Summary
Descriviamo un metodo per quantificare l'aggregazione delle proteine misfolded. I nostri dettagli di protocollo lentivirali indotto generazione linea cellulare stabile, imaging confocale automatizzata e l'analisi di immagine di aggregati proteici. Come un'applicazione illustrativa, abbiamo studiato l'effetto di piccole molecole nel promuovere l'aggregazione di SOD1 nel tempo - e dose-dipendente.
Abstract
Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è una malattia neurodegenerative mortale che può essere causata da mutazioni ereditarie nel gene codifica dello rame-zinco superossido dismutasi 1 (SOD1). L'instabilità strutturale della SOD1 e il rilevamento delle inclusioni di SOD1-positivi nei pazienti di ALS familiare supporta un potenziale ruolo causale per SOD1 misfolded e/o aggregate in patologia di ALS. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di un'analisi basata su celle progettato per quantificare la dinamica di SOD1 aggregazione in cellule viventi di alto contenuto approcci di screening. Utilizzo di vettori lentivirali, abbiamo generato linee cellulari stabili che esprimono wild-type e mutante SOD1 A4V etichettati come proteina fluorescente gialla e trovato che entrambe le proteine sono state espresse nel citosol senza alcun segno di aggregazione. È interessante notare che, solo SOD1 A4V stabilmente espressa in HEK-293, ma non in linee cellulari di U2OS o SH-SY5Y, formano aggregati al trattamento con un inibitore del proteasoma. Mostriamo che è possibile quantificare aggregazione basata sull'analisi di dose-risposta di vari inibitori del proteosoma e per tenere traccia di cinetica di formazione di aggregati da microscopia time-lapse. Il nostro approccio introduce la possibilità di quantificare l'effetto delle mutazioni ALS sul ruolo della SOD1 nella formazione di aggregati così come screening per piccole molecole che impediscono l'aggregazione A4V SOD1.
Introduction
L'aggregazione di proteine è un processo biologico mediante il quale misfolded gruppo di proteine fino e può agire come agenti causativi nelle malattie neurodegenerative (amiloidosi). Che caratterizzano l'aggregazione proteica è essenziale nella comprensione del ruolo degli aggregati in disfunzione cellulare anche come facilitare la scoperta di nuovi fattori che influenzano l'insorgenza della patologia. La visualizzazione delle proteine fluorescenza-etichettate in cellule viventi è un metodo potente che può essere di aiuto nello sviluppo di saggi applicabili al contenuto elevato di screening (HCS)1,2,3,4.
Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è considerata come una malattia proteopathic causata dalla presenza di proteine misfolded con la propensione ad aggregare e si accumulano in motoneuroni ALS familiare (fALS) sia sporadico di ALS (SLAs)5,6 . Un sottoinsieme di ~ 20% dei casi di fALS sono associati con le mutazioni dominanti nel gene che codifica per l'enzima antiossidante citosolico rame-zinco superossido dismutasi di tipo 1 (SOD1)7,8. Sono state proposte diverse possibili cause per questa disfunzione geneticamente derivata, compreso i cambiamenti nella struttura e nella funzione di SOD1 varianti, quali stabilità aberrante, tasso aumentato di spiegamento e propensione all'aggregazione9, 10. In particolare, l'unica proprietà verificata e potenzialmente tossico condiviso da entrambe le varianti di ALS-collegato SOD1 e wild type (WT) SOD1 è una tendenza aumentata a formare aggregati proteici compartimenti o inclusioni proteiche11,12 . Misfolded mutante SOD1, é costantemente poliubiquitinate e degradato dal sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, un basso livello di inibizione del proteasoma conduce all'accumulazione del mutante che SOD1 aggrega13,14, quali strutture amorfe di forma è composta da componenti solubili che possono scambiare con SOD1 mutante solubile nel citosol15. In particolare, SOD1 mutante A4V (alanina a codone 4 cambiato a valina) è la mutazione più comune causa di ALS e conduce alla neurodegenerazione di tipo rapido con un tempo di sopravvivenza medio di meno di 2 anni dopo la malattia inizio16. Biochimicamente, SOD1 A4V ha un'aumentata tendenza al monomerize, aggregare e formare pori dell'amiloide; i poro-come i complessi sono simili a pori dell'amiloide di altre forme mutanti legate alla patologia, come α-synuclein e β-amiloide proteina17. Per studiare la dinamica di accumulo di SOD1-aggregato, metodi per il monitoraggio solubili e insolubili forme di aggregazione SOD1 rimangono per essere sviluppato.
