Summary
Ansiedade-como o comportamento dos ratos testados da elevada mais labirinto altamente varia de acordo com o ambiente de teste. Aqui nós mostramos como configurações do aparelho, especialmente a estrutura de braço, afetam o comportamento no labirinto, e explicamos um protocolo confiável para detectar os efeitos dos ansiolíticos. Este relatório irá contribuir para a investigação de ansiedade.
Abstract
A elevada além de labirinto é um teste comportamental para avaliar ansiedade animal em roedores. Embora este teste é aplicado extensamente no campo da ciência comportamental, resultados conflitantes são fornecidos frequentemente de laboratórios diferentes. Para identificar razões para os diferentes resultados, enfocamos anteriormente características de braço, que diferem entre laboratórios, mais notavelmente a presença/ausência de bordas para os lados de braços abertos e a opacidade/transparência das paredes de braço fechado. Em um relatório anterior, usamos um contêiner personalizado projetado para comparar o comportamento de ratos em diferentes combinações de desenhos de braço abertos e fechados, em condições experimentais idênticas e mostrou diferenças de características de braço interferem experimental resultados. Em breve, bordas de braço aberto aumentaram significativamente comportamento de ansiedade em ratos, enquanto braços transparentes também podem ter diminuído esse comportamento. Além disso, verificamos uma maior sensibilidade de detecção do efeito de um medicamento ansiolítico em uma combinação de braço aberto não-ledged + opaco braço fechado murado em comparação com uma combinação de ledged braço aberto + braço fechado murado transparente. Neste relatório, nós apresentamos o nosso protocolo para a elevada plus teste de labirinto, juntamente com a discussão dos principais resultados do relatório anterior e nossa experiência experimental. Acreditamos que este relatório fornecerá informações úteis para pesquisadores que têm empregado ou quem planeja usar a elevada mais de labirinto em seus estudos.
Introduction
O número de pacientes que sofrem de transtornos do humor, incluindo transtorno de ansiedade e depressão, está aumentando. Embora o desenvolvimento destes transtornos envolve fatores genéticos e ambientais, os mecanismos de patogenicidade detalhados ainda não estão totalmente compreendidos1. Portanto, pesquisa deve centrar-se em desvendar os mecanismos subjacentes de transtornos do humor, bem como o desenvolvimento de medicamentos eficazes que têm menos efeitos colaterais.
Testes comportamentais para animais de laboratório são úteis para investigar a função superior do cérebro, incluindo a emoção. Como comportamento animal é altamente variável, resultados experimentais diferem frequentemente entre laboratórios, mesmo se uma estirpe de pura idêntica foi usado2. Assim, os pesquisadores também precisam entender as características básicas dos dispositivos experimentais adoptarem a fim de fornecer resultados fiáveis, precisos no laboratório.
A elevada além de teste de labirinto foi originalmente criado para examinar a reatividade emocional em roedores3,4. Todo o aparelho é normalmente localizado 500 mm acima do piso e consiste de dois abertos e dois braços fechados que fazem de uma forma mais. Medições de exploração do braço (incluindo a duração e a frequência de entradas em cada braço), distância viajados e especificados comportamentos como postura esticada-atendente de animais sujeitos são registados durante os períodos de observação. Por essas medidas, estima-se como um resultado experimental animal ansiedade.
A elevada além de teste de labirinto é usado em todo o mundo, mas nem todos os laboratórios usam o mesmo aparelho design5,6, e estas diferenças podem afectar os resultados experimentais. Por exemplo, diferenças incluem a presença ou ausência de saliências ao longo de braços abertos e/ou o uso de paredes transparentes ou opacos para braços fechados5,6. As bordas ao longo de braços abertos e o uso de paredes transparentes para braços fechados foram desenvolvidos para evitar animais cair o aparelho7e para facilitar as observações comportamentais dentro os braços fechados, respectivamente de8,9. Embora tenha havido alguns estudos que examinaram as diferenças de estrutura de braço como individuais podem afectar a capacidade de detectar animais ansiedade1,2,5,10,11 , os efeitos combinados de open (com/sem borda curta) e características de braço fechado (transparente/opaco paredes) sobre o comportamento do animal ainda não tenha sido investigada.
