Summary
Denne protokol beskriver fabrikation af en lille, klar-til-brug kassette, der kan anvendes til visuel genkendelse af flere nukleinsyrer i en enkelt, test, der er nem at betjene. I denne tilgang, blev en kapillær array brugt til multiplex og yderst effektiv påvisning af GMO mål.
Abstract
Multi-Target, kort tid og ressource-overkommelige metoder til påvisning af flere nukleinsyrer i en enkelt, nem at betjene test er påtrængende i klovesygediagnosticering, mikrobiel overvågning, påvisning af genetisk modificeret organisme (GMO), og retskemisk analyse. Vi har tidligere beskrevet den platform kaldet ro (Capillary Array-baserede Loop-medieret isotermisk forstærkning for Multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer). Heri, beskriver vi forbedret fabrikation og performance processer for denne platform. Her anvender vi en lille, klar-til-brug kassette samlet af kapillar array for multiplex visuel genkendelse af nukleinsyrer. Den kapillære array er forbehandlet i en hydrofobe og hydrofile mønster før fastsættelse loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe) primer sæt i kapillærer. Efter montering af lastning adapter, er lampe reaktionsblandingen indlæst og isoleret i hver kapillær, på grund af kapillær kraft af en enkelt pipettering trin. LAMPE reaktioner udføres parallelt i kapillærerne. Resultaterne er visuelt læse af belysning med en håndholdt UV lommelygte. Du bruger denne platform, vise vi overvågning af 8 ofte optræder elementer og gener i GMO prøver med høj specificitet og sensitivitet. I Resumé, er platform beskrevet heri beregnet til at lette afsløringen af flere nukleinsyrer. Vi mener, at det vil være almindeligt gældende i felter hvor høj overførselshastighed nukleinsyre analyse er påkrævet.
Introduction
Billig, hurtig og nem at bruge systemer til simultan påvisning af flere nukleinsyrer er behov for i en lang række områder, såsom klinisk diagnostik1,2,3, GMO påvisning4, 5,6, mikrobiel overvågning7,8,9, retskemisk analyse10,11, og især punkt af pleje tests (POCTs), hvor ressourcer er som regel begrænset12,13,14.
Polymerase kædereaktion (PCR), herunder dens afledte metoder real-time PCR og multiplex PCR, er den mest almindeligt anvendte teknik til påvisning i disse felter. Men disse metoder typisk kun finde ét mål i én test15 og de kræver elektricitet og avancerede professionelle udstyr.
En anden lovende teknologi til påvisning af nukleinsyrer er Loop-medieret isotermisk forstærkning (lampe), som blev første gang beskrevet i 200016. LAMPE er en høj effektivitet DNA påvisningsmetode. Teoretisk set kan det forstærke fra 1 kopi til 109 kopier af amplikoner inden for en time, alle udført ved en konstant temperatur, (dvs.mellem 60-65 ° C). Vellykket forstærkning vil producere en stor mængde af uopløselige biprodukt pyrofosfat og forårsage en ændring i turbiditet17, der direkte kunne ses med det blotte øje. En farveændring kan også observeres ved tilsætning af metalioner eller fluorescerende farvestoffer såsom Calcein18, nukleinsyre farvestof19og hydroxyl naphthol blå20. På grund af fordelene af høj følsomhed og bekvemmelighed i drift, er LAMPEN anvendes bredt i nukleinsyre genkendelse.
I øjeblikket, er der især to strategier for multiplex lampe assays. Et er at udføre flere lampe assays ved at have flere lampe primer sætter i en tube21,22,23. Dog vil mangfoldigheden og forstærkning effektivitet være begrænset af den iboende indblanding og konkurrence mellem forskellige primer sæt. Derudover kan det være vanskeligt at identificere forskellige lampe produkter i den samme reaktion. En anden strategi er baseret på fysisk isolering. Forskellige primer sæt blev isoleret i enkelte miniaturized rum, og flere lampe reaktioner er derefter udføres samtidig24,25. Disse tilgange, som er generelt baseret på mikrofluid chips, give en mulig løsning for høj overførselshastighed lampe reaktioner. Fremstilling af chips og multiplex før overfladebehandling af primer sæt er imidlertid komplicerede, som kan øge omkostningerne og mindske reproducerbarhed.
