Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/57566
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institut für Molekulare Zellbiologie

Summary

هنا يمكننا وصف أساليب استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إلى أحداث متجولة واحد الصورة بالماوس الضامة البريتوني المقيم. ويمكن تمديد البروتوكولات إلى خلايا أخرى متجولة.

Abstract

البلعمه يلعب دوراً رئيسيا في الدفاع المضيف، وكذلك في تطوير الأنسجة وصيانتها، وينطوي على ترتيبات جديدة سريعة، بوساطة مستقبلات من cytoskeleton أكتين لالتقاط وتغليف وابتلاع الجزيئات الكبيرة. على الرغم من أن مستقبلات متجولة ومسارات الإشارات المصب، والمستجيبة، مثل "جتباسيس رو"، وقد حددت، يعيد البناء cytoskeletal دينامية معينة بوساطة مستقبلات الأحداث متجولة لا تزال غير واضحة. قبل أربعة عقود، آليتين متميزة البلعمه، يتجلى في مستقبلات Fcγ (FcγR)-وتكملة مستقبلات (الجمهورية التشيكية)-وساطة البلعمه، وتم تحديد استخدام المجهر الإلكتروني المسح. ربط غلوبيولين مناعي G (IgG)-يطلق جسيمات أوبسونيزيد إلى FcγRs نتوء ملحقات غشاء رقيق، التي تشكل ما يسمى كوب متجولة حول الجسيمات في البداية قبل أن يصبح محاطة تماما وتراجع في الخلية. على النقيض من ذلك، تظهر جزيئات تكملة أوبسونيزيد أن يغرق في بلعمية أثر ملزم لتكملة المستقبلات. هذين الوضعين البلعمه وتشكيل كأس متجولة وغرق في، أصبحت راسخة في الأدب. ومع ذلك، أصبحت غير واضحة الفروق بين الوضعين بالتقارير أن البلعمه بوساطة مستقبلات تكملة قد حمل مختلف غشاء نتوءات. مع توافر عالية الدقة تقنيات التصوير، فحوصات البلعمه المطلوبة التي تسمح في الوقت الحقيقي التصور 3D (ثلاثة الأبعاد) كيفية معينة من مستقبلات متجولة التوسط امتصاص الجزيئات الفردية. أكثر استخداماً نهج لدراسة البلعمه، مثل فحوصات نقطة النهاية، تفوت الفرصة لفهم ما يحدث في الواجهة من الجسيمات والبالعات. هنا يصف لنا فحوصات متجولة، استخدام الغزل الوقت الفاصل بين القرص المجهري [كنفوكل]، أن السماح بتصوير ثلاثي الأبعاد لإحداث متجولة واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا معبراً صورة مستقبلات Fcγ-دون لبس أو تكمل بوساطة مستقبلات البلعمه.

Introduction

عشرين عاماً قبل المراقبة ميتشنيكوف لخلايا mesenchyme متجولة في يرقات نجم البحر، في عام 1882، والتطور اللاحق لنظريته من البلعمه1، وصف إرنست هيجل، في عام 1862، الإحاطة جزيئات الصبغة غير قابلة للذوبان بالدم خلايا فيمبريس ثيتيس (فيمبريا تيثيس)، أنواع المفترسة سبيكة البحر (إرنست هيجل. يموت راديولارين (رهيزوبودا رادياريا): Eine Monographie؛ دراك und رايمر غيورغ فون فيرلاغ، برلين، 1862). ووصف صراحة نتوءات غشاء تخيم الجسيمات، التي كانت في وقت لاحق تناول في السيتوبلازم والمتراكمة حول نواة الخلية. أكثر من 100 عاماً في وقت لاحق، اقترح دراسة رائدة كابلان أن هناك آليات متميزة شكلياً على الأقل اثنين من البلعمه2. وأظهرت كابلان عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني أن الماوس البريتوني الضامة بلعها الأغنام أوبسونيزيد مفتش خلايا دم الحمراء باستخدام ملحقات غشاء رقيق التي وصلت إلى أعلى ويلفها الجسيمات شكل محكم، في البداية مما أدى إلى كأس-مثل الهيكل. المطلوب تشكيل كأس متجولة بلمرة الأكتين نظراً لأنه ألغى من سيتوتشالاسين فطري نفاذية الخلية ب، تعرف إلى كتلة حيوية أكتين3. وفي المقابل، يبدو خلايا الدم الحمراء الأغنام أوبسونيزيد مع تكملة تغرق مباشرة في بلعم دون توليد ملحقات الغشاء، على الرغم من ذلك، في بعض الصور، يمكن رؤية غشاء الكشكشة في بسنتي الفوري للجسيمات غرق. على عكس تشكيل كأس متجولة، كان مكملاً بوساطة مستقبلات غرق إينسينستيفي ل علاج سيتوتشالاسين ب2. في التجارب التي وصفتها كابلان، وكان يؤديها opsonization تكملة تفرخ غلوبيولين مناعي M (IgM) المسمى الأغنام خلايا الدم الحمراء مع المصل من تكملة تفتقر إلى C5 الفئران، التي تلتف انحلال الدم بتكملة C5-تعتمد على المحطة الطرفية وتكمل المعقدة.