Precedentemente abbiamo indicato, usando la formazione immagine di cellule vive e cellule HEK-293 transfected transitoriamente con fluorescente contrassegnati proteina SOD1, che mutazioni associate a ALS alterano SOD1 dimerizzazione e aggregazione11. Anche se i sistemi di espressione transiente possono fornire utili informazioni circa l'esito biologico della sovraespressione genica a breve termine, metodi fornendo integrazione stabile dei geni desiderati possono essere preferiti per sviluppo di analisi. Come tale, vettori lentivirali offrono la possibilità di conferire l'espressione genica a lungo termine e regolata su cellule di mammifero 18. In questo studio, ci siamo concentrati sulla generazione di linee cellulari stabilizzate trasformata con lentivirus ricombinanti WT del cuscinetto e mutante SOD1 contrassegnati con la proteina fluorescente gialla (YFP). Utilizzando cellule vive imaging microscopia e quantificazione automatizzata dell'aggregazione di SOD1, abbiamo attivato e quantificato SOD1 tra gli eventi di aggregazione all'inibizione del proteasoma.
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Protocol
1. produzione di lentivirus
Nota: la produzione e la manipolazione di vettori lentivirali è stato effettuato secondo le direttive del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca che coinvolge ricombinante DNA. Il plasmide che codifica la wild-type e mutante A4V SOD1 taggati con avanzata YFP (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP) sono descritti in Kim et al. 11 entrambi prodotti di fusione del gene sono stati amplificati utilizzando la coppia di primer PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ e 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ e inserito il CMV di U3 pTRIP-delta plasmide 19 utilizzo XhoI e BsrGI siti di restrizione. In precedenti esperimenti, le cellule HEK 293T sono state spaccate con un rapporto di 1:4 a 1:6 ogni due giorni. Evasione di più di 20 passaggi e mantenimento delle cellule a meno 60% e confluenza aiuta ad assicurare l'efficienza di trasfezione buona.
- Il giorno 1, dividere le cellule HEK 293T confluenza di 30-40% in una piastra di coltura del tessuto di diametro di 10 cm (3 x 10 6 cellule/piatto) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (alto-glucosio DMEM con 10% FBS e 4 mM L-Glutammina) per la produzione di virus.
- Tenere la coltura del tessuto 10 cm diametro piastra in un incubatore a CO 2 (37 ° C, 5% CO 2) durante la notte.
- Il giorno 2, preparare una soluzione di transfezione del DNA contenente 10 µ g di vettori lentivirali (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP o - SOD1A4V-YFP) insieme con i vettori lentivirali imballaggio (plasmidi (5 µ g di pVSVg; 10 µ g di pCMV-dR8.71) Figura 2A) 20. Aggiungere 125 µ l di 1 M CaCl 2 e regolare il volume a 500 µ l con acqua distillata. Delicatamente aggiungere 500 µ l di 0,05 M HEPES nell'impasto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Sostituisci HEK-293T cellule medio con 10 mL pre-riscaldato fresco mezzo di coltura privo di antibiotico misto con 1 mL di soluzione di transfezione del DNA e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2.
- Il giorno 3, sostituire la cella surnatante con terreno di coltura fresco.
- Il giorno 4, raccogliere il surnatante in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 500 x g per rimuovere le cellule morte e detriti. Purificare ulteriormente il surnatante facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 µm utilizzando una siringa grande 60 mL. Immediatamente dispensare in aliquote monouso (300 µ l) e conservare a-80 ° C. Per mantenere l'attività massima del prodotto, evitare un ciclo di congelamento-scongelamento.
2. Trasduzione lentivirale
- dividere la linea cellulare di essere infetti alla confluenza del 60% (cellule HEK-293 e SH-SY5Y; 5 x 10 5 cellule per pozzetto e U2OS; 1 x 10 5 cellule per pozzetto) in una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti in 2 mL di terreno DMEM completate con 10% FBS.