For nylig, et par undersøgelser har beskrevet ydende lampe reaktioner i kapillærer hen til omgå den komplicerede fabrikation af mikrofluid chips og har opnået lavpris-påvisning26,27. Men med hensyn til høj overførselshastighed analyse, disse kapillærer er ligner miniatureudgaver af PCR strip rør, fordi de prøver og reaktion reagenser (herunder forskellige primer sæt) skal individuelt forberedes og leveres til forskellige reaktion enheder inden for kapillærer. For at opnå parallelle og multiplex analyse, er ekstra udstyr, for eksempel en multikanals sprøjten pumpe, nødvendig for parallelle lastning af prøver eller reagenser.
For at overvinde de begrænsninger i forbindelse med de nuværende metoder til multiplex påvisning af nukleinsyrer, har vi udviklet en miniaturized platform, der kombinerer visuelle lampe teknologi med en kapillær array. Denne platform er multi-Target, kompakt i størrelse, lave omkostninger og let at betjene28. Heri, beskrive vi detaljerne i hvordan man kan fabrikere den kapillære array og udføre lampe reaktioner i matrixen. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af genetisk modificerede organismer (GMO'er) opdagelse som model. Vigtigst, kan denne protokol også bruges i høj overførselshastighed påvisning af andre nukleinsyre mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: denne protokol antages det, at rustfrit stål mug forsynet med figuren for de ønskede mikro-kanaler og lastning adapter har allerede gjort (3D-filer leveres som supplerende filer 1 og 2. ). Denne protokol også antages at plante DNA isoleret allerede er blevet udført.
1. fabrikation af klar-til-brug kassette kapillær Array-baseret
- ren rustfrit stål mug.
- Vask i rustfrit stål skimmel ved vaske, ethanol og deioniseret vand til at fjerne de potentielle forurenende stoffer. Tørre formen af nitrogen.
- Ren kapillærerne
- slid sikkerhed goggles, lab ensartet og kemiske beskyttelseshandsker.
- Sted kapillærer i et bægerglas. Ren kapillærer med 30 mL acetone i 5 min. til at fjerne organisk stof, og derefter vaske kapillærer med deioniseret vand.
Forsigtig: Håndtere acetone i et stinkskab. - Hældes 10 mL af H 2 O 2 i bægerglasset og derefter tilsættes 30 mL H 2 så 4 H 2 O 2 med langsom ryste for at forhindre overophedning. Sørg for, at løsningen (piranha) fuldstændig dækker kapillærer i mindst 30 min.
Forsigtighed: Vær forsigtig, mens håndtering piranha løsning (Hansen 2 SO 4 h 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Hvis piranha løsning er spildt, vaske væk løsning hurtigt med en stor mængde af vand og tørre overfladen med papirservietter.
Bemærk: Grundig rengøring af kapillærer er en af de vigtigste punkter at sikre succes for reaktionen, lampe. Det er nødvendigt at ryste den syre cylinder under renseprocessen til at fjerne boblerne i kapillærer, og den rene tid kan også udvides, når det kræves. - Vaske væk piranha løsning med en stor mængde vand. Vask kapillærer med ethanol og deioniseret vand i 5 min. Tørre kapillærer i et varmeskab.
- Pour Polydimethylsiloxan (PDMS)
- vægt ud PDMS base og hærdning reagenser med et forhold på 1:1 i en 50 mL tube. Typisk, mix 5 g af elastomer base til 5 g af elastomer hærdning agent.
- Rør blandingen grundigt i ca 5 min med en glasstav. Placere røret med PDMS i et vakuum bell jar i 30 min. til de gasning.
- Hæld PDMS langsomt ind i cylinderen af rustfrit stål mug. Tillad PDMS hærde i 3 timer i varmeskab ved 60 ° C
Bemærk: Vær omhyggelig med at undgå luftbobler, når hælde PDMS. Efter hælde PDMS, lad det stå i 5 min til naturlige fjernelse af bobler ud af PDMS.