أصبحت وضعي البلعمه وتشكيل كأس متجولة وغرق في، حدد كابلان الرأي المتبعة في الميدان4،5،6،،من78،9 . ومع ذلك، تستخدم الصور فائقة القرار في الدراسة الأصلية حسب كابلان2، فضلا عن دراسة مماثلة بكأس مونتي et al. 10، سوى تقديم لقطات أحداث متجولة. في استعراض أجرى مؤخرا، روجر et al. 11 شدد على أن تظل الاختلافات المورفولوجية بين البلعمه FcγR والجمهورية التشيكية-بوساطة إلى توضيح، وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ الكشكشة الغشاء أثناء تكملة الجسيمات بوساطة مستقبلات الامتصاص2. تعديل نماذج الماوس تصوير خلية يعيش الأحداث متجولة واحدة تمتد من التقاط الجسيمات لاستيعاب، جنبا إلى جنب مع وراثيا، يمكن أن تحسن كثيرا من فهمنا لكيفية التقاط البالعات واستيعاب الجسيمات. يمكن أن يكون أحد النهج استخدام مجهر القوة الذرية سريعة (AFM) الذي يتيح تصوير فائقة القرار (10 – 20 nm) الطوبوغرافية للخلايا الحية. مؤخرا، تم وضع نظام فؤاد سريع12 ، وهي مناسبة لتصوير السطوح الخلية سريعاً مع انخفاض مستوى الضجيج. هذا الأسلوب له الميزة أن المعلمات ذات الدقة العالية والطوبوغرافية والميكانيكية الحية الخلايا يمكن أن يقاس على فترات قصيرة (بالثواني)، خلافا للمسح الضوئي المجهر الإلكتروني، مما يتطلب التثبيت وتجفيف نقطة حرجة الخلايا. نهج آخر هو الوقت الفاصل بين 3D [كنفوكل] الفحص المجهري، ومتاحة على نطاق واسع، على الرغم من أن الضيائية وتبيض الحد من العوامل أثناء التسجيلات. هذا النهج متعدد الاستخدامات بدرجة ويسمح تمزيقها مع عالية الدقة المكانية البصرية ويتيح مرونة غير عادية في وضع العلامات مع مجموعة مذهلة من المسابر الفلورسنت، بما في ذلك البروتينات الفلورية وراثيا المرمزة. هنا يصف لنا فحوصات البلعمه باستخدام الغزل الوقت الفاصل بين القرص المجهري [كنفوكل] تسمح عالية الدقة الزمانية المكانية محددة بوساطة مستقبلات الأحداث متجولة.

Protocol

البروتوكولات اتبع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية المحلية، وكذلك المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية.

1-عزل الضامة البريتوني الماوس المقيم

  1. التضحية بالماوس (3-4 أشهر عمر (أي الجنس)؛ مثل سلالة C57BL/6) باستخدام جرعة زائدة من إيسوفلوراني مخدر المتقلبة (> 5 ٪ في الهواء) أو ثاني أكسيد الكربون13، يليه سرطان عنق الرحم التفكك. ويمكن تقييم تحريض التخدير سهولة فقدان الاستقامة منعكس14، فضلا عن فقدان منعكس سحب مخلب.
  2. بعد تنظيف بطن الماوس مع الإيثانول 80% في المياه، جعل شق جلد خط الوسط وفضح جدار البطن الأساسية.
  3. وضع قسطرة بلاستيكية 24-ز في بيريتونيوم والغسل التجويف مع الحل هانك المثلج لمل 2 × 4.5 الملح مخزنة (حبس)، دون Ca2 + و Mg2 +عن طريق حقنه بلاستيكية 5 مل. بينما الحقن، ترك حوالي 0.5 مل المتبقية حبس (5 – 4.5 مل (حقن) = 0.5 مل) في المحاقن في حالة الأنسجة هو الانزلاق إلى طرف القسطرة ويحتاج إلى طردهم. نقل تعليق يستنشق إلى 14 مل البوليبروبيلين الجولة-أسفل الأنبوبة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز ل 6.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: طرف القسطرة البلاستيك بلانت، الذي، بالمقارنة مع إبرة، يقلل الإصابة لمحتويات البطن. عادة ما يلي لطيف تدليك البطن، يمكن استرداد تعليق خلية البريتوني 8 مل من التجويف الصفاقى.
  4. تجاهل المادة طافية والخلايا البريتوني في 1 مل خالية من بيكربونات RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 20 مم حبيس وإبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري والمضادات الحيوية، مثل البنسلين (100 وحدة/مل) وستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، التي أعدها ريسوسبيند تمييع 100 x البنسلين/ستربتوميسين 1: 100. وهذا يعطي عادة بتركيز حوالي 6 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: هي حوالي 30% خلايا البريتوني المعزول الضامة، بينما الخلايا الأخرى (أصغر) هي الخلايا الليمفاوية، غالباً ب الخلايا.