- Tenere la piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° C 5% CO 2 durante la notte.
- Rimuovere i lentivirus congelati dal congelatore-80 ° C e scongelare un'aliquota sul ghiaccio prima di ogni utilizzo; non ricongelare.
- Mentre il virus è lo scongelamento, riscaldare il mezzo di coltura cellulare contenente siero compatibile con la linea cellulare di interesse. Una volta che il virus è completamente scongelato, preparare una serie di diluizioni (1:3, 01:10, 01:30 e 1: 100) in DMEM in un tubo di microfuge fresco 1,5 mL.
- Portare il volume nei tubi a mL 1 con media di siero riduttore.
- Add 2 µ l di Polybrene (presso un magazzino di 4 µ g / µ l) di 1 mL di virus e media. Miscelare bene pipettando e aggiungere 1 mL di miscela per le cellule. Incubare le cellule con il virus per 24 h.
- Rimuovere il supporto di virus e sostituire con normale media DMEM supplementato con 10% FBS. Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2.
- Monitorare la crescita delle cellule e cambiare il cultura media ogni due giorni. Confluenza, espandere il piatto 6 pozzetti in una piastra di coltura del tessuto del diametro di 10 cm.
- Una volta che le cellule sono state ampliate in modo sufficientemente, seme 1.5 x 10 4 cellule per bene in 50 µ l di media DMEM su piastre 384 pozzetti test per verificare il livello di espressione della YFP contrassegnato come proteina da microscopia. Se il YFP proteina cellulare espressione tagged Mostra un rapporto segnale-rumore ≥ 3, preparare il brodo di cella per la corrispondente linea cellulare.
3. Tempo dipendente effetto dell'inibitore del proteosoma su aggregazione proteica
Nota: effettuare l'acquisizione immagine utilizzando un microscopio automatizzato (Vedi materiali).
- Dispensare 0,25 µ l di DMSO o proteasoma inibitore disciolti in 100% DMSO (ESGONALE, 2mm) sulle piastre di fondo piatto 384 pozzetti.
- Manualmente le cellule 4 seme 1.5 x 10 per pozzetto in 50 µ l di DMEM media sulla stessa piastra di dosaggio. La concentrazione finale di proteasoma inibitore (ESGONALE) dovrebbe essere di 10 µM.
- Impostare l'unità di controllo ambientale del sistema di microscopio a 37 ° C e 5% CO 2. Uno screenshot del setup sperimentale è illustrato nella Figura 3.
- Operare al microscopio in modalità di fluorescenza ampio campo, utilizzando il software con le seguenti impostazioni: LWD 20 X obiettivo, modalità non-confocale, 4 campi/bene, con un intervallo di acquisizione di un'ora. Alla fine di ogni esecuzione, le immagini catturate vengono automaticamente caricate sul server.
4. Tempo di formazione immagine lasso per espressione di YFP in cellule viventi e analisi (singolo canale) dell'immagine
Nota: I passaggi seguenti descrivono l'applicazione del software (ad es., Columbus).
- Selezionare l'appropriato algoritmo per segmentare gli oggetti primari (citosol e aggregati). Se necessario, regolare i parametri di soglia e contrasto sfondo ( Figura 4).
- Numero di celle utilizzando ' trovare le celle ' con una soglia individuale di 0.1 per il canale di intensità YFP. Determinare gli aggregati utilizzando un ' trovare macchie ' algoritmo con un'intensità relativa di spot YFP > 0,2 e un coefficiente di suddivisione di 1.0.
5. Effetto di reazione di inibitori del proteasoma su aggregazione della proteina in cellule viventi che hanno macchiato per loro nuclei (due canali) della dose
Nota: effettuare l'acquisizione immagine utilizzando un microscopio automatizzato. Determinare l'intervallo di concentrazione di inibitori del proteasoma (ESGONALE, epoxomicina e MG132) sulla base del valore di 50 IC previsto per garantire una calzata ottimale curva.
- Preparare diluizioni seriali di composti su un polipropilene deposito 384 pozzetti della piastra dallo standard serie di diluizione di 1:3. Assicurarsi di mescolare le diluizioni mescola bene per garantire che le concentrazioni di composte siano accurate.
