchen Kerne" zum zählen von Zellen. (3) wählen Sie "find Spots" Aggregate zu bestimmen. (4) Ergebnisse basierend auf jeder Algorithmus zu definieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8. Quantitative Analyse der SOD1 A4V Aggregation und dosisabhängige Proteasom-Inhibitor-Konzentration.
(A) hier stellen wir Ihnen das Bild und Quantifizierung Analysemethode für Spots und Zelle zählt mit der Columbus-Bildanalysesystem. Bilder, fluoreszierende zweikanalig, die spezifisch für Hoechst (Ch1) entspricht und YFP (Ch2) nacheinander erworben wurden. Hoechst-gefärbten Objekte (links) wurden von Bild-Segmentierung identifiziert. Die nukleare Maske (Mitte) aus der "finden Kerne" Algorithmus abgeleitet wurde angewandt, um die Anzahl der Zellen, gefolgt von der spot Maske (rechts) "Orte suchen" Algorithmus verwendet, um Aggregate zu erkennen. (B) Dosis Antwort Studie über das Proteasom-Inhibitoren Wirkung auf Aggregation mutierte SOD1 A4V, die eine Variable EG-50 -Ranking von 6,53 µM, ALLN, 0,17 µM für MG132 und 0,03 µM für Expoxomicin zeigt. Ausgewählte konfokale Bilder der mutierte SOD1 A4V behandelt Proteasom bei EC50 Konzentration. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es gibt zwei Hauptansätze zur Erzeugung von stabilen Zelllinien. Die erste dauert mehrere Wochen und erfordert eine transiente Transfektion und Widerstand Auswahl der genomischen integriertes Plasmid DNA-Vektoren. Die zweite ist eine Sache von Stunden durch den Einsatz von Lentivirus, dieses Protokoll in mehreren Zelllinien mit geringem Aufwand für den Ausdruck des Zielproteins zugänglich machen. Die Reise-CMV-Vektor-19 war ein nachhaltiges Vektor mit konservierten Transduktion Effizienz und stabile Transgene Ausdruck verwenden. Zu unserer Überraschung zeigte die drei Zelllinien erzeugt keine sichtbare Aggregation der das mutierte SOD1, im Gegensatz zu den experimentellen Protokoll basierend auf Transienten Expression früher11beschrieben. Es ist wahrscheinlich, dass Transienten Expression Proteinaggregation begünstigt, wie es höheren Protein-Expression in relativ kurzer Zeit produziert. Auf transiente Transfektion erreicht das Ubiquitin-Proteasom-System, das einen Großteil der Proteine abbaut, eine Sättigung bei denen ihre Handlungsfähigkeit Aggregat neigende Proteine degradieren voll genutzt wird. Aber wir behaupten, dass stabile Linien sind wahrscheinlicher, die physiologische Situation zu reproduzieren, in denen Proteine relativ konstant, die Beseitigung von fehlgefaltete Proteine über das Proteasom entspricht, ausgedrückt werden, Autophagosome-Lysosomen und Exozytose. Obwohl die primäre Ereignisse an ALS noch unbekannt sind, ist die Alterung in Verbindung mit verminderte Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems, ein signifikanter Risikofaktor23. Wie unsere zelluläre Assays, fördert Proteasom-Hemmung die Aggregation von fehlgefaltete Proteine (SOD1 A4V). So, schafft dieser Assay neue Möglichkeiten für kleine Molekül Aktivatoren die Autophagozytose Signalisierung Weg oder das Chaperon-Netzwerk auf den Bildschirm. In der Tat, diese Allee für Chaperon Induktion scheint vielversprechend, wie gezeigt durch den Bericht von Kieran Et Al. zeigen, dass die Behandlung mit eine Co-Induktor der Hitze Hitzeschock-Antwort wurde festgestellt, dass therapeutische Vorteile haben durch Verlängerung der Lebensdauer von SODG93A Mäuse-24.
Es ist wichtig zu erwähnen, dass es ein paar Fallstricke gibt zu prüfen, bevor Sie mit diesem Test. Wie mit dem Assay-Optimierung-Protokoll, fanden wir, dass die Konzentrationen von DMSO auf 1 % oder höher steigt die mittlere Intensität der gemessenen YFP in unserem Test. Es ist daher wichtig, die Konzentration von DMSO auf 0,5 % zur Vermeidung solcher Artefakte zu reduzieren. Die Auswahl der Objektiv-Vergrößerung und Zelldichte in der Assay-Platte sind darüber hinaus wichtig zu prüfen, um die Robustheit des Assays zu optimieren.
In unserer Studie haben wir gezeigt, dass mit einem Lentivirale System, die SOD1A4V-YFP HEK-293-Zell-Linie gut geeignet für die Überwachung der mutierte SOD1 A4V Aggregatbildung auf Induktion von Proteasom-Inhibitoren. Die Studie fehlgefaltete Proteine und Aggregation ist unerlässlich für das Verständnis der Mechanismen der Proteinopathies. Obwohl die Recherche-Tools für die Analyse von Proteinaggregation in den letzten Jahrzehnten erweitert wurden, müssen effiziente Ansätze zu erkennen und zu quantifizieren, Aggregation Bildschirm-Moleküle, die Aggregatbildung zu verbieten. Diese Arbeit liefert ein detailliertes Protokoll für Assay-Entwicklung und Studien Proteinaggregation. Hoffentlich, sollte diese Arbeit mit der Unterstützung von HCS, HCA und Verwendung von Chemikalien oder CRISPR/SiRNA Bibliotheken, neue Wege für die Therapie oder Roman Ziel Entdeckung öffnen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) und der National Research Foundation of Korea (NRF) einzelnen Wissenschaftler Förderprogramm (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
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