2-زرع خلايا البريتوني في قناة الشرائح

  1. بعد بيبيتينج تعليق خلية صعودا وهبوطاً للحد من التثاقل، "الماصة؛" 100 ميليلتر تعليق في القناة المعبأة (وحدة التخزين، 100 ميليلتر) من الشريحة المغلفة فيبرونيكتين القناة (قناة 100 ميليلتر بالأبعاد (الطول × العرض × الارتفاع): 50 مم × 5 مم 0.4 مم).
    1. بريفيل الدائرة بإضافة 1 مل تستكمل المصل المتوسط 1640 RPMI (حبيس) إلى واحد من الخزانات اثنين من الشريحة القناة وآماله الشريحة ثم يسفط المتوسطة من الخزان المصب (الشكل 1).
      1. إزالة غير المرغوب فيه فقاعات الهواء، أو شرائط طويلة من الجو، في القناة بإضافة متوسطة 1 – 2 مل لأحد الخزانات اثنين، أحكام تطبيق غطاء خزان ثم شفط الهواء من خلال ضغط الإبهام الإيقاعي في عملية النداء الموحد و، حيثما كان ذلك ضروريا، إمالة الشريحة. بعد طرد الهواء، إمالة الشريحة مع الخزان لم يسبق لهم اللعب (والتي تتضمن المتوسطة) الهبوط قبل إزالة الغطاء لتجنب الهواء يجري الانزلاق مرة أخرى إلى القناة.
  2. احتضان الشريحة القناة، المصنف مع الخلايا، في دائرة ح 2 في 37 درجة مئوية في غياب CO2 رطبة (غير مطلوب CO2 منذ HCO3-هو الاستعاضة عن نظام المخزن المؤقت2 /CO هيبيس). يمكن وضع الشرائح قناة مريح على رف، الذي يحمل ثماني شرائح. عادة، على استعداد الشرائح 6 – 8 من الماوس واحدة، على الرغم من أن يصل إلى 10 أو أكثر من الممكن.
  3. قم بإزالة الحامل وتبادل المتوسط 1640 RPMI (حبيس) في كل شريحة بيكربونات تحتوي على المتوسط RPMI 1640، تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، فضلا عن البنسلين/ستربتوميسين.
    1. إمالة الشريحة ونضح المتوسطة الأولى من الخزان السفلي ثم من الخزان العلوي. بعد ذلك، إضافة 1 مل من هذه الوسيلة الجديدة لواحدة من الخزانات، إمالة متوسطة الشريحة و aspirate من الخزان المصب، بعد أن قد تدفقت من خلال القناة.
    2. بعد هذه الخطوة يغسل (تبادل متوسطة)، تعبئة الشريحة القناة بإضافة 1 مل المتوسطة إلى واحدة من الخزانات.
      ملاحظة: الغسيل الخطوات باستخدام الشرائح القناة بسيطة جداً وفعالة من حيث تبادل الحلول وإزالة الخلايا غير ملتصقة. لاحظ أن المتوسط 1640 RPMI (بيكربونات) عادة قبل المحتضنة مع 5% CO2 بين عشية وضحاها لضمان التوازن الحراري ودرجة الحموضة.
  4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد مع شركة 5%2. القيام بتجارب في اليوم التالي.

3-عزل خلايا الدم الحمراء البشرية

  1. في يوم 2 (اليوم الثاني للتجارب؛ وبعد الحضانة بين عشية وضحاها من الضامة البريتوني المعزول)، جمع الدم الوريدي المحيطي 1 – 2 مل من مانح صحية، في أنبوب هيبارينيزيد. نقل 1 مل في قاع جولة مل 2.0 (بولي بروبلين) ميكروسينتريفوجي أنبوب، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق عند 18 درجة مئوية (الإعداد التجريبية)، وإزالة المادة طافية (البلازما ومعطف بافي).
  2. بلطف نضح 100 ميليلتر من رسابة خلايا الدم الحمراء وخلط هذا المجلد 1:1 مع المعدل المتوسط 1640 RPMI (هيبيس) (الموصوفة أدناه) في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 قاع جولة. قم بتسمية الأنبوب "1:1".
    ملاحظة: يتضمن المتوسط 1640 RPMI (حبيس) المستخدمة في اليوم 2 (لفحوصات) بعد عزل الخلايا، بالإضافة إلى إبطال الحرارة 10% الجنين المصل البقري البنسلين (100 وحدة/مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) و 1 مم ن-(2-ميركابتوبروبيونيل) جليكاين (للحد الضيائية). ، هذه الوسيلة هو يشار إلى المتوسط 1640 RPMI (حبيس) "المعدلة".
  3. "الماصة؛" 4 ميليلتر من تعليق خلية الدم الحمراء المخفف 1:1 إلى 2 مل تعديل المتوسط 1640 RPMI (حبيس)، بيبيتيد مسبقاً في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 (كرر هذه الخطوة، أي إعداد أنابيب 2). قم بتسمية كل أنبوبة "4:2000". وضع أنابيب "1:1" و "4:2000" على الجليد.

4-وضع العلامات من غشاء البلازما بلعم

  1. إزالة الشرائح قناة المبذورة من حاضنة2 CO وتبادل المتوسط 1640 RPMI (بيكربونات) في كل شريحة للمعدل المتوسط 1640 RPMI (حبيس). بعد ذلك، وضع الخلايا في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية في غياب CO2.
    ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والغسيل، تتم إزالة معظم الخلايا الليمفاوية من القناة. معظم الخلايا ملتصقة المتبقية هي الضامة، التي يمكن تحديدها شكلياً أو تلطيخ الفلورة استخدام الأجسام المضادة-F4/80. حوالي 95 في المائة من المقيمين الضامة البريتوني الماوس هي F4/80 إيجابية.
  2. تمييع فلوريسسينتلي الأخضر المسمى الماوس المضادة F4/80 جسم (المخزنة في 4 درجات مئوية) 01:40 في المتوسط 1640 RPMI (حبيس) المعدلة. تأخذ شريحة وآماله، أنها "الماصة؛" (قطره قطره) 100 ميليلتر من خليط جسم في افتتاح القناة 100 ميليلتر من الشريحة (انظر الشكل 1). نضح المتوسطة التي تصب في الخزان المتلقين للمعلومات. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (هوميديفيد البيئة، دون CO2). وخلال فترة الحضانة، تسمية خلايا الدم الحمراء البشرية (انظر القسم 5).
    ملاحظة: كما أشير أعلاه، CO2 غير مطلوب منذ HCO3-هو الاستعاضة عن نظام المخزن المؤقت2 /CO حبيس.
  3. بعد 20 دقيقة حضانة الوقت (خلالها خلايا الدم الحمراء البشرية الملون وأوبسونيزيد)، أغسل الشريحة بإضافة 1 مل تعديل المتوسط 1640 RPMI (حبيس) إلى واحد من الخزانات ويسفط في المتوسط بعد أن قد تدفقت من خلال القناة، ييسرها إمالة الشريحة. أضف 1 مل المتوسطة للتخزين القصير الأجل أو الشروع في تجربة (أي، بيبيتينج في جزيئات (خلايا الدم الحمراء أوبسونيزيد) والتصوير البلعمه بالغزل الوقت الفاصل بين القرص المجهري [كنفوكل]).