Num relatório recente, discutimos o efeito destas combinações de designs de braço no comportamento de ansiedade em ratos12. Em breve, bordas de braço aberto aumentaram significativamente comportamento de ansiedade em ratos, enquanto braços transparentes também podem ter diminuído esse comportamento. Além disso, verificamos a maior sensibilidade de detecção do efeito de um medicamento ansiolítico em uma combinação de braço aberto não-ledged + opaco braço fechado murado em comparação com uma combinação de ledged braço aberto + braço fechado murado transparente. Neste relatório, podemos apresentar nosso protocolo para a elevada mais labirinto teste, juntos com a discussão dos principais resultados do relatório anterior. Acreditamos que este relatório fornecerá informações úteis para aqueles que têm empregado ou quem planeja usar a elevada mais de labirinto em seus estudos.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Universidade de Meiji (IACUC 14-0002(1)). Animais utilizados nos resultados representativos foram preparados como segue: ratos machos Sprague-Dawley foram comprados de uma empresa de animais de laboratório e alojados em grupos de 4 animais por jaula de rato padrão (W200 × D410 × H250 mm) pelo menos uma semana antes do início da experimento comportamental. O quarto de alojamento dos animais foi mantido nas condições normais de ambientes para a luz (12:12 horário de claro/escuro com luzes acesas no 10:00 h), temperatura (25,0 ± 0,5 ° C), umidade (55 ± 10%) e ventilação (10 vezes / h), e os animais tinham acesso ad libitum a comida ( Oriental fermento co. Ltd., Tóquio, Japão) e água. Os animais foram mantidos em uma gaiola de rato padrão (W410 x D250 x H200 mm, Toyoriko co., Ltd., Aichi, Japão) com papel do fundamento (alfa-dri, LSG Corporatin, Tóquio, Japão).
1. elevada e mais teste de labirinto
- Configurar o plus elevado labirinto aparelhos em um contêiner personalizado (W1, 500 × D1, 500 × H2, 000mm) (figura 1A) com um quadro metálico em forma de mais 500 mm acima do piso para apoiar a execução braços forma (figura 1B), iluminação no teto para contêiner Ilumine a superfície do labirinto para a intensidade da luz exigida (Figura 1) e uma câmera de vídeo digital no teto centro para permitir o monitoramento de vídeo ao vivo dos testes comportamentais (Figura 1).
- Os braços (L500 x W100 mm) na estrutura em forma de mais e em seguida sujeite a plataforma quadrado central (W100 x D100 mm) no centro dos quatro braços (Figura 1 -F).
Nota: Em nosso laboratório, temos dois tipos de braços abertos (L500 x W100 mm) e dois tipos de braços fechados (L500 x x H450 W100 mm) (Figura 1). Os braços fechados têm paredes ou transparentes ou opacas (Figura 1), e os braços abertos são projetados com ou sem uma borda curta (H5 mm, Figura 1E). A plataforma quadrado central (W100 × D100 mm) é colocada no centro dos quatro braços (Figura 1 -F). Assim, as seguintes quatro combinações de braços podem ser preparadas de acordo com finalidade experimental: abre braços com bordas + braços fechados com paredes transparentes (lajes/transparente), braços abertos, com bordas + braços fechados com paredes opacas (lajes/opaco), de braços abertos sem bordas + braços fechados com paredes transparentes (não-bordas/transparente) e braços abertos sem bordas + braços fechados com opaco paredes (não-bordas/opaco). A superfície da pista de braço é preta, para permitir melhor animal rastreamento pelo software de análise do comportamento automatizado, como descrito na secção 2, análise comportamental. - Ajuste a intensidade de iluminação na superfície da parte distal da extremidade de cada braço e uma plataforma central para aproximadamente 100 Lux.
- Antes de cada ensaio, limpe todo o aparelho com solução de etanol 70% e limpe com água destilada.
- Clique no botão"gravar" no gravador de disco rígido para iniciar a câmera de vídeo digital que vai gravar o comportamento do rato para o vídeo descrito na secção 2, análise comportamental de análise de imagem.
