Summary
Il y a pénurie d’importants donateurs du foie, et les critères pour les donateurs du foie ont été élargies. La perfusion normothermique ex vivo du foie (NEVLP) a été développée pour évaluer et modifier les fonctions organiques. Cette étude illustre un modèle de rat de NEVLP et teste la capacité de pégylé-catalase, d’atténuer les lésions hépatiques de préservation.
Abstract
Il y a une pénurie importante de foie allografts destinés à la transplantation, et en réponse aux critères des donateurs ont été élargies. En conséquence, normothermique ex vivo foie perfusion (NEVLP) a été présentée comme une méthode pour évaluer et modifier les fonctions organiques. NEVLP présente de nombreux avantages en comparaison avec hypothermie et subnormothermic perfusion incluant réduit les blessures de préservation, restauration de la fonction des organes normaux dans des conditions physiologiques, évaluation des performances de l’orgue et comme plate-forme pour la réparation de l’orgue , rénovation et modification. Les modèles murins et porcines de NEVLP ont été décrits. Nous montrer un modèle de rat de NEVLP et utiliser ce modèle pour montrer une de ses applications importantes — l’utilisation d’une molécule thérapeutique ajoutée au milieu de perfusion hépatique. La catalase est un endogène réactives de l’oxygène (DRO) Trésor et a été démontrée pour diminuer l’ischémie-reperfusion dans le œil, du cerveau et du poumon. PEGylation a été démontrée pour cibler la catalase à l’endothélium. Ici, nous avons ajouté pégylé-catalase (PEG-CAT) pour le perfusat base et démontré sa capacité à atténuer les lésions hépatiques de préservation. Un avantage de notre modèle de NEVLP rongeur est qu’il est peu coûteux en comparaison à des modèles animaux plus gros. Une limitation de cette étude est qu’il ne comprend pas actuellement perfusion après une greffe du foie. Donc, de prédiction de la fonction de la transplantation d’organes après ne peut pas prévoir avec certitude. Toutefois, le modèle de greffe du foie chez le rat est bien établi et pourrait certainement être utilisé conjointement avec ce modèle. En conclusion, nous avons démontré un modèle NEVLP simple, peu coûteux et facile à reproduire à l’aide de rats. Les applications de ce modèle peuvent inclure essai roman perfusats et additifs perfusat, test logiciel conçu pour l’évaluation de l’orgue et expériences visant à réparer les organes.
Introduction
Il y a 14 578 patients sur la liste d’attente pour une transplantation du foie et environ 7 000 greffes sont effectuées par an1,2. En réponse à cette pénurie d’importants donateurs, ont élargi les critères pour les donateurs du foie ; ceux-ci sont souvent appelés organes marginaux ou donateurs critères étendus et sont censés effectuer moins bien après la transplantation que les allogreffes de critères standards, avec des taux plus élevés de la dysfonction primaire greffe et greffon retardée fonction3, 4,5,6. Ainsi, NEVLP a été présenté comme une méthode pour évaluer et modifier les organes fonction6,7. Nous avons conçu un modèle de rat de NEVLP et utilisé ce modèle pour démontrer une de ses applications potentielles importantes – l’essai des additifs nouvelle molécule au milieu de perfusion hépatique.
NEVLP a été évaluée en modèles porcins et murin (rat), ainsi que dans les organes humains mis au rebut6,8,9. Les résultats des premiers essais humains de NEVLP ont été également récemment publié10. Bien que la perfusion hypothermique machine est clairement devenue la norme pour la préservation du rein, la température à quelle machine hépatique en cas de perfusion est encore controversée. NEVLP présente de nombreux avantages proposés par rapport à état d’hypothermie et de la perfusion de subnormothermic. Il s’agit de blessures réduit de préservation, restauration de la fonction des organes normaux dans des conditions physiologiques, la capacité d’évaluer les performances de l’orgue et comme plate-forme pour orgue réparation, rénovation et modification7,11, 12,13,14,15,16,17.
Un nombre important d’études ont été réalisé à l’aide de modèles NEVLP porcines. Bien que ces modèles sont relativement peu coûteux lorsque tenant compte des modèles à l’aide de jeté les organes humains ou essais cliniques humains, ils sont très chers par rapport à notre petit modèle animal de NEVLP. Une composante importante de la par expérience il en coûte le perfusat. Nous sommes en mesure d’achever une perfusion de 4 h avec 300 mL de milieu de perfusion à un coût relativement faible. En outre, le coût des petits animaux, y compris des rats est très faible en comparaison avec le coût des porcs.