- Fjerne mug fra PDMS
- efter hærdning af PDMS, fjerne formen ved at trække ud af formen med cylinder. Fjerne PDMS fra cylinderen ved at skære margin af formen med en skalpel.
- Vask PDMS tre gange med ethanol og deioniseret vand. Tør PDMS støtte med nitrogen.
- Behandle den nedre overflade PDMS støtte til hydrofobe. Soak PDMS støtte i en super-hydrofobe frakke for 1 s. tørre det i 10 min ved stuetemperatur.
- Indsætte kapillær til PDMS støtte
- indsætte rengjorte 4 mm kapillærer i hullerne i PDMS støtte og forlade 0,5 mm af kapillærer uden for den øverste overflade af PDMS støtte. Sørg for, at enderne af kapillærer er på samme niveau.
- Behandling af den ydre overflade af kapillærer og oversiden af PDMS støtte er hydrofobe.
- Tilføje 15 µL super-hydrofobe frakke på oversiden af PDMS støtte. Bemærk, at belægningen straks breder sig over hele den øverste overflade (herunder oversiden af PDMS støtte og den ydre overflade af den udsatte del af kapillærer) af kapillar kraft.
- Luft tørre den super-hydrofobe modificerede kapillær array.
- Fix primer til kapillær array
- forberede primer løsning. Vægt ud 0,65 g chitosan (molekylformel: (C 6 H 11 4) n) og opløses i 50 mL deioniseret vand ved at justere pH-værdien til 4,5-5,5 med eddikesyre til at opnå en chitosan koncentration af 1,3%. Forberede primer komponenter mix ifølge tabel 1. Se supplerende tabel 1 for primere
- tilføje 1,6 µL af blandingen af ét sæt primere til at fylde en tilsvarende kapillær kapillær matrixens i en foruddefineret rækkefølge.
Bemærk: De resterende to tomme kapillærer blev sat som negative kontroller. - Anker array i en gennemsigtig godt af en standard flad bundplade, som 96-brønd og tørre array ved 60 ° C i mindst 2 h.
| lampe primer fastsættelse mix komponenter (begyndelseskoncentration) | volumen (μL) |
| ddH 2 O | 17,0 |
| Chitosan (1,3%) | 1,0 |
| FIP/BIP primer (20 μM) | 2,0/2,0 |
| LoopF/LoopB primer (20 μM) | < td > 1,0/1,0|
| F3/B3 primer (20 μM) | 0,5/0,5 |
| samlede volumen | 25,0 |
tabel 1: komponenter af lampe primer fastsættelse reagenser. Komponenter af lampe primer fastsættelse mix er opført i venstre kolonne af tabellen, og omfanget af hver komponent er listet i højre kolonne.
- Saml kassetten som følger. Sætte en loading adapter på toppen af forankrede array. Sørg for, at skålen adapterens netop dækker de udsatte dele af alle ti kapillærer (Se figur 1).
figur 1: kassette fabrikation og montering. (en) rustfrit mug og PDMS støtte. Formen består af 3 dele: cylinder, dam board og søjle plade. (b) skematiske af PDMS støtte fabrikation og montering af kapillar kassetten. Hele processen indeholder 5 trin: 1. PDMS hælde, 2. skimmel fjernelse, 3. kapillær indsættelse og overfladebehandling, 4. primer fastsættelse og 5. kassette forankring. 1. Hæld PDMS i cylinder af formen; 2. Skub ud dam bestyrelsen til at fjerne støber fra PDMS støtte; 3. coat ned overfladen af PDMS støtte og derefter indsætte kapillærerne i PDMS støtte, endelig pels den øvre overflade af PDMS støtte og udsat kapillærer. Den tykke blå streg angiver super-hydrofobe frakke; 4. Læg primer til individuelle kapillærerne; 5. anker kapillær array i en enkelt 96-brønd plade og installere en prøve lastning adapteren på det. Detaljerne er blevet beskrevet i protokollen trin 1.1-1.9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. udførelsen af LAMPEN reaktion i kapillær Array
- Forbered mastermix
- forberede lampe-mastermix pr T stand 2.
