活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

摘要

本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。

摘要

动物和植物组织由不同类型的细胞群体组成。这些细胞通过随时间相互作用来构建并维持组织，当其功能受到干扰时可能导致疾病。科学家已开发出巧妙的技术，通过在部分细胞中表达荧光蛋白，来研究完整组织内细胞的特性及其自然动态。然而，在某些情况下，实验需要对组织内的细胞进行更精确的可视化观察，有时需达到单个细胞或特定细胞群体的水平。为了实现对细胞群体中单个细胞的可视化，科学家采用了荧光蛋白的单细胞光转化技术。为演示该技术，本文展示了如何将紫外光定向照射至完整活体斑马鱼中表达Eos蛋白的特定细胞，随后在24小时后成像观察这些发生光转化的Eos⁺细胞在组织中的变化情况。本文描述了两种技术：单细胞光转化和细胞群体的光转化。这些技术可用于可视化细胞间的相互作用、细胞命运与分化过程以及细胞迁移行为，因而适用于多种生物学问题的研究。

引言

多种不同的细胞相互作用，共同构建并维持复杂的动物和植物组织。这些细胞常常相互交错，在单细胞水平上难以与邻近细胞区分，除非使用需要组织固定的高分辨率显微镜技术。然而，为了理解这些组织如何形成、维持以及发生病变，至关重要的是研究组织内单个细胞随时间推移的相互作用方式。理想情况下，这类实验需要以非侵入性的方式对组织内的单个细胞进行标记，且无需固定步骤。目前，科学家已开发出多种技术来实现这一目标^1,2,3,4。

水母绿色荧光蛋白（GFP）的发现与应用是一种令人振奋的方法，使得在组织环境中对特定细胞进行标记成为可能¹。通过使用细胞特异性启动子，可以在遗传水平上选择性地标记特定的细胞亚群¹。另一种方法是利用病毒诱导GFP表达，从而实现用户选定的GFP表达模式^3,4。尽管这些方法非常有用，但基于遗传手段的GFP表达无法在组织内的特定细胞亚群中实现用户指定的表达；而病毒介导的GFP表达虽然具有优势，却可能具有侵入性。随着GFP衍生物的开发以及诸如Brainbow等巧妙技术的出现，能够在组织中更稀疏地表达不同的荧光蛋白，从而使得在复杂组织中观察单个细胞及其相互作用成为可能^2,5。然而，这些方法对细胞的标记是随机的。如果实验需要对由研究者明确定义的单个细胞或细胞群体进行可视化，则这些方法存在局限性。对于此类实验，若能拥有一种可遗传表达的荧光蛋白，并可通过操作在单细胞水平上将其与其他荧光或非荧光细胞区分开来，将具有显著优势。

为了实现这一目标并可视化复杂活体组织中单个细胞的细胞生物学行为，科学界采用对不同荧光蛋白进行单细胞光转化的技术^6,7,8。通过基因调控表达一种光可转化蛋白（例如，eos、kaede等），该蛋白在紫外光（488 nm）照射下会从绿色荧光转变为红色荧光，从而可将单个细胞与其周围荧光标记的邻近细胞区分开来^6,7,8。该方法利用连接在共聚焦显微镜上的装置，将激光束引导至一个衍射极限范围内的特定区域。借助该技术，我们可以按照用户自定义的方式标记单个细胞或较大规模的细胞群体^9,10,11。与通过病毒载体向单细胞注射GFP相比，该技术侵入性极小。作为概念验证，我们展示了可在周围神经系统中的神经节内对单个细胞进行光转化，也可对位于脊髓腹侧等较大范围的细胞群体进行光转化^9,10,11,12。随后，我们可在24小时后观察这些光转化后的细胞群体，以深入了解其在发育过程中的迁移与分化行为。

