本文介绍了一种用于检验多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中作用的实验方法。
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本文内容
摘要
摘要
多拷贝质粒在原核生物中极为常见，但其在细菌进化中的作用仍不清楚。我们最近的研究表明，多拷贝质粒通过增加每个细胞中基因的拷贝数，能够加速质粒编码基因的进化。在本研究中，我们提出了一种实验系统，用于检测多拷贝质粒促进基因进化的潜力。利用简单的分子生物学方法，我们构建了一个模型系统，可将抗生素抗性基因插入大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655 的染色体或一个多拷贝质粒中。我们采用实验进化方法，在逐渐增加抗生素浓度的条件下传代培养不同菌株，并随时间测量细菌群体的存活情况。所选用的抗生素分子和抗性基因具有如下特性：该基因只能通过获得突变才能赋予抗性。这种"进化拯救"方法为检测多拷贝质粒促进抗生素抗性获得的潜力提供了一种简便手段。在实验系统的下一步中，对抗生素抗性的分子基础进行表征。为了鉴定导致抗生素抗性获得的突变，我们对来自全群体和克隆的样本进行深度DNA测序。最后，为了验证这些突变在目标基因中所起的作用，我们将它们重建到亲本背景中，并检测所获得菌株的抗性表型。
引言
细菌对抗生素的耐药性是一个重大的健康问题1。从基本层面来看，致病菌中抗生素耐药性的传播是自然选择驱动进化的简单实例2,3。简而言之，抗生素的使用会筛选出耐药菌株。因此，进化生物学中的一个关键问题是理解影响细菌种群进化出抗生素耐药性能力的各种因素。选择实验已成为研究细菌进化生物学的强有力工具，该领域已对广泛的进化问题提供了极为深刻的见解4,5,6。在实验进化中，从单一亲本菌株起始的细菌种群在明确定义且严格控制的条件下进行连续传代。在这些培养物生长过程中发生的某些突变可提高细菌的适应性，这些突变通过自然选择在培养物中扩散。实验过程中，会定期将种群样本进行低温冷冻保存，从而建立一个不继续进化的冷冻“化石记录”。可采用多种方法来表征正在进化的细菌种群，其中最常见的两种方法是适合度测定——用于测量进化后的细菌与其远祖菌株竞争的能力——以及全基因组测序，用于鉴定驱动适应性进化的遗传变化。继理查德·伦斯基（Richard Lenski）及其同事的开创性工作之后7,8，实验进化中的标....
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方案
1. 编码抗生素抗性基因的实验系统构建
注意：此处使用大肠杆菌（E. coli）MG1655 作为携带质粒或染色体编码抗生素抗性基因的受体菌株。该抗生素抗性基因位于染色体或高拷贝质粒上，其余遗传背景完全相同（图1）。
- 将抗生素抗性基因插入染色体 MG1655 的 λ 噬菌体整合位点（attB）20。
- 通过 PCR 扩增染色体 attB 位点两侧各 500 bp 长的区域。使用引物 YbhC-F（5'- CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3'）和 attB-R（5'- GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3'）扩增左侧同源区域，使用引物 attB-F（5'- AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3'）和 YbhB/R（5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3'）扩增右侧同源区域。使用引物 Tem1-pBAD-F（5'- TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3'）和 Tem1-pBAD-R（5'- TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'）....
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结果
在我们之前的研究中，探讨了β-内酰胺酶基因blaTEM-1向赋予对第三代头孢菌素头孢他啶耐药性进化的过程12。选择该基因的原因是，尽管TEM-1本身不赋予对头孢他啶的耐药性，但blaTEM-1中的突变可扩展TEM-1的活性范围，使其能够水解如头孢他啶等头孢菌素29。在抗生素耐药酶（如β-内酰胺酶或氨基糖苷类修饰酶）中，导致其底物谱发生变化的突变十分常见29,30。该实验体系非常适合用于研究此类酶的进化过程。有关按照本方案成功开展实验的详细报告，请参见San Millan et al. 201612。
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讨论
我们提出了一种新的实验方案，结合分子生物学、实验进化和深度DNA测序技术，旨在研究多拷贝质粒在细菌抗生素耐药性进化中的作用。尽管该方案整合了多个领域的技术，但所需方法均较为简单，可在常规微生物学实验室中完成。方案中最关键的步骤可能是模型系统菌株的构建，以及实验进化后所观察到的突变的重建（这两步采用完全相同的方法）。然而，等温组装系统21显著简化了该流程，因此任何具备中等分子生物学经验的研究人员均可顺利实施。
该方案的另一个关键步骤是在抗生素浓度递增条件下的实验进化。以本方案为例，实验起始时采用 ¼-1/8 最小抑菌浓度（MIC）的抗生素浓度，并每天将抗生素浓度加倍。然而，较低的抗生素浓度递增速率可能会提高细菌种群通过进化救援避免灭绝的概率26因此，抗生素浓度的变化速率是可被调整以促进抗生素耐药性进化的参数之一。
DNA测序与分析也是实验设计的关键环节。在实验的不同时间点，对整个群体以及单个克隆的DNA样本进行测序，所获得的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由卡洛斯三世健康研究所（2013–2016 年国家 I+D+i 计划）资助：项目编号 CP15-00012、PI16-00860 和 CIBER（CB06/02/0053），以上项目由欧洲区域发展基金“迈向欧洲”（ERDF）共同资助。JAE 由 吸引人才 马德里自治区政府项目（2016-T1/BIO-1105）以及西班牙经济、工业与竞争力部卓越研发项目（BIO2017-85056-P）。ASM 获得卡洛斯三世健康研究所 Miguel Servet 奖学金（MS15/00012）资助，该奖学金由欧洲社会基金共同资助。 "投资你的未来" （欧洲结构基金，ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PCR仪 | BioRad | C1000 | |
| 电穿孔仪 | BiorRad | 1652660 | |
| 电穿孔比色皿 | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | 通过测定260nm/280nm和260nm/230nm吸光度比值来评估DNA质量 |
| 培养箱 | Memmert | UF1060 | |
| 摇床培养箱 | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| 电泳电源 | BioRad | 1645070 | 琼脂糖凝胶电泳 |
| 电泳槽 | BioRad | 1704405 | 琼脂糖凝胶电泳 |
| 移液器 | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| 多通道移液器 | Biohit | 728220, 728230, 728240 | |
| 多功能酶标仪 Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| 接种环 | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96孔板 | Falcon | 351172 | |
| LB培养基 | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB琼脂 | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson组装试剂 | New England Biolabs | E2611S | |
| 限制性内切酶 | Fermentas FastDigest | ||
| 抗生素 | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | 质粒提取试剂盒 |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | 基因组DNA提取试剂盒 |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | 基因组DNA提取试剂盒 |
| 电穿孔比色皿 | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| 培养皿 | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| 冻存管 | ClearLine | 390701 | |
| 96孔板（-80ºC储存） | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA检测系统 | Promega | E2670 | DNA浓度定量 |
| 琼脂糖 | BioRad | 1613100 | 琼脂糖凝胶电泳 |
| 50x TAE缓冲液 | BioRad | 1610743 | 琼脂糖凝胶电泳 |
| T4多聚核苷酸激酶 | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
参考文献
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- M....
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重印与许可