- Coloque um animal na plataforma central, enfrentando um braço aberto e permitir a livre exploração em cima da aparelho por 5 min.
- Clique no botão"parar" no gravador de disco rígido, para terminar a gravação.
- Conte o número de fezes e micções após retornar o animal testado para o quarto de alojamento dos animais.
- Repita da etapa 1.4 até o final do experimento.
Nota: Uma execução de teste seco é sempre efectuada antes de iniciar cada experimento para verificar que todas as configurações experimentais estão corretamente configuradas antes de quaisquer animais experimentais estão expostos a condições experimentais. Caso contrário, alguns animais, especialmente o primeiro animal pode experimentar diferentes condições ambientais (por exemplo, ruídos, possivelmente induzidos pelo experimentador durante pistas de manipulação e/ou animal, eventualmente deixadas pelo animal previamente testado).
Nota: Os experimentadores estão perto do recipiente quando um animal está sendo testado. Assim, mesmo que os experimentadores não são visíveis o rato pode ainda ser capaz de senti-los através do cheiro e/ou som.
2. análise comportamental
Nota: Análise comportamental é realizado pela observação manual e automatizada de software de análise.
-
Observação do manual
- Depois que o animal é colocado no peitoril, observar o seguinte: número de entradas (uma entrada para um braço é definida como qualquer instância quando todas as 4 patas no braço), o tempo gasto em cada braço, e número de esticada-atendente Postures posturas enfrentando um braço aberto , ao afastar a plataforma central para um braço fechado.
- Medir a duração e a frequência dos comportamentos definidos acima pelo cronômetro e contagem de 5 min, a partir de quando as portas do recipiente estão fechadas.
-
Análise automatizada
- Usando o programa de software disponíveis, gravar o seguinte: a distância percorridas, tempo gasto em diferentes posições de braços abertos (segmentos proximais, médios e distais da plataforma central), e uma análise de minuto a minuto do tempo gasto em aberto e fechado braços.
- Clique no botão"Iniciar" do software análise automatizada ao mesmo tempo, como a observação manual começa (a gravação irá parar automaticamente se a duração de gravação é definido).
Nota: O software de análise comportamental utilizado neste estudo rastreia o animal através do seu contraste com o campo de fundo; o animal, que é atribuído a um tamanho fixo, é identificado como o objeto mais brilhante e a locomoção de seu ponto central, portanto, pode ser usada para rastreamento de animais.
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Representative Results
No estudo anterior, comparamos os efeitos combinados de bordas de braço aberto e transparência das paredes de braço fechado sobre os comportamentos exploratórios no labirinto12. Ratos, significativamente, gastou muito menos tempo em braços abertos sem bordas do que de braços abertos, com bordas (F [1, 60] = 13.49, P = 0,0005) (Figura 2A). Resultados semelhantes foram encontrados também para o número de entradas nos braços abertos (F [1, 60] = de 11,17, P < 0.0014)12, sugerindo que a presença de bordas aumenta o comportamento exploratório de rato de braços abertos. Ratos mostraram significativamente menos postura esticada-atendente sobre o aparato que tinha fechado a braços com paredes transparentes do que em aparelhos que tinham fechado a braços com paredes opacas (F [1,60] = 4,03, P = 0.0492) (Figura 2B), sugerindo que paredes transparentes braço fechado diminuíram o comportamento de ansiedade em ratos. Ratos, passou mais tempo no segmento distal de braços abertos em cima do aparelho que tinha paredes transparentes braço fechado do que no aparelho com paredes opacas braço fechado (F [1,60] = 8,00, P = 0.0983) (Figura 2), sugerindo que transparente paredes maio também Diminua o comportamento exploratório de braço aberto de rato. Além disso, a exploração de braço aberto no segmento distal foi significativamente menor no aparelho não-bordas/opaco comparado ao aparelho de bordas/transparente (Figura 2). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que sensibilidade de detecção de comportamento de ansiedade pode diferir dependendo dos tipos de recursos de design de braço usados e o aparelho não-bordas/opaco e bordas/transparente aparelhos poderão ter um relativamente grande diferença na sensibilidade da detecção.