- Tilføj reagenser til blandingen i den valgte rækkefølge som i tabel 2 og vortex reaktionsmiljøet for 5 s efter tilsætning af calcein. Forsigtigt iVert tube 20 gange efter Bst polymerase er tilføjet.
| lampe komponenter (indledende koncentration) | volumen (μL) |
| ddH 2 O | 11,6 |
| MgSO 4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTP'er (25 mM) | 1.4 < / t d > |
| betain (5 M) | 4.0 |
| Buffer (10 x) | 2.5 |
| Calcein (1,25 mM) | 0,5 |
| frihedsbevægelse 2 (25 mM) | 0,5 |
| Bst < /EM > polymerase (8 U/μL) | 1,5 |
| plante DNA (10 ng/μl) | 1,0 |
| samlede volumen | 25,0 |
Tabel 2: Reaktion systemet af kapillar array-LAMPEN. Komponenter af reaktion systemet af kapillar array lampe komponenter vises i venstre kolonne, og omfanget af hver komponent er listet i højre kolonne.
- indlæse reagenserne og forsegle kassetten
- Pipette 20 µL lampe reaktionsblandingen med en standard 100 µL tip. Indsæt spidsen i indløb af lastning-adapteren til at låse den. Forsigtigt injicere reaktionsmiljøet i fad med adapter; reaktionsblandingen vil hurtigt fylde skålen og derefter indlæse kapillærer automatisk gennem kapillar kraft.
- Fjerne adapter med den låste spids og forsegle godt af en PCR-kompatible gennemsigtige forsegling film.
Bemærk: Kun kapillærerne at berøre reaktionsblanding i hydrofile parabol kunne være fyldt. Så sørg for den øverste side af alle kapillærer er af samme højde (Se figur 2).
figur 2: Diagram over prøve-loading bruger lastning adapter. Billedet viser lastningen beskæftiger blå løsning som et eksempel. Indsæt spidsen ind i fjorden og injicere prøven i adapteren langsomt, og fjern derefter adapteren med låste spids. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Incubate den kapillære array i en inkubator ved 63 ° C i 1 h.
3. resultater udlæsning og dataanalyse
- erhverve billeder af fluorescens emission.
- Lave UV-filter på oversiden af en lille håndholdt UV LED lommelygte til at filtrere det synlige lys.
- Ophidse de dissocierede calcein at udlede fluorescens med UV lommelygte. Capture billeder fra toppen af den kapillære array af enten et digitalt kamera eller en smartphone.
- Når du tager et billede, sikre, at kameraet er zoomet ind på området i så vidt muligt at få høj kvalitet, klare billeder kapillærerne.
- Analysere resultaterne
- Åbn billede ved billede analyse software og vælg derefter " billede > skimmel > gråtoner > ja " og " Image > skimmel > 16 bit > ja ". Vælg " fil > Gem som > format > TIFF " til at konvertere billedet til 16-bit TIFF format.
- Uddrag værdien af fluorescens intensitet
- åben microarray analyse software. Træk den 16-bit TIFF-format billede til grænsefladen for softwaren og derefter vælge boelgelaengden " 532 nm " og en farve af " grønne " til at vise billedet.
- Opret en ny blok til at lokalisere fluorescens signalet fra kapillærerne. Vælg " værktøjer > nye blokke " og indtast antallet af kolonner og rækker som " 1; 1 " og " 2; 5 " i den ' blokke ' og ' funktioner ' grænseflader separat.
- Højre klik og vælg " funktioner " model og derefter justere placeringen og diameter til at passe området fluorescens af kapillærer. Vælg " analyser " at udvinde værdi af fluorescens intensitet.
- Vælg " fil > Gem indstillinger som " gemme blokke dokumenter og vælge " fil > Gem resultater som " at gemme fluorescens intensitet resultater. Beregne SNR for at definere, om LAMPEN udføres med succes i kapillærerne.