方案

所有动物实验均经圣母大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 斑马鱼样本的制备

1. 按照标准操作规程，将一条成年雄性与一条成年雌性 Tg(可转换蛋白) 鱼放入一个交配室中¹³。本研究中使用 Tg(sox10:eos) 鱼系⁹，因实验条件可及，但其他表达光转换蛋白的转基因品系亦可等效使用。建议设置多个交配室，以防鱼类未产卵。让鱼在交配室中过夜。
2. 次日早晨，将受精卵收集至 100 mm 培养皿中。待卵发育至受精后 24 小时（hpf）再进行筛选。
3. 若上述亲鱼为转基因杂合子，则在解剖显微镜下使用 488 nm 光源和 GFP 滤光片组合，筛选 24 hpf 培养皿中的 Tg(sox10:eos)+ 胚胎。分离出 Tg(sox10:eos)+ 胚胎，并继续培养至 48 hpf。
4. 使用针或镊子手动去除胚胎的卵膜。
5. 制备 5 mL 0.8% 低熔点琼脂糖溶液，并用微波炉加热溶解。
   1. 待琼脂糖冷却至可触碰温度后，将 3–4 条经麻醉处理的 Tg(sox10:eos)+ 48 hpf 鱼置于 10 mm 玻璃底培养皿中央。
   2. 加入足量琼脂糖覆盖盖玻片表面，约 1 mL。使用探针针调整鱼体侧卧位置。待琼脂糖凝固以确保动物固定到位。在琼脂糖凝固过程中可能需要持续调整斑马鱼的位置¹⁴。凝固过程约需 2 分钟。
6. 琼脂糖凝固约 2 分钟后，缓慢向培养皿中加入含有 0.02% 氨基苯甲酸酯（Tricaine）的胚胎培养基，直至琼脂糖底部及培养皿完全浸没，体积约为 3 mL。

2. 显微镜安装与转换前成像

1. 打开共聚焦显微镜软件，选择采集和对焦窗口 [图1]。在采集窗口下，从采集设置下拉菜单中选择实验室专用的转换成像设置 [图1]。此处，实验室专用设置名为 "Fish Imaging."
2. 将样本放置在共聚焦显微镜载物台上，使用粗调和微调旋钮进行对焦。
3. 打开对焦窗口，定位目标区域（例如背根神经节）。
4. 在滤光片设置菜单中选择 c488  激光。将曝光时间设为 300 ms，激光功率设为 5，增益设为 75 [图2]。
5. 在 采集类型 部分勾选 3D 选项。在 3D 采集 部分，选择 使用当前位置 并勾选 围绕当前位置。在同一部分中，将范围设为 35，平面数设为 36，步进大小设为 1。可根据成像区域的深度适当增加或减少范围。对于脊髓，通常设置 35–40 层堆栈即可满足需求 [图5]。
6. 选择当前位置 [图5]。
7. 点击采集窗口底部的“开始”按钮以获取图像。

3. 单细胞光转化

1. 打开共聚焦软件，选择采集和对焦窗口 [图1]。在采集窗口下，从采集设置下拉菜单中选择实验室特定的转化成像设置 [图1]。此处，实验室特定的设置名为 "Fish ablate full chip."
2. 在滤光片设置菜单中选择 c488 和 c541 激光。如果未使用相同的显微镜软件，请找到用于选择不同激光的菜单，并选择 488 nm 和 541 nm 激光。将曝光时间设为 300 ms，激光功率设为 5，增益设为 75 [图2]。这些激光参数的选择基于在不引起光漂白或光毒性的前提下产生足够的荧光信号。若观察到光毒性或光漂白现象，请降低激光功率或曝光时间。
3. 打开对焦窗口，并点击对焦窗口中的光操作选项卡。相应调整激光参数。将激光堆栈功率改为 2，然后点击 Go。将扫描块大小（Raster block size）改为 1，然后点击 Set。将双击大小（Double-click size）改为 4。将激光线改为 v405 [图3]。
4. 在采集窗口中打开高级采集设置。选择光操作选项卡，并将双击重复次数（Double-click repetitions）改为 2。点击确定 [图4]。
5. 在对焦窗口中选择 XY 选项卡。再次检查步骤 2 中光操作选项卡中的激光参数 [图3，图4]。设置激光参数，以实现对目标细胞的光转化，同时避免周围细胞发生光转化。
   1. 若相邻细胞出现光转化，请降低激光功率；若目标细胞未发生光转化，可适当提高激光功率。理想情况下，应将激光功率设置为仅转化目标区域，而不影响周围区域。
6. 在采集类型下勾选时间序列（timelapse）选项，然后点击 Start [图6A]。
7. 当实时时间序列窗口打开后，在顶部工具栏中选择圆形工具 [图7]。
8. 在细胞最中心区域绘制一个圆。右键点击所绘制的圆，选择 FRAP 区域，并等待 3 秒。所选区域应变暗 [图8]。点击 停止采集。
9. 若需对多个动物进行成像，请返回对焦菜单中的 XY 选项卡，并选择位置 2，然后重复步骤 4.1–4.6。
10. 若需转化一群细胞，请按照步骤 4.1–4.4 的方案和激光参数操作，但不要使用圆形工具标记 FRAP 区域，而应改用线条工具。在目标区域上绘制一条线，并使用上述相同参数对该区域进行 FRAP 操作。