- Versare 0,25 µ l di inibitori del proteasoma sulle piastre di vuoto fondo piatto nero 384 pozzetti dosaggio. Usiamo un gestore liquido equipaggiato con una testa di 384-capillare in grado di trasferire volumi.
- Seme 1.5 x 10 4 cellule per pozzetto in 50 µ l di DMEM Media sulle piastre di dosaggio. Incubare le piastre di dosaggio a 37 ° C e 5% di CO 2 per 24 h.
- Aggiungere 10 μl di DMEM Media (preriscaldato a 37 ° C) con la macchiatura soluzione (Hoechst 33342 a uno stock di 10 mg/mL) e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Lanciare il microsfar fronte software operativo. Uno screenshot del setup sperimentale è illustrato nella Figura 6. Selezionare il " configurazione " scheda e selezionare 20X obiettivo e il tipo di lastra corretta. Garantire " collo " è impostata sul valore corretto sull'obiettivo che permette la corretta messa a fuoco con i tipi differenti.
- Seleziona il " microscopio " Tab. Definisci l'esposizione 1 come YFP (488 laser) e l'esposizione di 2 come Hoechst (laser 405). Attivare il filtro su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 telecamera 1 e 2 di esposizione alla fotocamera 2. Impostare tempi di esposizione a ~ 800 ms per esposizione 1 e ~ 40 ms per esposizione 2. Esposizione di
- selezionare 1. Impostare lo stato attivo altezza su 0 µm. Select " fuoco ". Una volta messo a fuoco, esporre telecamera 1. Regolare l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e fare clic su " prendere altezza ". Modificare i tempi di esposizione e potere dare un'intensità di pixel massimi di ~ 3.000 laser. Salvare i parametri di esposizione. Ripetere per esposizione 2.
- Selezionare " esperimento definizione " Tab. creare un layout e sublayout. Trascinare e rilasciare il relativo layout, esposizione, immagine di riferimento, skewcrop file e sublayout. Salvare l'esperimento.
- Selezionare " automatico esperimento " scheda e acquisire immagini. Alla fine di ogni esecuzione, le immagini catturate vengono automaticamente caricate sul server.
6. Analisi di due immagini di canale dell'immagine
- selezionare l'algoritmo software per segmentare gli oggetti primari (nuclei, cytosol e aggregati) ( Figura 7).
- Selezionare il metodo che segmenti i nuclei con precisione mediante ispezione visiva degli oggetti segmentati. Hoechst-macchiato oggetti nel canale 1 (Ch1) verranno utilizzati per determinare il numero di celle. La macchiatura di YFP dal mutante SOD1-A4V nel canale 2 (Ch2) verrà utilizzato per determinare la quantità di aggregati.
- Conteggio celle usando i ' trovare i nuclei ' algoritmo come Hoechst-macchiatura regioni > 20 µm 2, con un fattore di divisione di 7.0, una soglia individuale di 0.40 e un contrasto > 0.10.
- Creare la tabella dati e determinare CE 50 per ciascuno dei composti utilizzando la ' regressione Non lineare ' equazione nel software grafico.
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Representative Results
Generazione stabile di cellula utilizzando lentivirus: Strategia globale per il monitoraggio di aggregati di proteine SOD1 è illustrata nella Figura 1. In una prima fase, abbiamo generato un vettore di espressione lentivirali per consegna stabile gene SOD1 in linee cellulari (passaggio 1). Due vettori lentivirali codifica YFP-etichetta SOD1 WT e SOD1 A4V (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP, rispettivamente) con imballaggio e busta plasmidi sono stati preparati (Figura 2A). Al momento di trasduzione lentivirale (passaggio 2) la cella linee testato (HEK-293, U2OS e SH-SY5Y) è rimasto livelli sani, hanno mostrato alta espressione (Figura 2B) e a lungo termine YFP etichettatura indipendentemente dalla forma SOD1. È interessante notare che, WT né mutante SOD1 espresso in tre linee cellulari che hanno mostrato l'aggregazione visibile, in contrasto con il modello di cellulare di espressione transiente precedentemente testato11.