Bemærk: Signaler af kapillærerne blev fremstillet ved optagelse de grå værdier af steder og signal-støj-forhold (SNRs) blev defineret som forholdet mellem middelværdier i forgrunden signaler af mål for gennemsnitlig middelværdier af forgrunden signaler af to negative kontrol. Cutoff til at bestemme positive signaler blev sat som SNR > 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne metode er det vigtigt at undgå krydskontaminering mellem forskellige kapillærer under prøven lastning. Til dette formål, blev chitosan indført, som kunne bevare primere i individuelle kapillærer. For at teste, om det virkede eller ikke, vi forhånd fast ADH1 (endogene reference gen majs) primer i den kapillære kassette med mønster af "T" og "U", som illustreret i figur 3a. Som forventet, kun kapillærer indeholdt primer indstiller viser positive signaler (figur 3b).
Figur 3: eksempler på kapillær resultat. (en) layout af kapillar array. De grønne spots tyder på at ADH-1 primer sæt forud fastsat i kapillærer. (b) fluorescerende fotografier af de to kapillær arrays efter lampe. Den grønne farve præsenteret den positive lampe forstærkning. Testen blev udført i to eksemplarer. Vellykket forstærkning kun præsenteret i primer-fast kapillærer og uden forurening blandt Tom kapillærer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Til yderligere vurdering af evnen til at overvåge GMO, vi valgte syv ofte bruges transgene elementer, som dækker ~ 75% af de kommercialiserede GMO-begivenheder (dvs., P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos og nptII) (figur 4, layout) som svare til kapillærer Antallet 1-7, og én endogene reference genet for majs (ADH1). For at vise specificiteten af denne metode, tre GM begivenheder (MON863, MON89034 og 59122) vælges og anvendes til ROLIGE. For at analysere resultaterne, blev fluorescens billeder taget af kameraet og analyseret som beskrevet i protokollen trin. Forventede resultater blev opnået for alle test (figur 4). For eksempel, for GM-majs MON863, positive signaler blev opnået for kapillærer 1, 6, 7 og 8, som svarer til mål P-CaMV35S, T-nos, nptII og endogene reference gen ADH1, henholdsvis.
Figur 4: specificitet for overvågning af GMO'er. Påvisning af forskellige DNA-prøver, dvs., MON863, MON89034, 59122, mix af alle de ovennævnte tre GM begivenheder (GMO mix), ikke-GM-majs og rent vand (ingen skabelon kontrol, NTC). 1 - 8: kapillærer pre fast med lampe primer sæt af P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, og ADH-1, individuelt. 9 - 10, to nej-primer kontrolelementer. Testen blev udført i to eksemplarer og vi fandt, at alle resultaterne var i overensstemmelse med forventninger. Se supplerende tabel 2 for dataanalyse venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at teste effektiviteten af vores metode i en virkelig verden ansøgning, blev to praktiske majs prøver udvalgt til analyse af ro. Derefter blev resultaterne sammenlignet med real-time PCR og resultater var konsistente (figur 5, supplerende tabel 2)
Figur 5: resultater af test to majs prøver. 1 - 8: kapillærer pre fast med lampe primer sæt af P-CaMV35S, bar, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII, og ADH-1, individuelt. 9 - 10, to nej-primer kontrolelementer. Testen blev udført i to eksemplarer og derefter resultaterne blev sammenlignet med real-time PCR og resultaterne var konsekvent. Se supplerende tabel 3 sammenligning resultater. Se supplerende tabel 2 for dataanalyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende tabel 1: liste af lampe primer sekvenser. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: dataanalyse af LAMPEN array eksperimenter. De grønne farvekodede celler i tabellen viser det positive resultat. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3: real-time PCR resultater Indberetningsskema. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ROLIGE platform vist her, som kombinerer den lampe teknologi med en kapillær array, muliggør samtidige påvisning af flere GMO-relaterede gen mål i en enkelt, meget effektiv og nem at betjene test.