Para verificar diferenças de sensibilidade detecção entre diferentes tipos de projeto do braço, uma experiência adicional foi realizada usando o ansiolítico diazepam de droga (Figs. 3A–D). Em breve, o aparelho não-bordas/opaco detectou o efeito do tratamento com altas doses de diazepam no tempo gasto nos braços abertos, Considerando que o aparelho transparente/bordas não fez (Figura 3A–B). Resultados semelhantes foram encontrados também para o número de entradas em braços abertos12 (dados não mostrados). A falta de qualquer efeito significativo sobre o aparelho de bordas/transparente pode ter sido devido ao fato de que a atividade basal (tratamento de veículo) no aparelho foi maior do que o aparelho não-bordas/opaco, mas essa exploração de braço aberto nunca ultrapassou 33% de o tempo em qualquer fase de qualquer aparelho. Portanto, este intervalo de tempo de exploração mais estreito do braço aberto tornou mais difícil distinguir o efeito ansiolítico do diazepam sobre o aparelho Ledged/transparente (Figura 3–D).
Figura 1 : Equipamentos projetados para elevados além de teste de labirinto Painel (A): elevados além de contêiner de teste de labirinto. O aparelho é colocado no recipiente preto, e um monitor ao lado as imagens de filme ao vivo do recipiente projetos registrados durante o experimento. Painel (B): além de quadro de labirinto no recipiente que ofereça suporte a braços equipados. Todo o aparelho está localizado a 500 mm acima do piso. Painel (C): iluminação de teto que pode ser ajustada por intensidade. Uma câmera de vídeo digital (ver seta) rodeado por movimentos de animais de registros de iluminação. Painel (D): elevados além de braços de labirinto e plataforma central que são montados ao quadro; da esquerda para a direita, parede opaca fechada braço braço aberto não-parapeito, ledged braço aberto, plataforma central, braço de parede transparente fechado. Painel (E): exibição de close-up de braços abertos; da esquerda para a direita, abra o braço sem bordas, abra o braço com bordas (H5 mm). Painel (F): um exemplo de um labirinto construído (aparelhos de bordas/transparente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Bordas de braço aberto reduzem comportamento de ansiedade, e paredes transparentes diminuem parcialmente o comportamento de ansiedade. Ratos machos foram submetidos a elevada além de labirinto de teste com diferentes combinações de estruturas de braço (lajes/transparente, bordas/opaco, não-bordas/transparente e não-bordas/opaco). Ordem de teste foi normalizada através dos grupos experimentais (cada combinação de tipo de aparelho). Este procedimento normaliza efeitos inesperados que poderiam ter ocorrido devido ao tempo de um dia de cada teste. Painel (A): tempo gasto com os braços abertos; Painel (B): número de posturas esticado-atendente; Painel (C): tempo gasto no segmento distal de braços abertos. Linhas contínuas e tracejadas indicam significativos efeitos principais das estruturas de braço abertos e fechados, respectivamente (Two-Way ANOVA, #P < 0.1, * P < 0.05, * *P < 0,01, * * *P < 0,001). Letras diferentes ao lado as barras no painel (C) indicam diferença significativa (teste de comparação múltipla de Bonferroni, um < b, P < 0,0125). Os dados foram expressos como média com SEM (n = 16 por grupo experimental). Estes números foram modificados de nossa anterior relatório12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : O aparelho não-bordas/opaco mostra maior sensibilidade de detecção do efeito ansiolítico do diazepam. Ratos machos foram submetidos a elevada além de labirinto de teste, com aparelhos não-bordas/Opaque ou bordas/Transparent, 30 min após o tratamento com veículo (0 mg/kg), baixo (0,25 mg/kg) ou doses alta (0,5 mg/kg) de diazepam de drogas o ansiolítico (intraperitoneal injeção). Solução de diazepam foi dissolvida em solução salina normal 0,9%, com um agente de superfície-ativando. Neste experimento, a teste ordem dos grupos de tratamento de drogas de três e dois tipos de design de aparelhos foram