Linee cellulari stabili Validating per aggregazione di SOD1 e studiando la sua dinamica: Per attivare la formazione all'accumulo cellulare di misfolded SOD1 mutante SOD1, abbiamo usato inibitore del proteosoma ESGONALE (anche chiamato calpaina io e inibitore II; Ki = 190 e 220 nM rispettivamente), precedentemente convalidata utilizzando un transitorio SOD1 espressione cellulare modello11. Aggregazione di SOD1 è stata esaminata con linee di cellule HEK-293, U2OS e SH-SY5Y trasformate con YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP. Trattamento con inibitore del proteosoma ESGONALE (10 µM) per 24 ore promosso fortemente l'accumulo di aggregati di YFP-SOD1A4V in cellule HEK-293 (Figura 2). Tuttavia, nessuna aggregazione è stata trovata in SOD1WT-YFP trasformata in linee cellulari e bassissimi livelli di aggregazione è stato trovato in U2OS e linee di cellule SH-SY5Y SOD1A4V-YFP trasdotte YFP-SOD1WT e SOD1A4V-YFP (Figura 2). Sulla base di queste osservazioni, abbiamo usato la microscopia time-lapse per indagare la dinamica della formazione di aggregazione SOD1A4V-YFP indotta da inibizione del proteosoma (passo 3, Figura 3) e quantificare l'aggregazione SOD1A4V-YFP usando un singolo fluorescenza YFP canale per rilevare cellule esprimenti e aggregati in cellule viventi (passaggio 4, Figura 4). Cellule sono state seminate in presenza ed assenza di ESGONALE e monitorate per un periodo di 50 ore (Figura 5A). Nelle nostre condizioni sperimentali, abbiamo trovato la formazione aggregata indotta da ESGONALE ha raggiunto un plateau a 24 ore ed è rimanere stabile durante le prossime 12 ore. Mostriamo che la densità delle cellule diminuita significativamente dopo 28 ore l'effetto citotossico di ESGONALE, mentre il numero delle cellule è aumentato nell'esperimento negativo DMSO-trattati.
Caratterizzando piccola molecola CE 50 per formazione di aggregazione utilizzando SOD1 cellulare modello: Le cellule che esprimono SOD1A4V-YFP sono state trattate in maniera dose-dipendente con inibitori del proteasoma piccola molecola. Abbiamo usato un marcatore nucleare per etichettare la linea cellulare SOD1A4V-YFP, che è vantaggiosa per il rilevamento di aggregata all'interno dello scompartimento del citosol. Infatti, poiché ogni cella contiene un nucleo, segmentando i nuclei e li utilizzano come semi in segmentazione spartiacque delle cellule, segmentazione del citoplasma è semplificata21. Abbiamo utilizzato la macchiatura Hoechst, che è noto per non avere nessuna tossicità quando utilizzato per un periodo di breve termine e a basse concentrazioni22, condizioni che non sono stati utilizzati nel lasso di tempo precedente esperimento di imaging. Dopo 24 ore di coltura delle cellule in presenza di inibitori del proteasoma, le cellule SOD1A4V-YFP erano colorate con Hoechst soluzione (10 µ g/mL) per 10 min. Successivamente abbiamo acquisito immagini di fluorescenza per Hoechst e YFP utilizzando un obiettivo di NA 20 X 0,4 (passaggio 5, Figura 6). Utilizzando un algoritmo di analisi di immagine che prende in considerazione i nuclei delle cellule e la distribuzione di SOD1A4V-YFP, le cellule sono state analizzate utilizzando il software di analisi di immagine (passo 6, Figura 7). Hoechst-macchiato oggetti che esibiscono l'intensità fluorescente appropriato sopra priorità bassa e le caratteristiche morfologiche dimensionali di un nuclei (larghezza, lunghezza e area) sono stati identificati e classificati di segmentazione di immagini. La maschera nucleare derivata da Hoechst macchiatura è stata utilizzata per tracciare la distribuzione di spot SOD1A4V-YFP prossimale all'interno dell'area citosolica delle cellule e per determinare la presenza o l'assenza di aggregati. Basata su nuclei e punti di rilevazione, è stato calcolato un rapporto degli aggregati rilevati contro le cellule. Per determinare la sensibilità della nostra analisi, abbiamo quantificato successiva aggregazione di cellule SOD1A4V-YFP HEK-293 trattati con tre inibitori del proteasoma differenti (ESGONALE, MG132 ed epoxomicina) in un modo di concentrazione di dose che ha permesso il montaggio i dati quantificati e Abbiamo calcolato i valori di50 CE di 6,53 ± 1.17, 0,17 ± 0,06 e 0.03 ± 0.03 µM per ESGONALE, MG132 ed epoxomicina, rispettivamente (Figura 8B). La relativa tossicità per tutti e tre gli inibitori proteasome è stata quantificata misurando il numero di cellule aderenti restanti nel pozzo marcato con colorante Hoechst. Abbiamo trovato che il numero totale delle cellule ha teso a diminuire in risposta a effetti composti, come evidenziato da valori simili di50 CE di ± 6,58 1.06, 0.19 ± 0.03 e 0.05 ± 0.01 µM per ESGONALE, MG132 ed epoxomicina, rispettivamente.