Med succes klarer de multiplex lampe reaktioner i kassetten, skal tre kritiske punkter at blive bemærket. For det første, at opnå den samme højde for den øverste side af kapillærer og de hydrofile og hydrofobe mønster af matrixen kapillær er kritiske for samtidig ilægning reagenser i alle kapillærer. Kapillærerne bør bringes på linje af en plade efter første indsættelse i PDMS støtte til at sikre dem alle kan røre den indlæste reaktionsblandingen i fad med lastning adapter. Ved behandling af kapillar array med super-hydrofobe pelsen, Tillad ikke pels til at suge ind i den indvendige overflade af kapillærerne. Behandling af den ydre overflade af kapillærerne ved bare loading frakke på oversiden af toppen PDMS støtte, giver belægningen til at sprede sig til den ydre overflade af de øvre dele af kapillærerne. Hvis det sker indimellem, at ikke alle kapillærer er fyldt med reagenserne, kan det være klogt at indlæse reagens direkte ind i en specifik kapillær.
For det andet, være omhyggelig med udarbejdelse af lampe reagenser. Hele processen skal forsigtigt og hurtigt gennemføres på isen, på grund af relativt lav reaktion temperatur i LAMPEN og skrøbelighed af Bst -polymerase. Det er tilrådeligt at ryste reaktion tube med lampe blandingen forsigtigt i stedet for vortexing røret voldsomt efter at tilføje Bst polymerase. En uhensigtsmæssig håndtering kan forårsage svigt af reaktionen. I dette eksperiment, ADH1 (endogene reference gen majs) er angivet som den positive kontrol og to kapillærer uden primere er angivet som Tom kontrolelementer. Så, hvis lampe blanding håndteres korrekt, den positive kontrol ville vise grøn og blindprøvekontrollen ville forblive uændret efter testen er udført.
For det tredje, på grund af den høje effektivitet af lampe reaktion, falsk positive eller fremførsel kontaminering kan ske hvis der er et spor mængde af DNA-amplikon i miljøet. Derfor altid ihukomme at de operationelle processer før reaktion og efter reaktion skal være strengt adskilt i forskellige områder og lampe produkter bør være tæt forseglet og kasseres efter analyse. Derudover fastsættes en blindkontroller til indikering af en passende ydelse af LAMPEN.
Uløseligt, er ro en universel multi-Target nukleinsyre påvisningsmetode med god fleksibilitet og udvidelsesmuligheder. LAMPE reaktioner udført i kapillærer kan nemt erstattes af andre typer af isotermisk forstærkning metoder, såsom rullende cirkel forstærkning (RCA)29og recombinase polymerase forstærkning (RPA)30. Det kan også anvendes i andre påvisning områder som patogen detektion27 og sygdom diagnose31.
I den nuværende form af denne metode, selvom primer sæt er forud fastsat med chitosan, er processen med lampe blanding forberedelse stadig nødvendig, når prøven udføres, som sænker enkelheden af metoden. For at løse dette, vil vi forsøge at Forudindlæs alle reagenser af lampe i kapillær og derefter afpipetteres prøven i kassetten. En anden begrænsning for vores metode kan være manglen på nukleinsyre udvinding, men vi er nu ved at udvikle en mobil-baseret maskine, som ville kombinere udvinding af nukleinsyrer, automatiske billede at tage og dataanalyse til at opnå en reel "prøve- og resultater "metode.
I Resumé, har vi udviklet den ROLIGE platform ved at integrere multiplex lampe med en kapillær array. Som en generel nukleinsyre påvisningsmetode, kan ro også har potentiale i en lang række andre nukleinsyre analyse applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse var delvis finansieret af National Natural Science Foundation i Kina tilskud (31370813, 3147670, 31670831 og 31600672,), den nationale transgene planter særlig fond (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), programmet for nye århundrede fremragende talenter i Universitet, nationale centrale forskning og udviklingsprojekt af Kina (2016YFA0500601) og Kina postdoc Science Foundation (2016M 591667).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
- Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
- Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
- Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
- Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
- Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
- Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
- Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
- Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
- Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
- Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
- Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
- Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
- Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
- Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
- Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
- Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
- Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
- Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
- Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
- Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
- Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
- Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
- Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
- Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
- Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
- Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).