En comparaison avec d’autres modèles de NEVLP chez le rat, le modèle présenté ici est relativement simple à implémenter et a une large gamme d’applications. Le circuit de perfusion peut être vu dans la Figure 1. Le perfusat commence dans le réservoir du perfusat (1), qui est un réservoir d’eau chemisé. Perfusat est tiré du réservoir par une pompe à rouleaux (2) et poussé dans une windkessel (3), puis l’oxygénateur (4). L’oxygénateur est définie pour gaz à contre-courant et perfusat flux d’échange gazeux maximale. Le perfusat entreprend alors d’un chauffage (5) à l’intérieur, la chambre de perfusion pour vérifier qu’elle est à température physiologique, d’entreposage et un barboteur (6) afin d’éviter la perfusion des bulles d’air sont pré orgue (7) et post-orgue (8) les fenêtres Echantillon, qui permettent le perfusat à être échantillonnés. Le perfusat entre alors dans le foie via la veine porte de canule. La canule de la veine porte est attachée à un moniteur de pression qui retrace les valeurs sur le logiciel de collecte de données. Le perfusat puis quitte le foie via la canule de l’IVC et se jette dans le bloc d’égalisation de pression (9). Enfin, le perfusat est tiré à partir du bloc de pression dans la pompe à rouleaux et vidé dans le réservoir. Ce modèle comprend une perfusion continue à la veine porte et laisse de côté le flux pulsatile à l’artère hépatique et de la dialyse utilisé dans certains autres modèles, dont chacune nécessite un circuit séparé et supplémentaire, mais ont déjà été démontré pour ne pas être obligatoire,9,13.
Pour explorer l’ajout d’une nouvelle molécule thérapeutique au perfusat, nous avons choisi la catalase enzyme. La catalase est un charognard ROS endogène qui fait partie du mécanisme de défense interne des cellules pour atténuer les effets de ROS18. Expression de la catalase est accrue chez les hépatiques ischémie reperfusion injury19. Une addition expérimentale de la catalase a été démontrée pour diminuer l’ischémie-reperfusion dans l’oeil, du cerveau et du poumon20,21,22,23,24. PEGylation a été démontrée pour cibler la catalase à l’endothélium et aide à l’absorption de la catalase dans les cellules endothéliales25. PEG-CAT a été administré systématiquement avec une efficacité limitée en réduisant l’ischémie-reperfusion hépatique ; Cependant, nous avons émis l’hypothèse qu’ajoutant QUE PEG-CAT à un circuit de perfusion des organes isolés conduirait à améliorer les résultats26,27,28. Ici, nous ajoutons PEG-CAT à notre base perfusat et démontrer sa capacité atténuer les lésions hépatiques de préservation.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices de l’animalier institutionnel et le Conseil National de recherches du Guide pour la Humane Care et l’utilisation des animaux de laboratoire (IACUC) et a fait l’objet d’approbation par le Comité de l’Ohio State University IACUC.
1. installation
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Préparer la solution de perfusion en combinant ce qui suit : 86 mL de 25 % d’albumine, 184 mL de médias de Williams, 30 mL de pénicilline/streptomycine (streptomycine 10 U/mL la pénicilline et à 0,01 mg/mL), de l’insuline (50 U/L), de l’héparine (0,01 U/mL), L-glutamine (0,292 g/L), et hydrocortisone (0,010 g/L) pour un volume total de 300 mL. Pour le perfusat base et groupe PEG-CAT, ajouter 625 U/mL PEG-Cat.
- Tampon la perfusat solution à l’aide de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (THAM) à un pH de 7,4. Utiliser une machine de gaz de sang artériel pour confirmer le perfusat pH.
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Mettre en place le circuit (Figure 1).
- Allumez le bain d’eau plus chaude et réglez-le à 37 ° C. Permettre à la chambre d’orgue pour se réchauffer.
- Versez le perfusat mixte et dans la mémoire tampon dans le réservoir et démarrez la circulation.
NOTE : Le perfusat mentionné dans cette étape a été établi à l’étape 1.1.1. - Allumez le gaz oxygéné (95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone) pour le compteur de débit par l’intermédiaire de l’oxygénateur en ligne.
- Activer le logiciel de collecte de données, puis cliquez sur « start » pour enregistrer pendant la durée de l’expérience.
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Mettre en place le microscope chirurgical et la salle d’opération (Figure 2).
- Allumez tous les équipements dont le jury de réchauffement de la planète, bistouri électrique et l’anesthésie et signes vitaux (cœur taux et oxygène la saturation) matériel de surveillance.
Remarque : Les paramètres de microscope varieront selon le microscope utilisé et peuvent être ajustées pour le confort de l’utilisateur. - Remplir la seringue d’anesthésie de 10 mL à 10 mL de liquide isoflurane pour inhalation (poids moléculaire 184,5 g/mol) et placer dans l’appareil d’anesthésie.
- Positionner une seringue 0,5 mL d’héparine (50 U), les instruments chirurgicaux, 4-0 et 7-0 de soie suture, coton-tiges stériles et 4 x 4 cm non-tissée gaze éponges convenablement (Figure 2).