randomizados para conta para quaisquer efeitos que possam ocorrer devido ao tempo de um dia de cada teste. Painéis (A & B): Total de tempo por cento (5 min) gasto com braços abertos de aparelhos bordas/transparente e não-bordas/opaco, respectivamente. Painéis (C e D): por minuto por cento tempo gasto nos braços abertos do aparelho bordas/transparente e não-bordas/opaco, respectivamente. Letras diferentes ao lado de barras no painel (B) indicam uma diferença significativa entre os tratamentos (teste de comparação múltipla de Bonferroni, um < b, P < 0,0167). As linhas contínuas e tracejadas em painéis (C e D) indicam significativos efeitos principais dos tratamentos Time-Lapse e diazepam, respectivamente (repetido medidas ANOVA, *P < 0.05, * *P < 0,01, * * *P < 0.001). os dados foram expressos como média com SEM. números nas colunas indicam animais que concluído o experimento (números entre parênteses indicam animais cair o aparelho). Estes números foram modificados de nossa anterior relatório12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
À medida que aumenta o número de pacientes que sofrem de transtornos psiquiátricos, incluindo transtorno de ansiedade, é importante desenvolver estudos de ponta para melhorar a compreensão do mecanismo básico de ansiedade. Para conseguir isso, é também importante otimizar os procedimentos experimentais. Portanto, para melhorar a aplicação da elevada além de teste de labirinto, temos demonstrado o efeito das características de braço em resultados experimentais utilizando ratos.
A elevada mais labirinto foi originalmente criado para testar animal ansiedade em roedores4, mas embora as estruturas básicas são geralmente consistente (por exemplo, elevada 500 mm acima do piso com uma forma mais), vários projetos de braço são usados frequentemente. Originalmente, o aparelho consistia de braços abertos, sem bordas e fechou a braços com paredes de madeira opacos. No entanto, mais recentemente abertos braços foram desenvolvidos com bordas para evitar que animais cair o aparelho e braços fechados também foram desenvolvidos com paredes transparentes para facilitar a observação do comportamento nos braços fechados. No entanto, não tem havido relatos que abordou os efeitos combinados destes braço recursos sobre os resultados experimentais da elevada mais teste de labirinto. Conforme mostrado pelos nossos resultados, a presença de bordas de braço aberto e a transparência do braço fechado paredes evitar a diminuição da exploração de braço aberto em ratos (Figura 2), que pode diminuir a sensibilidade de detecção do efeito ansiolítico do diazepam ( Figura 3). O aparelho transparente/bordas apareceu para encorajar a maior exploração sobre os braços abertos pelo veículo Tratado ratos (Figura 3). Este reduzido comportamental discriminação na exploração de braço aberto actividade entre veículo e diazepam tratados de ratos, tornando assim mais difícil de detectar diferenças nos níveis de ansiedade. Portanto, a sensibilidade mais baixa do aparelho transparente/bordas pode significar que mais animais que precisam ser testados para demonstrar o tratamento significativo efeitos em comparação com o uso de aparelhos não-bordas/opaco.
Em nosso protocolo, a duração e o número de entradas em cada braço manualmente foi medido por experimentadores bem treinados. Este procedimento permite uma medição precisa de entradas de braço, definidas como todos os 4 patas colocadas em um braço. Embora seja verdade que os sistemas de rastreamento automatizado de animais estão disponíveis para alguns parâmetros comportamentais, como viajar a distância, em nossa experiência, eles não conseguem distinguir sempre com precisão entre as entradas e as entradas para braços, especialmente quando os animais Execute posturas esticado-atendente, perto da fronteira entre a plataforma central e um braço. Assim, nós recomendamos usar uma combinação de ambos os sistemas de observação manual e automatizada, com base em seus respectivos pontos fortes para cada parâmetro comportamental.