5-وضع العلامات غشاء البلازما خلايا الدم الحمراء البشرية

  1. تبدأ العلامات من خلايا الدم الحمراء البشرية فورا بعد حضانة شريحة الضامة مع الأخضر فلوريسسينتلي المسمى الأجسام المضادة-F4/80 (بعد القسم 4.2). وبعد خلط لطيف، تأخذ 400 ميليلتر من واحدة من هذه الأنابيب "4:2000" (انظر الفرع 3-3) والاستغناء عن ذلك في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 (جولة أسفل). إتاحة الوقت لتعليق الحارة إلى حوالي 37 درجة مئوية (انظر الفقرة أدناه). إضافة ميليلتر 0.4 البرتقالي/الأحمر نيون غشاء البلازما وصمة عار (مختبرين المخزنة في-20 درجة مئوية) وخلط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: كتلة ألومنيوم ساخنة، ووضعها داخل غطاء الاندفاق الصفحي، مفيد للتقليل من فقدان الحرارة أثناء إعداد الشرائح. يمكن وضع أنابيب إلى الآبار تحمل كتلة التدفئة ومنفصلة، أو لوحة الألمنيوم المتكاملة، ساخنة بمثابة مساحة لعمل.
  2. بعد فترة حضانة المرض 5 دقيقة، تعد الخطوة الأولى في المياه والصرف الصحي بإضافة 1600 ميليلتر تعديل 1640 RPMI (حبيس) متوسطة (لملء الأنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0).
  3. الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ز لمدة 5 دقائق عند 18 درجة مئوية (الإعداد التجريبية). بيليه أحمر اتفاق يجب أن تكون مرئية على الحائط (أي خارج المركز) في الجزء السفلي من الأنبوب. تدوير الأنبوب حيث أنه يواجه بيليه صعودا وإزالة بعناية كل من المادة طافية تباعا (في خطوتين) استخدام تلميح ماصة 1 – 1.5 مل.
  4. بعد يسفط المادة طافية، إضافة 2,000 ميليلتر تعديل 1640 RPMI (حبيس) مزيج المتوسطة، (ريسوسبيند الخلايا)، وكرر الخطوات المذكورة أعلاه تطلع الطرد المركزي والمادة طافية.
  5. ريسوسبيند بيليه (غشاء البلازما الملون وغسلها 2 x خلايا الدم الحمراء) مع 400 ميليلتر من المعدل المتوسط 1640 RPMI (هيبيس). قم بتسمية الأنبوب PMS (اختصار لغشاء البلازما وصمة عار).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، إستر سوكسينيميديل من مشتق والرودامين حساسة لدرجة الحموضة، الذي يصبح أكثر شدة الفلورسنت في الأس الهيدروجيني الحمضية، يمكن أن تستخدم لتسمية خلايا الدم الحمراء البشرية. في هذه الحالة، بالإضافة إلى ذلك شدة الأسفار يخدم كمقياس نضج يبلوع بعد قد تم استيعابه الجسيمات.

6-أوبسونيزاتيون (الوسم) للإنسان خلايا الدم الحمراء مع الماوس غلوبيولين مناعي G (مفتش)

  1. أضف 1 ميليلتر الماوس (IgG2b) [مونوكلونل] (استنساخ HIR2) المضادة الإنسان CD235a الملون (1 ملغ/مل) الأجسام المضادة (المخزنة في-20 درجة مئوية) إلى الأنبوبة المسماة PMS (انظر الأقسام 5.2 – 5.5)، التي تحتوي على غشاء البلازما خلايا الدم الحمراء البشرية قد علقت في 400 ميليلتر المتوسطة. CD235a (المعروف أيضا جليكوفورين A) سيالوجليكوبروتين الأغشية الخاصة بالنسب محمر.
  2. احتضان في 37 درجة مئوية للدقيقة 8 علما أن أوبسونيزيشن من خلايا الدم الحمراء البشرية مع تراص الأسباب مفتش (خلية التثاقل). على الرغم من تراص يمكن أن تكون بمثابة مؤشر مرئي من opsonization، أنها غير مرغوب فيها لتصوير آثار متجولة واحد. للالتفاف على تراص، مرارا وتكرارا مزيج تعليق خلية (كل 1 دقيقة) باستخدام، على سبيل المثال، متغير 20 – 200 ميليلتر ماصة حجم تعيين إلى 200 ميليلتر.
    1. نهاية فترة الحضانة 8 دقيقة، إذا كان المطلوب، أغسل الشريحة بلعم، المحتضنة مع الأخضر فلوريسسينتلي المسمى الأجسام المضادة-F4/80، مع 1 مل تعديل المتوسط 1640 RPMI (حبيس). التأكد من وجود الخزانات كلا من الشريحة قناة الحرة من المتوسطة بعد خطوات الغسيل.

7-التصوير البلعمه غشاء البلازما الملون ومفتش المغلفة بالبشرية من خلايا الدم الحمراء