Figura 1. Flusso di lavoro e sequenza temporale per la generazione di linee cellulari e alta analisi di contenuto (HCA) di aggregazione proteica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. SOD1 WT e generazione di A4V linea stabile.
(A) diagramma schematico di vettori lentivirali e imballaggi (imballaggio ed Envelop plasmidi) per la generazione dei lentivirus wild type e mutante SOD1 A4V. (B) selezionato immagini confocal di tre celle (HEK-293, U2OS e SH-SY5Y) trasformate con il wild-type lentivirus SOD1 (WT) e mutante SOD1 (A4V). (C) immagini rappresentative di tre celle stabile trattati per 24 h con l'inibitore del proteasoma, ESGONALE (10 µm). Aggregati SOD1A4V-YFP sono stati trovati per essere abbondantemente presenti (frecce rosse) in HEK-293, ma scarsamente presente in U2OS o SH-SY5Y cellule. Immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo X 20. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. I quattro passaggi necessari per l'analisi di immagine di aggregazione utilizzando il canale YFP per rilevare cellule e aggregati.
(1) importare immagini dal sistema di archiviazione e analisi dei dati di immagine. (2) selezionare "trovare le celle" per il conteggio di cellule. (3) selezionare "trova luoghi" per determinare gli aggregati. (4) definire risultati basati su ogni algoritmo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 5. Inibizione del proteosoma che conduce all'accumulazione degli aggregati SOD1A4V-YFP in cellule HEK-293.
(A) selezionato immagini confocal di SOD1A4V-YFP HEK-293 cellule trattate con 10 µM di ESGONALE. (B) analisi quantitativa di formazione aggregazione indotta con ESGONALE (10 µm) e i conteggi delle cellule in un modo dipendente dal tempo. Immagini sono state acquisite utilizzando un obiettivo LWD 20 X ogni 60 min. scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Schermata dell'apparato sperimentale fino per due canali di acquisizione (YFP e Hoechst). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 7. I quattro passaggi necessari per l'analisi di immagine degli aggregati SOD1 e cellule etichettate con YFP e Hoechst.
(1) input immagini dal sistema di archiviazione e analisi dei dati di immagine. (2) selezionare "trova i nuclei" per il conteggio di cellule. (3) selezionare "trova luoghi" per determinare gli aggregati. (4) definire risultati basati su ogni algoritmo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8. Analisi quantitativa di SOD1 A4V aggregazione e concentrazione dell'inibitore del proteasoma dipendente dalla dose.