- Allumez tous les équipements dont le jury de réchauffement de la planète, bistouri électrique et l’anesthésie et signes vitaux (cœur taux et oxygène la saturation) matériel de surveillance.
- Préparer la chambre de l’isoflurane.
2. l’induction de l’anesthésie
- Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) suivant : masque chirurgical, gants chirurgicaux, robe jetable.
- Peser le rat.
Remarque : Nous utilisons des rats Sprague-Dawley entre 250 à 350 g. - Allumez le compresseur d’oxygène et l’isoflurane. Placez le rat, après pesée, dans la chambre de l’isoflurane et fixez le couvercle. Induire l’anesthésie à l’isoflurane 6 % livré avec 2 L/min d’oxygène.
Remarque : La dose exacte isoflurane utilisée dépendra le système d’anesthésie spécifique utilisé. - Utiliser des tondeuses électroniques à pince à cheveux abdominale de l’animal.
- Remplacer l’animal dans la chambre de l’isoflurane.
- Allumez l’unité anesthésie au bloc opératoire.
- Retirer le rat de la chambre de l’isoflurane lorsque l’anesthésie est entièrement induite. Confirmer la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’une pincée d’orteil.
3. procédure de marché
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Préparer le brassard portail 16 G (Figure 3).
- Commencer avec un cathéter de 16 G. Coupez une section de 7 mm de tube. Déterminer le point médian de la section de 7 mm en mesurant 3,5 mm. Incise au milieu et enlever la moitié antérieure du tube.
- Utilisez une pince hémostatique pour écraser cette partie maintenant plate. Utiliser un briquet pour faire fondre l’autre extrémité du cathéter pour créer une lèvre. Ne pas placer la pointe directement dans la flamme ou il s’allumera.
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Préparer la canule de la voie biliaire principale.
- Prenez un angiocath 27 G et couper le port injection, laissant seulement le cathéter. Raccorder à une section de 10 cm du tube cannular 27 G.
- Positionner le rat avec son nez dans la coiffe de l’anesthésie, et ses quatre extrémités immobilisée. Surveiller les signes vitaux en attachant le moniteur à l’extrémité postérieure gauche. Effectuer un pincement de l’orteil pour confirmer la profondeur appropriée de l’anesthésie. Continuer l’anesthésie à l’isoflurane 4 % (pour les animaux qui pèsent > 250 g).
- Vaporiser abdomen de l’animal d’alcool isopropylique à 70 %. Laisser pour sécher. Placez un drap stérile sur l’animal.
- Faire une incision médiane de la xiphoïde sur le pubis, en utilisant des ciseaux et s’étendant à travers la peau (Figure 4). Doucement entrer dans le péritoine et Inciser le muscle. Prenez soin de ne pas endommager la vessie dans l’aspect inférieur de cette incision et le foie dans l’aspect supérieur de cette incision.
- Prolonger l’incision latéralement à gauche et à droite pour former une croix au niveau de la bordure inférieure du foie.
- Tourner l’anesthésie à 2 % (pour les animaux d’un poids > 250 g).
- Rétracter le processus xiphoïde à l’aide d’une pince courbe moustique et les côtes à l’aide de rétracteurs de côtes (Figure 5).
- Couper le falciforme, phrénique et gastrohépatiques ligaments avec des ciseaux pointus.
- Localiser et cravate-off la veine phrénique avec une suture de 7-0 comme à proximité de son origine que possible pour éviter des fuites.
- Éviscérer le rat à l’aide d’un coton-tige humecté stérile et envelopper l’intestin en gaze imbibé de sérum physiologique 0,9 %. Prendre soin de ne pas pour étirer la vascularisation de l’intestin grêle.
- Disséquer sur la veine cave inférieure (VCI) pour enlever l’excès de tissu. Disséquer derrière la VCI juste supérieure à la bifurcation et passez une boucle d’une suture de soie de 4-0 pour l’usage postérieur (Figure 6).
- Rétracter le rein droit pour une exposition à la veine surrénalienne droite. Rétracter le lobe droit du foie mêle avec de la gaze. Attacher la veine surrénalienne droite avec une suture de soie de 7-0 au plus près la VCI que possible et cautériser dessus distale à la cravate (Figure 7).
- Soigneusement disséquer sur la veine splénique, attachez-le à l’aide de deux sutures de soie de 7-0 et recoupent il entre les deux sutures.
- Attacher et ligaturer les veines supplémentaires à l’aide de suture de soie de 7-0 pour la longueur supplémentaire sur la veine porte, si nécessaire.
Remarque : Il y a parfois petites branches de l’infrahepatic IVC entre la veine surrénalienne droite et le foie de qualité inférieur. - Disséquer autour de l’artère gastroduodénale, attacher l’artère gastroduodénale avec une suture de soie de 7-0 et ligaturer l’artère de gastroduodenal.
- Disséquer autour de l’artère hépatique, puis placez une cravate de suture en soie de 7-0 autour d’elle (Figure 8).