  1. وبعد تفريخ 8 دقيقة مع الأضداد المضادة-CD235a (القسم 6.2)، "الماصة؛" 100 ميليلتر تعليق يتضمن الملطخة بغشاء البلازما ومفتش أوبسونيزيد البشرية خلايا الدم الحمراء في القناة من الشريحة التي تحتوي على الضامة المسمى مع مكافحة الفلورية الخضراء-F4/ جسم 80 (الخطوة 4). وبالتالي، تتم إضافة الأحمر نيون، مفتش أوبسونيزيد البشرية خلايا الدم الحمراء إلى البالعات الفلورية الخضراء (الضامة).
  2. حالما تم إضافة خلايا الدم الحمراء البشرية، جبل الشريحة القناة على قرص غزل مجهر [كنفوكل] (مع الحاضنة مرحلة تعيين إلى 37 درجة مئوية) للتصوير، على سبيل المثال، عن طريق 60 X/1.49 عدسة الهدف النفط-الغمر. بدء التصوير في أقرب وقت، حيث تبدأ جسيمات تسوية داخل 1 دقيقة.
    ملاحظة: باستخدام الخرز الفلورسنت التي يبلغ قطرها 100 نانومتر، قمنا بقياس، ومن تحليل لنقطة نشر وظائفها، القرارات س وص ل x = 0.22 ميكرومتر، y = 0.23 ميكرومتر (488 نانومتر الليزر) و x = 0.27 ميكرومتر، y = 0.27 ميكرومتر (561 نانومتر الليزر). ومع ذلك، للحد من فوتوبليتشينج ولالضيائيه خلال الوقت الفاصل بين التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا الحية، نتنازل القرار المكانية باستخدام binning 2 × 2. Binning يزيد من حساسية (يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء) ومعدل الإطار المسموح به، ولكن على حساب القرار المكانية.
  3. استخدام تركيز الكمال (أو ما شابه ذلك) نظام لمنع الانجراف التركيز خلال التسجيلات. بعد تفعيل نظام التركيز الكمال، استخدام عنصر تحكم الإزاحة إلى التركيز على نتوءات لاميليبوديال بلعم فورا أعلاه ساترة (راجع الملاحظة أدناه) من الشريحة القناة. مستوى تركيز هذا يناظر Z = 0 ميكرومتر. الحصول على Z-أكوام من-1 ميكرومتر إلى + 16 ميكرومتر في 0.8 ميكرومتر الخطوات، التي تبلغ 22 Z-شرائح. Z-مداخن يمكن، على سبيل المثال، الحصول على المكدس 1 (لكل قناة) بمعدل كل 15 ثانية لما مجموعة 16 دقيقة.
    ملاحظة: تسجيل فترات أطول تعاني من خسائر لجودة الصورة، ويرجع ذلك أساسا إلى فوتوبليتشينج. Z-مكدسات يتم الحصول عليها لكل من القناتين: الضامة يتم تصويرها باستخدام ليزر 488 نانومتر (قناة الأخضر) وخلايا الدم الحمراء البشرية يتم تصويرها باستخدام ليزر نانومتر 561 (القناة الحمراء). باستخدام هذا النهج، يمكن الحصول وجهات النظر المختلفة من الضامة تناول مفتش أوبسونيزيد خلايا الدم الحمراء البشرية في تيميبوينتس مختلفة (على سبيل المثال، انظر الشكل 2).
    ملاحظة: الإعدادات النموذجية للنظام (مع binning 2 × 2): قناة الأخضر (الليزر 20.5 في المائة (50 ميغاواط؛ 488 نانومتر) السلطة، حساسية 101 (النطاق، 0-255) ووقت التعرض 200 ms)؛ القناة الحمراء (الليزر 10.5% (50 ميغاواط؛ 561 nm) السلطة، حساسية 101 (النطاق، 0-255) ووقت التعرض 98 ms).
    ملاحظة: الجزء السفلي من الشريحة القناة بوليمر مع نفس سمك ساترة زجاج #1.5 ونفس الخصائص الضوئية للزجاج، ولكن جدير بالذكر أن المواد التي تتمتع بميزة نفاذية الغازات.

8-التصوير البلعمه من غشاء البلازما الملون والمغلفة بتكملة خلايا الدم الحمراء البشرية

  1. غشاء البلازما أوبسونيزي تكملة الملون ومفتش أوبسونيزيد البشرية خلايا الدم الحمراء وبالمثل إلى البندان 5 و 6، فيما عدا، بدلاً من بيبيتينج ميليلتر 4 تعليق خلية الدم الحمراء المخفف 1:1 في المتوسط 1640 RPMI (حبيس) 2 مل تعديل، كما هو موضح في القسم 3-3، "الماصة؛" 4 ميليلتر في المتوسط 1640 RPMI (حبيس) 1 مل معدلة، وتبعاً لذلك تسمية الأنبوب 4:1، 000. وهكذا، هي خلايا الدم الحمراء البشرية أكثر 2 x مركزة.
  2. المضي قدما في الخطوات المذكورة في الأقسام 4 و 5، ولكن البدء مع 4:1,000 بدلاً من الأسهم 4:2,000 المخفف من خلايا الدم الحمراء البشرية (4:1، 000 و 4:2,000 تشير إلى تخفيف اللاحقة البداية 1:1 المخفف البشرية خلايا الدم الحمراء الموضحة في المقاطع 3.1 و 3.2).
  3. التضحية C5 ماوس فارغة (مثلاً B10. دال-2-المفوض السامي0 H2 H2د -/oSnJT18ج؛ مختبر جاكسون) باستنشاق إيسوفلوراني (> 5 ٪ في الهواء) متبوعاً بقطع الرأس، وجمع الدم. ونحن عادة بالتنقيط حوالي 0.8 مل دم إلى قاع جولة 14 مل أنبوب بلاستيكي مباشرة بعد استنشاق isoflurane وقطع الرأس.
  4. بعد ح 1، عند الكامل هو متخثر الدم، نقل السوائل المتبقية في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 وأجهزة الطرد المركزي في 300 x غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي وقت لاحق، بعناية جمع المصل مصفر. بشكل عام، نحن استرداد ميليلتر 200 على الأقل C5 المصل فارغة. وضع المصل C5 فارغة على الجليد.
  5. بعد الملون الحضانة 4 دقيقة لغشاء البلازما خلايا الدم الحمراء البشرية مع مفتش، إضافة آخر ميليلتر 1 من الأجسام المضادة CD235a المضادة (إعطاء 2 × مركزة)، ثم تأخذ 50 ميليلتر من تعليق خلية ومزجها في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0 منفصلة تحتوي على 50 ميليلتر C5 فارغة (null) مصل الدم. مواصلة لخلط (كل 1 دقيقة) مرارا وتكرارا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، كما هو الحال في القسم 6-2، لآخر 4 دقيقة. وهكذا، بعد هذه الخطوة، تم المحتضنة خلايا الدم الحمراء البشرية مع الأجسام المضادة CD235a المضادة لما مجموعة 8 دقيقة.
    ملاحظة: فترة الحضانة 4 دقيقة مع المصل C5 فارغة غير كافية لتنشيط تتالي تكملة الكلاسيكية وأوبسونيزي خلايا الدم الحمراء البشرية مع C3b، الذي هو المشقوق عامل أنا إلى iC3b.