Existem algumas outras diferenças de protocolo entre laboratórios. Por exemplo, alguns pesquisadores coloquem animais na plataforma central, enfrentando um braço fechado13,14, enquanto outros colocam os ratos enfrentando um braço aberto15,16. Além disso, alguns pesquisadores testar comportamento imediatamente depois de tomar os ratos da casa-gaiola, enquanto outros permitem que os ratos algum tempo para se aclimatar ao comportamento sala de teste antes de iniciar o teste. Em relação ao caso anterior, em testes preliminares experimentamos como resultados diferiam dependendo do que armar o rato inicialmente enfrentado; Houve um aumento da incidência de entrar para o braço que o rato estava situado em frente. Além disso, quando os ratos foram colocados frente para um braço fechado, alguns animais não se mexeu fora esse braço fechado após a primeira entrada. Nesse caso, é difícil distinguir se os ratos experimentam de conflito entre os braços abertos e fechados, ou que eles simplesmente preferem estar em um lugar fechado, sem jamais reconhecer a presença de braços abertos. Embora em nosso estudo, nós escolhemos colocar os ratos enfrentando um braço aberto, para garantir uma elevada incidência de estar em conflito, recomendamos que mais estudos sejam conduzidos para garantir que o efeito desta diferença de protocolo em resultados experimentais é corretamente investigada.
As medições de exploração do segmento distal de braços abertos e análise por minuto forneceram informações extra detalhadas sobre comportamento de ansiedade-rato. Estas medidas contribuídas para mostrar as diferenças entre os desenhos do braço diferente sensibilidade detecção. Apesar disso, resultados relatados de ansiedade de pesquisa usando a elevada mais teste de labirinto frequentemente não relatar estes tipos de medições detalhadas13,17,18. Portanto, é altamente recomendável que pesquisadores também relatam mais informações sobre atividades exploratórias de rato, incluindo exploração distal, análise por minuto e também postura esticada-atendente.
Em conclusão, nossos resultados sugerem que os diferentes tipos de aparelhos podem ter suas próprias características. Estes testes, demonstrámos que o aparelho não-bordas/opaco melhor pode detectar o efeito de drogas potencialmente ter um efeito ansiolítico. Em contraste, é concebível que bordas/transparente aparelhos podem ter uma vantagem semelhante ao testar o potencial anxiogenic de drogas. Até à data, testes comportamentais tem sido usados não só para triagem de drogas, mas também para os ensaios de fenotipagem em animais mutantes. Com efeito, genoma avançadas técnicas de edição permitem a rápida produção de animais mutantes. Portanto, é muito importante desenvolver procedimentos de teste com melhor precisão e sensibilidade para detectar melhor as variações no comportamento. Este relatório demonstra uma aplicação melhorada da elevada além teste para pesquisa de animais ansiedade baseada nas funções dos genes drogas ou destino esperadas. Assim, acreditamos que nossos esforços ajudarão a avançar a pesquisa empregando a elevada além de labirinto.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer Sr. Akihiro Hirano por sua assistência em produzir o aparelho personalizado. Os autores gostaria de agradecer o Sr. Kosuke Takahashi e Sr. Shingo Nakajima para sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela pesquisa sobre o risco das substâncias químicas, saúde e bolsas de investigação do laboratório de Ciências, Ministério da saúde, trabalho e bem-estar, Japão (H25-KAGAKU-IPPANN-003) e A concessão do projeto de pesquisa por Instituto de ciência e tecnologia de Meiji University, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Customized container (W1500 × D1500 × H2000 mm) | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Lighting | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Elevated plus maze apparatus | NA | NA | Handmade by Mr. Akihiro Hirano |
| Digital video camera | Watec | WAT-250D2 | Any suitable video camera can be attached to a hard disk recorder for recording tracking profiles. |
| Hard disk recorder | TOSHIBA | RD-R200 | Any suitable hard disk recorder can be attached to the digital video camera. |
| Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories Japan, Inc. | NA | Any suitable rats can be used for your study |
| Standard rat cage | Toyoriko | TP-105 | Any suitable rat cage be used for your study |
| Instrument to measure light intensity | AS ONE | 1-5818-02 | Any suitable instrument to measure light intensity |
| EthoVision XT version 8.0 | Noldus | NA | Any suitable software to measure animal behavior |
| Diazepam | Taiyo Pharmaceutical Industry | 1124402A2061 | Any suitable drug can be used for your study |
| Tween 80 | Wako Pure Chemical Industries | 9005-65-6 | Any suitable drug can be used for your study |
References
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