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Disséquer sur le canal cholédoque.
- Vérifier la longueur de la voie biliaire principale. Attacher le canal biliaire à l’extrémité distale, à l’aide d’une suture de soie de 7-0. Placer une boucle d’une suture de soie de 7-0 autour de la voie biliaire dans la partie proximale que possible.
- Couper un trou qui est la moitié du diamètre de la gaine avec des petits ciseaux et placer un cathéter de 27 G dans le canal cholédoque proximale. Attacher le cathéter en place à l’aide d’une suture de cravate sandale romaine (Figure 9).
- Injecter 0,5 mL d’héparine (50 U) dans la veine du pénis ou de la VCI de l’animal à l’aide d’une aiguille de 27 G.
Remarque : Une seringue à insuline 27 G peut également être utilisée plutôt. - Pince et attacher la VCI en utilisant le précédemment mis suture de soie de 4-0.
- Attacher l’artère hépatique à l’aide de la précédemment mis suture de soie de 7-0.
- Pince au large de la veine à l’aide d’un clip de microchirurgie. Cathétériser la veine à l’aide d’un cathéter de 22 G. Rincer la veine porte avec 60 mL de sérum physiologique 0,9 % froid avec de l’héparine de 1 mL (100 U) jusqu'à ce que le foie blanches (Figure 10).
Remarque : Si le foie ne pas blanchir immédiatement il peut se faire masser avec des applicateurs de pointe coton stérile. - Exposer le sus-hépatique IVC et recoupent aussi haut dans la poitrine que possible.
- Effectuer une hépatectomie comme suit. Couper autour de la membrane, couper l’artère hépatique, couper la VCI, couper la veine porte, couper les ligaments supplémentaires et sortez le foie. Placer le foie dans la glace froide 0,9 % solution saline normale (Figure 11).
- Placez un manchon vasculaire 16 G dans la veine porte (Figure 12). Placez le foie sur le circuit de perfusion hépatique normothermique ex vivo .
4. Ex Vivo normothermique Perfusion hépatique
NOTE : Le perfusat utilisé ici a été établi à l’étape de protocole 1.1.1.
- Placer la canule de la veine porte dans la collerette de la veine porte (Figure 13).
- Pendant le placement de canule de la veine porte, maintenir le flux du perfusat à travers le circuit à 2 mL/min pour commencer. Regarder le moniteur pour des pointes de pression de la veine porte ; Ceci peut indiquer le navire a devenir obstrué et repositionnement de la canule est nécessaire.
- Suture dans la canule IVC pour le reflux du perfusat utilisant une suture de soie de 7-0.
- Une fois les deux canules sont en place, commencer à monter le débit à 1 mL/min jusqu'à atteindre une pression physiologique de l’ordre de 10 – 16 cmH2O.
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Prendre un échantillon de 1 mL de pré et post-ports à 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 et 240 min de perfusion. Diviser l’échantillon de 1 mL en deux échantillons de 0,5 mL.
NOTE : 0,5 mL cela sera utilisé à l’étape de protocole 4.5.1 et 0,5 mL serviront à l’étape de protocole 4.5.2.- Composant logiciel enfichable geler 0,5 mL de cet exemple dans des tubes cryogéniques dans l’azote liquide.
- Exécuter une analyse de gaz du sang artériel en utilisant l’autre 0,5 mL de perfusat.
- Après l’exécution de l’analyse des gaz sanguins à chaque instant (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 et 240 min) examiner les niveaux de pH et mettre en mémoire tampon le perfusat selon le besoin de retourner à un pH de 7,4.
- À l’issue de 4 h de perfusion, déconnecter le circuit de perfusion du foie. Divisez le foie en segments de 0,5 g. Composant logiciel enfichable geler le tissu hépatique en tubes cryogéniques dans l’azote liquide.
5. expérience après analyse
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Déterminer l’alanine aminotransférase (ALT) niveau dans le perfusat à 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 et 240 min à l’aide d’un kit commercial Dosage colorimétrique.
- En bref, incuber le milieu de perfusion avec les réactifs de mélange de réaction à 37 ° C pendant 60 min. mesure des valeurs de la densité optique à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
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Homogénéiser les 0,5 g de tissu hépatique avec 100 µL de tampon de lyse et d’analyser le tissu lysat d’adénosine triphosphate (ATP), glutathion (GSH) et malondialdéhyde (MDA).
- En bref, mesurer les niveaux d’ATP des échantillons de tissu hépatique à l’aide d’une trousse commerciale. Mélanger l’échantillon avec le tampon de réaction et incuber à température ambiante pendant 30 min. mesurer la densité optique à 570 nm en utilisant un lecteur de microplaques.
- Mesurer les niveaux GSH des échantillons de tissu hépatique à l’aide d’une trousse commerciale. Mélanger les échantillons de tissus avec le cocktail de dosage. Mesurer les valeurs de densité optique à 405-414 nm.