(A) qui presentiamo l'immagine e metodo di analisi di quantificazione per macchie e cella conta utilizzando il sistema di analisi di immagine di Columbus. Immagini corrispondenti ai due canali fluorescenti specifici di Hoechst (Ch1) e YFP (Ch2) sono stati acquisiti in modo sequenziale. Hoechst-macchiato oggetti (a sinistra) sono stati identificati di segmentazione di immagini. La maschera nucleare (centro) derivata dall'algoritmo "trova i nuclei" è stata applicata per contare il numero di cellule, seguita da spot maschera (a destra) "trovare macchie" algoritmo utilizzato per rilevare gli aggregati. (B) Dose studio di reazione dell'effetto degli inibitori del proteasoma sull'aggregazione del mutante SOD1 A4V, che riporta una variabile CE50 classifica da 6,53 µM, ESGONALE, 0,17 µM per MG132 e 0,03 µM per Expoxomicin. Selezionato immagini confocal del mutante SOD1 A4V trattati proteasoma alla concentrazione di50 CE. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Ci sono due approcci principali per la generazione di linee cellulari stabili. Il primo richiede parecchie settimane e selezione di transfezione e resistenza transitoria dei vettori di DNA genomico plasmide integrato. Il secondo prende una questione di ore attraverso l'uso dei lentivirus, rendendo questo protocollo suscettibili dell'efficace espressione di proteina bersaglio in linee cellulari multiple con sforzo limitato. Il viaggio-CMV vettore19 era un vettore di sostenuta da utilizzare, con efficienza di trasduzione conservate e l'espressione del transgene stabile. Con nostra sorpresa, tre linee cellulari generate ha mostrato alcuna aggregazione visibile del mutante SOD1, in contrasto con il protocollo sperimentale basato su espressione transiente non descritto precedenti11. È probabile che espressione transiente favorisce l'aggregazione proteica come che produce la più alta espressione della proteina in un periodo relativamente breve di tempo. Al momento di trasfezione transiente, il sistema ubiquitina-proteasoma, che degrada la maggior parte delle proteine, raggiunge un punto di saturazione in cui la sua capacità di degradare le proteine aggregate-incline viene utilizzato completamente. Tuttavia, sostengono che le righe stabili hanno maggiori probabile di riprodurre la situazione fisiologica in cui le proteine sono espresse ad un livello relativamente costante che corrisponde all'eliminazione di proteine misfolded tramite il proteasoma, autofagosoma-lisosoma, e esocitosi. Anche se gli eventi primari che conducono alla SLA sono ancora sconosciuti, invecchiamento in relazione di diminuzione dell'attività del sistema ubiquitina proteasoma, è un fattore di rischio significativo23. Come illustrato dalla nostra analisi cellulare, inibizione del proteosoma promuove l'aggregazione di proteine misfolded (SOD1 A4V). Come tale, questo test crea nuove opportunità per piccoli attivatori della molecola dell'autofagia signaling pathway o la rete di chaperone. Infatti, questo viale per induzione di chaperone sembra promettente, come illustrato dalla relazione da Kieran et al. , dimostrando che il trattamento con un co-induttore di calore risposta allo shock è stato trovato per avere benefici terapeutici estendendo la durata della vita di SODG93A topi24.
È importante ricordare che ci sono alcune insidie da considerare prima di usando questa analisi. Come con il protocollo di analisi di ottimizzazione, abbiamo trovato che le concentrazioni di DMSO all'1% o sopra aumenta l'intensità media della YFP misurato nella nostra analisi. Pertanto è importante per ridurre la concentrazione di DMSO allo 0,5% per evitare qualsiasi tale manufatto. Inoltre, la selezione della lente d'ingrandimento e densità delle cellule nella piastra di dosaggio sono importanti da considerare per ottimizzare la robustezza del dosaggio.
Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che utilizzando un sistema di vettori lentivirale, la linea cellulare SOD1A4V-YFP HEK-293 è particolarmente adatta per il monitoraggio mutante SOD1 A4V formazione aggregata all'induzione di inibitori del proteasoma. Lo studio di proteine misfolded e aggregazione è essenziale per la comprensione dei meccanismi di proteinopathies. Anche se gli strumenti di ricerca per analizzare l'aggregazione della proteina sono stati ampliati negli ultimi decenni, approcci efficienti per rilevare e quantificare l'aggregazione sono tenuti a molecole di schermo che vietano la formazione di aggregati. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato per sviluppo di analisi e studi di aggregazione della proteina. Si spera, con il sostegno di HCS, HCA e uso di sostanze chimiche o CRISPR/siRNA librerie, questo lavoro dovrebbe aprire nuove vie per la scoperta di destinazione terapeutica o romanzo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) e il programma di supporto individuale scienziato National Research Foundation di Corea (NRF) (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
References
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