4. 光转化后成像

1. 所有点完成光转化后，选择转换前成像步骤3中所述的实验室特定标准图像堆栈设置。该设置位于采集窗口的捕获设置下拉选项卡中 [图5]。
2. 选择c488激光器，将曝光时间设为300 ms，激光功率设为5，增益设为75 [图2]。
3. 在与c488激光器相同的菜单下选择c541激光器。将曝光时间设为500 ms，激光功率设为10，增益设为75 [图9]。
4. 在采集类型部分勾选3D选项。在3D采集部分，选择使用当前位置并勾选“围绕当前位置的范围”。在同一部分中，将范围设为35，平面数设为36，步长设为1。可根据所需的成像深度适当增加或减少范围数值 [图5]。
5. 如果XY焦点选项卡中存在多个点，则在采集窗口中选择多点列表选项；否则选择当前位置。
6. 点击采集窗口底部的“开始”按钮以获取图像。

结果

荧光蛋白的光转化可用于标记组织内不同的细胞⁶。为演示此技术，使用了Tg(sox10:eos)鱼⁹，使其在sox10调控序列驱动下表达可光转化蛋白Eos。在48小时发育阶段（hpf）时，先将Tg(sox10:eos)鱼体固定并成像，以检测是否发生非特异性光转化。随后观察到Eos未光转化的荧光信号较强，而光转化后的Eos荧光信号较弱（图10）。实验过程中将样品避光保存，以确保非特异性光转化程度最低。接着，利用共聚焦显微镜系统对目标区域施加紫外光照射。为确认单个细胞因紫外光照射而发生光转化，我们采集了覆盖光转化区域的z轴层扫图像。结果一致表明，成功实现了光转化：在目标区域外几乎未检测到未转化的Eos信号，而在目标区域内则明显存在光转化后的Eos信号。最终图像显示，神经节中的单个细胞被明确地标记出来，与其邻近细胞清晰区分（图10

讨论

在复杂的组织中，不同类型的细胞会组织成特定的区域。近年来，已有技术被用于标记这些大型组织结构中的单个细胞^1,2,3。本文展示了两种可用于可视化复杂组织内单个细胞相互作用以及细胞群体相互作用的技术。光转化技术的优势在于研究人员能够对细胞进行空间特异性的标记。借助具备在较大成像窗口内选择性照射较小成像区域功能的显微镜，可以对单个细胞或单个细胞区域进行区别于其他细胞的标记。目前已有多种可光转化蛋白被引入科研领域，使该技术得到更广泛的应用⁷。由于能够在细胞内对蛋白进行光转化，研究人员已利用该技术或类似方法研究细胞迁移、细胞分化以及神经环路分析。

尽管软件和特定激光参数与我们实验室的条件相关，但本文展示了利用光转化蛋白 Eos 在神经节内区分单个细胞的通用能力。遗憾的是，大多数可用于驱动荧光蛋白表达的遗传调控区域在发育早期阶段会在神经节内广泛表达。这很可能是因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tg(sox10:eos) 斑马鱼个体			鱼类由圣母大学鱼类设施提供并进行杂交繁殖
100 X 15 mm 培养皿	VWR	25384-302
胚胎培养基			胚胎培养基由圣母大学鱼类养殖 facility 每周配制并提供，包含 5 L RO 水、30 μL 亚甲蓝和 200 mL 盐母液。
0.8% 低熔点琼脂糖	dot scientific inc	9012-36-6
35 × 10 mm 玻璃盖玻片底培养皿	Ted Pella Inc.	14021-20
解剖针探头
0.002% 3-氨基苯甲酸酯（Tricaine）	Fluka 分析级	A5040-250G
配备GFP滤光片的荧光解剖显微镜	蔡司 Axiozoom
配备激发GFP和RFP滤光片组的激光共聚焦显微镜	3i 转盘共聚焦显微镜
用于光转化的紫外光源（激光）	405 nm 激光器
Slidebook 软件	3i
亚甲蓝	Kordon