- Mesurer les niveaux de la MDA les échantillons de tissu hépatique à l’aide d’une trousse commerciale. Mélanger les échantillons avec TBA et faire chauffer jusqu'à 95 ° C pendant 60 min. Centrifuger le réactif et transférer le liquide surnageant dans une plaque à 96 puits. Mesurer la densité optique à 532 nm.
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Homogénéiser les 0,5 g de tissu hépatique avec 100 µL de tampon de lyse et d’analyser le tissu lysat pour activité de caspase-3/7 relative à l’aide d’une trousse commerciale.
- Mélanger le lysat de tissu avec le tampon de dosage du réactif de caspase-3-7 et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Mesurer le degré de fluorescence dans chaque bien en utilisant un lecteur de microplaques.
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Déterminer le niveau de cellules apoptotic dans les échantillons de tissu hépatique à l’aide d’un kit de détection commerciale in situ mort.
- Prétraitez les 0,5 g de tissu des sections avec 10 U/mL protéinase K pendant 10 min et puis incuber avec le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 60 min. effectuer l’analyse à l’aide d’un microscope à fluorescence.
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Representative Results
Un échantillon de trois rats par groupe a été utilisé. ALT a été mesuré à 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 et 240 min de perfusion. Nous avons utilisé de Student t-tests pour comparer les résultats entre le perfusat base et base perfusat majoré de groupes PEG-CAT à chaque instant. En comparant le perfusat base et base perfusat ainsi que les groupes PEG-CAT, il est significativement plus faible (p < 0,05) ALT dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT 150, 180, 210 et 240 min (Figure 14 a).
Le tissu hépatique a été obtenu afin d’analyser les lésions tissulaires du perfusat base et base perfusat plus groupes PEG-CAT. Nous avons utilisé de Student t-tests pour comparer les résultats entre le perfusat base et base perfusat majoré de groupes PEG-CAT. Tissu ATP a été maintenu dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement perfusat base (Figure 14 b, p < 0,05). La production de tissus MDA était significativement plus élevée dans le groupe de base perfusat que dans le perfusat base plus PEG-CAT groupe (Figure 14, p < 0,05). GSH total a été maintenu dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement perfusat base (Figure 14, p < 0,05).
Pour analyser l’apoptose, activité de caspase 3/7 de tissu hépatique a été comparée entre les groupes. Fluorescence a été mesurée dans chaque puits. Nous avons utilisé de Student t-tests pour comparer les résultats entre le perfusat base et base perfusat majoré de groupes PEG-CAT. Activité de la caspase 3/7 a été significativement réduite dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement perfusat base (Figure 15 a, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) coloration a été utilisée pour comparer l’apoptose entre les groupes. Le pourcentage de cellules apoptotiques était significativement plus faible dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison du seul groupe base perfusat (Figure 15 b, p < 0,05).
Figure 1 : Circuit de Perfusion. Composants du circuit sont étiquetés. Le perfusat commence dans le réservoir du perfusat (1), qui est un réservoir d’eau chemisé. Perfusat est tiré du réservoir par une pompe à rouleaux (2) et poussé dans une windkessel (3), puis l’oxygénateur (4). L’oxygénateur est définie pour gaz à contre-courant et perfusat flux d’échange gazeux maximale. Le perfusat procède ensuite à une bobine de chauffage (5) à l’intérieur de la chambre de perfusion pour qu'elle soit à température physiologique et un barboteur (6) afin d’éviter la perfusion de bulles d’air. Il y a pré orgue (7) et post-orgue (8) les fenêtres Echantillon, qui permettent le perfusat à échantillonner. Le perfusat entre alors dans le foie via la veine porte de canule. La canule de la veine porte est attachée à un moniteur de pression, qui réglemente l’égaliseur de pression (9). Enfin, le perfusat est tiré à partir du bloc de pression dans la pompe à rouleaux et vidé dans le réservoir. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : installation et instrument chirurgical opératoire. Le microscope chirurgical (1) doit être ajusté à la hauteur appropriée et le grossissement de l’utilisateur. Isoflurane peut être pré-chargés dans la machine d’anesthésie (2). Nez de l’animal est placé dans le cône de nez (3). Instruments chirurgicaux doivent être disposés où ils peuvent être facilement accessibles (4). Il est utile de vu bistouris électriques (5) à proximité. Sutures (6) doivent être pré découpés afin de pièces peuvent être obtenues rapidement lorsque nécessaire et supplémentaire doivent être disponible (7). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : préparer le brassard de la veine porte de 16 G. Commencer avec un cathéter de 16 G. Coupez une section de 7 mm de tube. Déterminer le point médian de la section de 7 mm en mesurant 3,5 mm. Incise ici et enlever la moitié antérieure du tube. Utilisez une pince hémostatique pour écraser cette partie maintenant plate. Utiliser un briquet pour brûler l’autre extrémité du cathéter pour créer une lèvre. Ne pas placer la pointe directement dans la flamme ou il s’allumera. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : incision médiane. Faire une incision de la ligne médiane de la xiphoïde (1) pour le pubis (2) à l’aide de sharp ciseaux et s’étendant à travers la peau et des muscles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : obtenir la rétractation suffisante. Rétracter le processus xiphoïde (1) en utilisant une pince courbe moustique (2) et les côtes en plaçant les rétracteurs de côtes (3, 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : dissection de la veine cave inférieure (VCI). Mettez le foie jusqu'à exposer le rein droit (1) et (2) de la veine porte. Disséquer autour de l’IVC (3) et placer une boucle de suture 7-0 pour une utilisation future. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : la ligature de la veine surrénalienne droite. Rétracter le rein droit (1) pour une exposition à la veine surrénalienne droite. Attacher la veine surrénalienne droite et il se recoupent. Une gaze humide (2) peut être utilisée pour protéger le foie au cours de cette manoeuvre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : dissection de l’artère hépatique. Disséquer autour et mettre un lien autour de l’artère hépatique (1) près d’où elle passe sous la veine porte (2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : canal cholédoque canulation. Cannulate biliaires (1) à l’aide du cathéter de 27 G (2) connecté au tuyau G 27 (3). Cela aidera à recueillir la bile pendant la perfusion. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : flush foie. Rincez le foie (1) avec 60 cc de sérum physiologique 0,9 % froid avec 100 U (1 mL) de l’héparine à l’aide d’un cathéter de 16 G (2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : après l’hépatectomie. Effectuer une hépatectomie et placer le foie dans une solution saline froide. Prendre soin de ne pas pour déloger la canule de la voie biliaire principale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : veine porte menottes. Repérer la veine porte. Une grosse bride (1) permet de contenir jusqu'à la veine laissant une plusieurs millimètre-lèvre de veine au-dessus du collier. Forceps microchirurgicales (2, 3) permet de placer un brassard vasculaire de 16 G (4) dans la veine porte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 13 : veine porte brassard et supérieure canulation IVC. Cathétériser la veine porte Brassard (1) et superior IVC (2). Il faut en grand ne pas à déloger la canule de la voie biliaire principale (3). En outre, prendre soin de ne pas pour tordre la VCI supérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 14 : analyse des lésions tissulaires à base perfusat perfusat seule et base et plus groupes PEG-CAT (N = 3/groupe). Barres d’erreur représentent déviation standard. (A) Alanine aminotransférase (ALT) niveaux. En comparant les taux d’ALAT entre le perfusat base et le perfusat base plus le groupe pégylé-catalase (PEG-CAT), il est beaucoup moins ALT dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT 150, 180, 210 et 240 min (p < 0,05). (B) les niveaux de Triphosphate d’adénosine. Tissu l’adénosine triphosphate (ATP) a été maintenue dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement perfusat base (p <0,05). Niveaux de malondialdéhyde (C). Production de malondialdéhyde (MDA) de tissu était significativement plus élevée dans le groupe de base perfusat que dans le perfusat base plus PEG-CAT groupe (p < 0,05). (D) les niveaux de glutathion. Totale glutathion (GSH) a été maintenue dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement base perfusat (p < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 15 : analyse de l’apoptose dans base perfusat perfusat seule et base et plus groupes PEG-CAT (N = 3/groupe). Barres d’erreur représentent déviation standard. (A) a été diminué significativement l’activité de la Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison avec le groupe seulement base perfusat (p < 0,05). (B) terminale de deoxynucleotidyl transférase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) coloration. Des images ont été prises à l’aide d’un 4 X microscope à fluorescence. Le pourcentage de cellules apoptotiques était significativement plus faible dans le perfusat base plus groupe PEG-CAT en comparaison du perfusat base (p < 0,05). Vert : les cellules apoptotiques. Bleu : nucléaire. Barreaux de l’échelle = 1 000 µm. TUNEL positif des cellules ont été quantifiés par le comptage des cellules de 4 champs microscopiques aléatoires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Il y a une pénurie importante de foie allografts destinés à la transplantation et à la suite critères donneurs ont été élargi1,2,3,4,5. En raison de la pénurie de donneurs, NEVLP a été présenté comme une méthode pour évaluer et modifier les organes fonction6,7. Nous avons conçu un modèle de rat de NEVLP. En outre, nous avons utilisé ce modèle pour démontrer une de ses applications potentielles importantes — les tests d’additifs nouvelle molécule au milieu de perfusion hépatique. Ici, nous avons ajouté PEG-CAT pour le perfusat base et démontré sa capacité à atténuer les lésions hépatiques de préservation.