9-إقرار من مفتش-و C3b-أوبسونيزيشن البشرية من خلايا الدم الحمراء

  1. تأكيد opsonization البشرية خلايا الدم الحمراء مع الماوس CD235a المضادة IgG (IgG2b) (انظر القسم 6.1) الأجسام المضادة التي تفرخ الخلايا مع الماعز الماوس المضادة (الثانوي) مفتش جسم مترافق fluorophore فلورية الخضراء أو الحمراء.
    1. إضافة 1 ميليلتر الماوس CD235a مكافحة الأجسام المضادة مفتش و 1 ميليلتر المسمى فلوريسسينتلي المضادة الماوس الثانوي جسم إلى تعليق 400 ميليلتر للبشرية من خلايا الدم الحمراء، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. وفي وقت لاحق، يغسل مرتين (كما هو الحال في الأقسام 5.2 – 5.5).
    2. تعديل ريسوسبيند بيليه الخلية مع 400 ميليلتر 1640 RPMI (هيبيس) الشرائح المتوسطة وماصة ميليلتر 100 تعليق في قناة (انظر الشكل 1) لتصوير الأسفار [كنفوكل].
      ملاحظة: سوف الخلايا أجمة (أجلوتيناتي) بعد الغسيل واستثارة، ولكن الغسيل ضروري للحد من الأسفار الخلفية بسبب الأجسام المضادة الثانوية غير منضم.
  2. تأكيد opsonization خلايا الدم الحمراء البشرية، المسمى مسبقاً مع الماوس مفتش والمحتضنة مع المصل الماوس فارغة C5، مع استخدام، على سبيل المثال، الفئران الماوس المضادة C3b/iC3b/C3c جسم وجسم ثانوي، على سبيل المثال، C3b/iC3b الماعز لمكافحة الفئران مفتش الأجسام المضادة مترافق أن فلوروفوري فلورية خضراء.
    1. كرر الخطوات المذكورة في القسم 8 باستخدام خلايا الدم الحمراء البشرية أونستاينيد.
    2. إضافة 0.25 ميليلتر فلوريسسينتلي المسمى الماوس المضادة C3b/iC3b/C3c جسم إلى خليط 100 ميليلتر (50 ميليلتر المسمى IgG البشري خلايا الدم الحمراء + 50 ميليلتر C5 المصل الماوس فارغة)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    3. تغسل مرتين، ريسوسبيند بيليه في المتوسط 1640 RPMI (هيبيس) ميليلتر تعديل 100 وماصة تعليق إلى قناة الشريحة (انظر الشكل 1) لتصوير الأسفار [كنفوكل].

Representative Results

ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي للشريحة القناة المستخدمة لتصوير البلعمه بالفحص المجهري [كنفوكل] الغزل الوقت الفاصل بين. خلايا الدم الحمراء البشرية (هربكس) هي ملطخة بعلامة حمراء غشاء البلازما نيون أورانج سيلماسك، في حين وصفت الماوس معزولة الضامة البريتوني المقيم (مللي ثانية) مع أخضر نيون أليكسا فلور 488 مترافق مكافحة-F4/80 جسم ( الشكل 2)، الذي يعمل كعلامة محددة للماوس الضامة وتسمية غشاء البلازما. يمكن أوبسونيزيد خلايا الدم الحمراء البشرية مع الماوس مفتش (ميج)، أو الماوس IgM (ميجم)، التي تفرخ الخلايا مع الأجسام المضادة CD235a المضادة IgG (أو IgM) (CD235a، المعروف أيضا جليكوفورين، بروتين أعرب على وجه التحديد على خلايا الدم الحمراء البشرية). الوقت الفاصل بين التصوير ثلاثي الأبعاد من الضامة الفلورية الخضراء قدم البشرية الفلورسنت الأحمر الأحمر الدم الخلايا يمكن تصور الأحداث متجولة الجسيمات مفردة (الشكل 2). المراقبة الدقيقة لإحداث متجولة واحد يسمح تفاصيل التقاط الجسيمات وابتلاع تحديد. على سبيل المثال، يمكن ملاحظة القبض على أوبسونيزيد ميج البشرية خلايا الدم الحمراء قبل فيلوبوديوم بلعم، إسقاطاً رقيقة، مثل الأصابع، (الشكل 3A؛ انظر أيضا هورسثيمكي et al. 15). وعلاوة على ذلك، الضغط على خلايا الدم الحمراء البشرية أثناء تشكيل كأس متجولة يمكن ملاحظتها (الشكل 3A). عند إدخال المصل الماوس الطازجة، ميج-أوبسونيزيد، أو خلايا الدم الحمراء أوبسونيزيد ميجم، والبشرية يؤدي تتالي تكملة الكلاسيكية، التي تبلغ أوجها في تشكيل معقد الهجوم غشاء الانحلالي. ويمكن قياس الحركية من انحلال الدم بوساطة تكملة بتصوير الخلايا المزدوج الملون باللون البرتقالي سيلماسك وكالسين. سرعة الإفراج عن كالسين سيتوسوليك الفلورية الخضراء من الخلايا أثناء انحلال الدم (الشكل 3B).

