本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
动物和植物组织由不同类型的细胞群体组成。这些细胞通过随时间相互作用来构建并维持组织，当其功能受到干扰时可能导致疾病。科学家已开发出巧妙的技术，通过在部分细胞中表达荧光蛋白，来研究完整组织内细胞的特性及其自然动态。然而，在某些情况下，实验需要对组织内的细胞进行更精确的可视化观察，有时需达到单个细胞或特定细胞群体的水平。为了实现对细胞群体中单个细胞的可视化，科学家采用了荧光蛋白的单细胞光转化技术。为演示该技术，本文展示了如何将紫外光定向照射至完整活体斑马鱼中表达Eos蛋白的特定细胞，随后在24小时后成像观察这些发生光转化的Eos+细胞在组织中的变化情况。本文描述了两种技术：单细胞光转化和细胞群体的光转化。这些技术可用于可视化细胞间的相互作用、细胞命运与分化过程以及细胞迁移行为，因而适用于多种生物学问题的研究。
引言
多种不同的细胞相互作用，共同构建并维持复杂的动物和植物组织。这些细胞常常相互交错，在单细胞水平上难以与邻近细胞区分，除非使用需要组织固定的高分辨率显微镜技术。然而，为了理解这些组织如何形成、维持以及发生病变，至关重要的是研究组织内单个细胞随时间推移的相互作用方式。理想情况下，这类实验需要以非侵入性的方式对组织内的单个细胞进行标记，且无需固定步骤。目前，科学家已开发出多种技术来实现这一目标1,2,3,4。
水母绿色荧光蛋白（GFP）的发现与应用是一种令人振奋的方法，使得在组织环境中对特定细胞进行标记成为可能1。通过使用细胞特异性启动子，可以在遗传水平上选择性地标记特定的细胞亚群1。另一种方法是利用病毒诱导GFP表达，从而实现用户选定的GFP表达模式3,4。尽管这些方法非常有用，但基于遗传手段的GFP表达无法在组织内的特定细胞亚群中实现用户指定的表达；而病毒介导的GFP表达虽然具有优势，却可能具有侵入性。随着GFP衍....
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方案
所有动物实验均经圣母大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 斑马鱼样本的制备
- 按照标准操作规程，将一条成年雄性与一条成年雌性 Tg(可转换蛋白) 鱼放入一个交配室中13。本研究中使用 Tg(sox10:eos) 鱼系9，因实验条件可及，但其他表达光转换蛋白的转基因品系亦可等效使用。建议设置多个交配室，以防鱼类未产卵。让鱼在交配室中过夜。
- 次日早晨，将受精卵收集至 100 mm 培养皿中。待卵发育至受精后 24 小时（hpf）再进行筛选。
- 若上述亲鱼为转基因杂合子，则在解剖显微镜下使用 488 nm 光源和 GFP 滤光片组合，筛选 24 hpf 培养皿中的 Tg(sox10:eos)+ 胚胎。分离出 Tg(sox10:eos)+ 胚胎，并继续培养至 48 hpf。
- 使用针或镊子手动去除胚胎的卵膜。
- 制备 5 mL 0.8% 低熔点琼脂糖溶液，并用微波炉加热溶解。
- 待琼脂糖冷却至可触碰温度后，将 3–4 条经麻醉处理的 Tg(sox10:eos)+ 48 hpf 鱼置于 10 mm 玻璃底培养皿中央。
- 加入足量琼脂糖覆盖盖玻片表面，约 1 mL。使用探针针调整鱼体侧卧位置。待琼脂糖凝固以确保动物固定到位。在琼脂糖凝固过程中可能需要持续....
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结果
荧光蛋白的光转化可用于标记组织内不同的细胞6。为演示此技术，使用了Tg(sox10:eos)鱼类9，使其在sox10调控序列驱动下表达可光转化蛋白Eos。在48 hpf时，先将Tg(sox10:eos)动物固定，然后成像以检测可能发生的非特异性光转化。随后观察到Eos未光转化的荧光信号，而Eos光转化后的荧光信号较弱（图10）。实验过程中将动物置于黑暗环境中，以确保非特异性光转化降至最低。接着，利用共聚焦显微镜系统对感兴趣区域进行紫外光照射。为确认单个细胞因紫外光照射而发生光转化，我们采集了覆盖光转化区域的z轴层扫图像。结果一致表明，成功实现了光转化：在感兴趣区域外几乎未检测到未转化的Eos信号，而在感兴趣区域内则明显存在光转化后的Eos信号。最终图像显示，神经节内一个细胞被明确地标记出来，与其邻近细胞清晰区分（图10
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讨论
在复杂的组织中，不同类型的细胞会组织成特定的区域。近年来，已有技术被用于标记这些大型组织结构中的单个细胞1,2,3。本文展示了两种可用于可视化复杂组织内单个细胞相互作用以及细胞群体相互作用的技术。光转化技术的优势在于研究人员能够对细胞进行空间特异性的标记。借助具备在较大成像窗口内选择性照射较小成像区域功能的显微镜，可以对单个细胞或单个细胞区域进行区别于其他细胞的标记。目前已有多种可光转化蛋白被引入科研领域，使该技术得到更广泛的应用7。由于能够在细胞内对蛋白进行光转化，研究人员已利用该技术或类似方法研究细胞迁移、细胞分化以及神经环路分析。
尽管软件和特定激光参数与我们实验室的条件相关，但本文展示了利用光转化蛋白 Eos 在神经节内区分单个细胞的通用能力。遗憾的是，大多数可用于驱动荧光蛋白表达的遗传调控区域在发育早期阶段会在神经节内广泛表达。这很可能是因.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Bernard Kulemaka 和 Smith 实验室成员提供的有益评论和试剂指导，感谢 3i 公司的 Sam Connell 和 Brent Redford 解答成像相关问题，感谢 Deborah Bang、Karen Heed 和 Kay Stewart 对斑马鱼的饲养与护理。本研究得到了圣母大学、Elizabeth 和 Michael Gallagher 家庭、Alfred P. Sloan 基金会、圣母大学斑马鱼研究中心以及圣母大学干细胞与再生医学中心的支持。所有动物实验均依照圣母大学 IACUC 的规定，在 Cody Smith 博士的指导下进行。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tg(sox10:eos) 斑马鱼个体 | 鱼类由圣母大学鱼类设施提供并进行杂交繁殖 | ||
| 100 X 15 mm 培养皿 | VWR | 25384-302 | |
| 胚胎培养基 | 胚胎培养基由圣母大学鱼类养殖 facility 每周配制并提供，包含 5 L RO 水、30 μL 亚甲蓝和 200 mL 盐母液。 | ||
| 0.8% 低熔点琼脂糖 | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 × 10 mm 玻璃盖玻片底培养皿 | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| 解剖针探头 | |||
| 0.002% 3-氨基苯甲酸酯（Tricaine） | Fluka 分析级 | A5040-250G | |
| 配备GFP滤光片的荧光解剖显微镜 | 蔡司 Axiozoom | ||
| 配备激发GFP和RFP滤光片组的激光共聚焦显微镜 | 3i 转盘共聚焦显微镜 | ||
| 用于光转化的紫外光源（激光） | 405 nm 激光器 | ||
| Slidebook 软件 | 3i | ||
| 亚甲蓝 | Kordon |
参考文献
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent prot....
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重印与许可