Étapes critiques
Le circuit de perfusion hépatique a été acheté et utilisé sans modification. Le circuit peut être visualisé à la Figure 1. Le réservoir du perfusat utilisé est un conteneur Carter qui sert à maintenir le perfusat à température physiologique. Du réservoir du perfusat est sorti par un rouleau pompé et poussé dans une chambre windkessel. Cette chambre permet d’humidifier le flux pulsatile du perfusat et rendent plus laminaire pour l’ouverture de l’orgue. Après le windkessel chambre les perfusat des flux à l’oxygénateur. L’oxygénateur est définie pour les flux de gaz et le perfusat contre-courant fournissant l’échange gazeux maximale au perfusat avec 95 % d’oxygène. Le perfusat procède ensuite à une bobine de chauffage pour s’assurer qu’il est toujours à la température physiologique. Un barboteur juste avant l’orgue empêche la perfusion de bulles d’air. Le perfusat est ensuite pompé dans le barboteur et par le biais de la canule de la veine porte vers le foie. La canule de la veine porte est une petite branche hors de lui pour le tensiomètre. La tubulure à la sonde devrait être amorcée avec liquide air pas donc il n’y a aucune perte de pression pour le capteur. Après oxygénant l’orgue, le perfusat s’écoule du foie par le biais de la canule de veine inférieure à un égaliseur de pression. Le bloc d’égalisation de pression permet d’éviter plus de pressurisation de l’organe ou le circuit. Enfin, le perfusat est tiré à partir du bloc de pression dans la pompe à rouleaux et vidé dans le réservoir.
Avant de commencer chaque perfusion inspection visuelle du circuit doit être effectuée afin d’identifier les dommages ou l’accumulation sur les composants du circuit ou de tubes. S’il y a une accumulation de bactéries ou d’autres substances sur le circuit, les pièces devraient être remplacés ou nettoyés, si possible. Ensuite, la solution détergente, maintenir les composants internes doit être rincée. Comme les composants sont être rincés le capteur de pression et le tuyau de refoulement doit être purgé des bulles d’air à l’eau désionisée. Aussi, le débit doit être ajustée à intervalles réguliers pour s’assurer que la pression indiquée est répondre de façon appropriée aux changements. Si le capteur de pression n’est pas répondre de manière appropriée, tous les éléments dans la ligne du capteur doivent être vérifiés et réétalonnés si nécessaire. Au début d’une perfusion, il est crucial de s’assurer que les vaisseaux du foie ne pas devenir pliés ou tordus lors de la connexion du foie au circuit. Si cela s’est produit il y sera un pic de pression immédiate visible sur l’écran, avec une tendance logarithmique. L’erreur la plus fréquente est un pli de la veine porte avec une canule mal positionnée. Ce problème peut être résolu en déplaçant le navire dans une position plus naturelle en tirant légèrement dehors et le redressement de la veine porte. Le moniteur de pression indique la résolution de ce problème avec une baisse de pression et de la cohérence améliorée. Ensuite, lorsque vous raccordez le brassard de la veine porte à la canule de la veine porte le navire peut devenir tordu qui font obstacle de perfusion de l’organe. Ajuster le brassard et corriger cette erreur se traduira par une hausse soudaine pression de la veine porte qui doit alors immédiatement retourner à une pression plus faible et le niveau hors à un écoulement cohérent. Une IVC plié ou tordu peut rapidement être identifié par aucun écoulement de la canule et un renflement du navire. Deux de ces erreurs dans la veine cave seront traduira également par une augmentation de la pression, mais contrairement aux troubles de la veine porte, cette pression s’exerce sur l’orgue et devrait être résolue rapidement. Ce problème devrait être résolu dans les 10 min ou l’expérience doit être annulée. Une indication immédiate pour l’annulation de l’expérience est de voir clair un oedème dans l’organe au cours des 20 premières minutes.
S’il y a une fuite du foie ou de l’une des connexions canule, il sera important de contrôler le niveau du réservoir perfusat. Court de perfusat et pompage de l’air peuvent être catastrophiques pour l’expérience. Dès que l’air est pompé dans les lignes, il n’est pas possible d’interrompre l’expérience et amorcer de nouveau les lignes de tuyauterie. La seule correction concerne le barboteur capturer l’air injecté.
Modifications et dépannage
Une fois que le circuit est vidé l’oxygénateur puisse être mis en ligne et ensuite le circuit peut être amorcé avec perfusat. Bien purger l’air de l’oxygénateur peut prendre quelques minutes mais est une étape cruciale en veillant à qu'une embolie gazeuse n’est pas produite au milieu d’une perfusion. Après que l’oxygénateur est amorcé complètement avec le perfusat de que le barboteur doit être rempli à côté capturer les bulles d’air qui forment. À ce stade le débit du circuit doit être réglé à un débit de 1 ou 2 mL/min pour garder le perfusat déplaçant jusqu'à ce que le foie est prêt pour la canulation.