Figure 1
رقم 1: التعامل مع الشرائح قناة المغلفة فيبرونيكتين- (A) A قناة الشريحة يتكون من خزانين متصلة بواسطة قناة مع أبعاد الشرائح 50 مم × 5 مم 0.4 مم. قناة يتم في البداية المعبأة بتطبيق متوسطة 1-2 مل على واحد من الخزانات اثنين وآماله الشريحة. يمكن أن يتم وضع قبعات (ب) الخزانات قبل الحضانة. يمكن استخدام القبعات مريح لضخ فقاعات الهواء غير المرغوب فيها قبل البذر القناة مع الخلايا. يمكن أن يشغل القناة 100 ميليلتر (ج) الهواء الفقاعة الحرة مباشرة بيبيتينج المتوسطة في فم قناة. يستخدم هذه الخطوة، على سبيل المثال، بالبذور الضامة في شريحة أو لإضافة جفلوروفوري (أخضر نيون)-مترافق الأضداد المضادة-F4/80، الذي يخدم كتسمية غشاء، فضلا عن علامة بلعم ماوس. (د) بعد بيبيتينج الجسيمات، مثل خلايا الدم الحمراء أوبسونيزيد البشرية، إلى قناة المصنف مع فلوريسسينتلي الملون الضامة، يمكن وضع الشريحة في مرحلة المجهر المقلوب، ويمكن أن الوقت الفاصل بين الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إجراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه. (أ) رسم تخطيطي عرض opsonization غشاء البلازما الملون (أحمر فلوري) خلايا الدم الحمراء البشرية (هربكس) مع الماوس (m) CD235a مكافحة غلوبيولين مناعي G (ميج) جسم، وعرض هربكس المسمى بالماوس الضامة (مللي ثانية)، المسمى (الفلورية الخضراء) مع أخضر نيون مترافق fluorophore المضادة-F4/80 جسم. (ب) الوقت الفاصل بين الصور (المشاهدات XZ)، التي حصلت عليها الغزل القرص المجهري [كنفوكل]، عرض تشكيل كأس متجولة وابتلاع ميج-أوبسونيزيد هربكس. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ج) 3D إعادة البناء عرض الضامة تناول ميج-أوبسونيزيد هربكس. عرض XZ المقابلة (على 3 تيميبوينتس) يتم عرضها في الشبكة ب المباعدة تمثل 5.07 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التقاط من الجسيمات التي فيلوبوديوم. الوقت الفاصل بين الصور، التي حصلت عليها الغزل القرص المجهري [كنفوكل]، عرض بلعم ماوس الاستيلاء ماوس غلوبيولين مناعي G (ميج)-أوبسونيزيد البشرية خلايا الدم الحمراء (هربك) عن طريق فيلوبوديوم (الأسهم في اللوحة العلوية)، إسقاطاً الشبيهة بالإصبع. نلاحظ أن خلايا الدم الحمراء يفقد كرينيشنز في وقت مبكر أثناء تشكيل كأس متجولة. وعلاوة على ذلك، يظهر كأس متجولة للضغط على خلايا الدم الحمراء المغلفة (المشار إليها بواسطة الأسهم الموجودة في لوحة أقل). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

لا توفر الغالبية العظمى من فحوصات البلعمه، لا سيما نقطة النهاية وفحوصات الفائق، التصور كيف الجسيمات هي فعلا القبض ويلفها وبلعها. دراسات رائدة بكأس مونتي et al. 10 و كابلان2 في السبعينات اقترح أن التنظيم cytoskeletal لافت للنظر مختلفة شاركوا في البلعمه من مفتش أوبسونيزيد مقابل أوبسونيزيد تكملة الجسيمات (خلايا الدم الحمراء الأغنام). هنا يصف لنا استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] فحوصات البلعمه التي تسمح لتصوير عالية الدقة، في الوقت الحقيقي للأحداث متجولة واحد. لدينا بلعمية النموذجي بلعم البريتوني المقيم الفأر، التي يمكن أن تكون معزولة مع معالجة الحد الأدنى، ونحن نستخدم خلايا الدم الحمراء البشرية المعزولة حديثا كجسيمات. ومع ذلك، يمكن تطبيق فحوصات البلعمه للبالعات الأخرى، مثل الماوس المشتقة من نخاع العظم الضامة أو العَدلات أو الماوس بلعم خطوط الخلايا البشرية الضامة المشتقة من الوحيدات العَدلات الدم المحيطي البشري. في حالة البالعات الإنسان أو الماوس العَدلات، سيكون البديل المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة المطلوبة، مثل مكافحة المسمى فلوريسسينتلي-CD14 الأجسام المضادة (البشرية حيدات/الضامة)16 أو مكافحة-غرام-1 (Ly-6 ز) الأجسام المضادة (الماوس العَدلات).