Après canulant la veine porte et la VCI du foie, la pression devrait augmenter et ensuite se stabiliser. Comme le flux est porté à une pression normale physiologique la pression enregistrée devrait commencer à augmenter selon des étapes similaires. Une fois le débit souhaité (8-16 mm Hg) a atteint la pression doit rester relativement constante. Nous visons pour une pression de 10 mmHg et régler le débit en conséquence. Le débit nécessaire pour atteindre une pression de 10 mmHg peut varier selon l’organe. Il peut y avoir une légère fuite du perfusat de l’orgue, mais ce milieu de perfusion peut être virés et retourné au réservoir.
Le circuit doit être nettoyé après chaque perfusion de maintenir la chambre et le réservoir et de préserver les tubes jetables et les ports. Tous les perfusat doit être retiré du circuit. Le circuit doit être immédiatement rincé avec un minimum de 300 mL d’eau désionisée. Alors que l’eau désionisée rince la tubulure du circuit les parties externes doivent être nettoyés correctement. Composants externes doivent être rincés ou essuyés doucement vers le bas et sécher à l’air libre. Composants du circuit sont fragiles et peuvent être endommagés facilement. Il est donc primordial de nettoyer doucement. Le circuit interne doit être conservé dans une solution de 5 % de détergent alcalin dans l’eau désionisée quand pas en service. Le détergent dans le circuit permet de prolonger la vie de la tubulure et empêcher l’accumulation sur les autres composantes, telles que le barboteur et égalisateur de pression.
La plupart des difficultés avec le circuit peuvent être évitées avec nettoyage et entretien du circuit après chaque utilisation. Cela permet d’assurer il n’y a aucune accumulation de perfusat résiduelle qui peut conduire à un tube bouché ou canules. Tubes et composants du circuit doivent être inspectées régulièrement et remplacés si nécessaire avant chaque utilisation pour s’assurer qu'il n’y a aucune contamination ou la restriction du débit.
Limites
Une limitation de ce petit modèle animal de NEVLP est qu’il ne comprend pas actuellement perfusion après transplantation. Il est donc impossible d’évaluer la fonction du greffon hépatique après la transplantation. Il s’agit d’une zone importante pour les recherches futures. De plus, utilisant le circuit petit animal exige tant de connaissances et de compétences.
Signification en ce qui concerne les modèles existants
Porcins et murins modèles (rat) de la perfusion hypothermique, subnormothermic et normothermique ex vivo hépatiques ont été décrits dans la littérature. Bien que la controverse persiste au sujet de la température de la perfusion, il a été démontré que cette perfusion machine peut améliorer la fonction des greffes du foie quelle que soit la température9. Le modèle NEVLP présenté ici est simple, facile à reproduire, à faible coût et a une large gamme d’applications. Ce modèle n’inclut pas de dialyse ou flux pulsatile de l’artère hépatique, qui sont inclus dans certains autres modèles, comme elles ont été montrées pour être inutile9,13. En outre, les résultats des premiers essais humains à l’aide de NEVLP ont montré, c’est une méthode efficace de conservation du foie — par conséquent, ce modèle est idéal pour tester les applications futures des ex vivo de perfusion hépatique10.
Applications futures
Une variété d’applications futures pour NEVLP ont été proposées dans la littérature. Chacun d'entre eux devra être testé méthodiquement dans des modèles animaux avant les essais des organes humains mis au rebut, puis dans le foie humain. Le modèle présenté ici est idéal pour tester ces nouvelles applications futures, comme il est facile à reproduire, élimine les étapes superflues et est à faible coût. Une des plus importantes applications potentielles de ce modèle est celui démontré ici - les essais du perfusat pharmacologiques nouveaux additifs. Autres applications proposées incluent la réparation des organes endommagés, dégraissage des foies pour permettre la transplantation d’organes stéatosique, introduction de résistance virale de l’hépatite C, la thérapie de cellules souches mésenchymateuses, modification génique et perfusion avec immunosuppresseur agents11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Conclusions
En conclusion, nous avons démontré un modèle NEVLP peu coûteux, facile à reproduire à l’aide de rats. Utilisation de ce modèle nécessite une préparation minutieuse, pratique et la connaissance, mais peut être mises en œuvre à faible coût. Les applications de ce modèle peuvent inclure essais perfusat nouveaux additifs, comme l’ont démontré des résultats représentatifs. Des applications supplémentaires de ce modèle peuvent inclure des test logiciel conçu pour l’évaluation de l’orgue, perfusats différentes et les transporteurs d’oxygène artificiel ou axée sur le taux d’hémoglobine et agents conçus pour réparer les organes.
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Disclosures
Tous les auteurs rapportent qu’ils n’ont aucune divulgation pertinente.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les NIH T32AI 106704-01 a 1 et le Fonds de Flesch T. pour la Transplantation d’organes, de Perfusion, de génie et de régénération à la Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