أونوبسونيزيد البشرية خلايا الدم الحمراء، مثل خلايا الدم الحمراء الأغنام تستخدم تقليديا، خاملة بمعنى بلعها هذه الخلايا عدم (أو، على الأقل، جداً نادراً ما) التي الضامة البريتوني الماوس. وهذا يضمن، على النقيض من الخرز البوليسترين، نشاط الخلفية منخفضة. يمكن أن تكون خلايا الدم الحمراء البشرية أوبسونيزيد مريح مع المناعية باستخدام الماوس IgG أو IgM الأجسام المضادة ضد CD235a (جليكوفورين A)، علامة محددة للبشرية الكريات الحمراء (خلايا الدم الحمراء) و السلائف محمر17، 18. في فحوصات موازية، يمكن تطبيق المسمى فلوريسسينتلي الماوس المضادة IgG أو IgM الثانوية الأضداد لتأكيد opsonization. فئات الأجسام المضادة IgM و IgG هي بينماهيماغلوتينين، المواد (الأجسام المضادة) التي تتسبب في خلايا الدم الحمراء أجلوتيناتي. لتجنب تراص، نحن بشكل متقطع مزيج تعليق خلية أثناء فترة الحضانة 8 دقيقة مع الأجسام المضادة CD235a، وثم نضيف تعليق مختلطة مباشرة إلى المحتوية على بلعم قناة شريحة (الشريحة المغلفة فيبرونيكتين) دون خطوة الغسيل . تشمل الخطوات الغسيل ترسيب خلايا الدم الحمراء باستخدام الطرد المركزي، الذي يشجع بشدة تراص. قبل أوبسونيزينج خلايا الدم الحمراء البشرية، يمكننا تسمية غشاء البلازما مع تحقيق البرتقالي/الأحمر نيون محبتين. هذا التحقيق الفلورسنت الزاهية في بداية الوقت الفاصل بين التسجيلات، ولكن الإشارة تدريجيا يتلاشى، وربما يرجع ذلك إلى حد كبير إلى فوتوبليتشينج19. وبالإضافة إلى ذلك، قد تصبح الضامة وطلاء فيبرونيكتين الشريحة ضعيف البرتقالي الأحمر نيون خلال التسجيلات. هذه المشكلة يفترض أنه بسبب الغسيل غير كافية من خلايا الدم الحمراء البشرية بعد وضع العلامات. بدلاً من استخدام علامة محبتين غشاء البلازما فلورسنت، يمكن تسمية خلايا الدم الحمراء البشرية بمشتق والرودامين حساسة لدرجة الحموضة باستخدام به أمين سوكسينيميديل رد الفعل إستر15،20. وهذا له ميزة السماح تصور نضج يبلوع نظراً لكثافة fluorescence يزداد مع انخفاض درجة الحموضة15،20، ولكن هذا النهج قد عيب إستر رد الفعل الاستعدادات حاليا باهظة الثمن وغير مستقر بعد إعادة تشكيل في وسط مائي.

يتم بلعها مفتش أوبسونيزيد خلايا الدم الحمراء البشرية عبر FcγRs، التي يمكن تأكيدها باستخدام الضامة البريتوني معزولة عن الطيارين21 أو Fcer1g--/--الفئران (Fcer1g خروج المغلوب). الضامة الطيارين وربط أوبسونيزيد مفتش خلايا الدم الحمراء البشرية، لكنها تفتقر إلى أيتام (إيمونوريسيبتور التنشيط المستندة إلى تيروزين عزر)-بوساطة الإشارات اللازمة للحث على البلعمه، بينما الضامة خروج المغلوب Fcer1g لا تعبر عن سطح FcγRs-مفتش- أو يمكن أوبسونيزيد أوبسونيزيد IgM البشري خلايا الدم الحمراء بالإضافة إلى ذلك مع C3b (الذي هو المشقوق إلى iC3b) التي تفرخ الخلايا مع المصل الطازج معزولة من تكملة C5 ماوس فارغة (البرية من نوع المصل يسبب انحلال الدم). أوبسونينس IgG و IgM تنشيط تتالي تكملة الكلاسيكية، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل المسام (غشاء الهجوم مجمعات) وتحلل الخلية. في الفئران التي تفتقر إلى تكملة C5، عائدات تتالي مكملاً لتكملة الانقسام C3، ولكن كونفيرتاسي C5 يفتقر إلى الركيزة اللازمة لتحفيز المسار المحطة الطرفية. قمنا بتطوير فحوصات بسيطة لقياس حركية تتالي تكملة. وباختصار، يمكن أن تكون خلايا الدم الحمراء البشرية المشترك المسمى بأحمر نيون وعلامة غشاء البلازما وفلوروفوري نيون، سيتوسوليك الأخضر. عند تكوين غشاء الهجوم المعقدة، شكلتها تكملة مكونات C5-C9، فلوروفوري سيتوسوليك سرعة (بالثواني) فقدت من سيتوسول. التصور لوظيفة تتالي تكملة نهاية-المستجيب (cytolysis) أشار إلى أن وقت الحضانة 4 دقيقة كافية ل opsonization C3b/iC3b من خلايا الدم الحمراء البشرية. في فحوصات موازية، يمكن تقييمها بسهولة بعد تطبيق مزيج C3b الماوس المضادة طلاء C3b/iC3b من خلايا الدم الحمراء البشرية والمسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة الثانوية. وفي هذه الحالة، مطلوب خطوة غسيل لإزالة الأجسام المضادة الفلورية غير منضم. على الرغم من أن تتضمن الخطوة أغسل سيديمينتايون خلية بالطرد المركزي، الذي يشجع تراص، يمكن تقييم opsonization الناجح سهولة خلال الفحص المجهري [كنفوكل]. يمكن تصويرها تكمل بوساطة مستقبلات البلعمه بمفتش أما تطبيق-/خلايا الدم الحمراء البشرية أوبسونيزيد iC3b للطيارين أو Fcer1g-/-الضامة أو عن طريق إدخال IgM-/خلايا الدم الحمراء البشرية أوبسونيزيد iC3b إلى البرية من نوع الضامة. أوبسونيزيد IgM خلايا الدم لا يعترف بها المحتوية على أيتام FcγRs (FcγRI و FcγRIII و FcγRIV) اللازمة البلعمه من الجسيمات أوبسونيزيد مفتش22.

الصورة متجولة يمكن المسمى الأحداث، غشاء البلازما الضامة مع جسم المضادة-F4/80 مترافق fluorophore الفلورية الخضراء، الذي يعمل أيضا كعلامة محددة من الضامة الماوس. خلايا الدم الحمراء البشرية يمكن أن يصبح الأحمر نيون بالحضانة مع علامة غشاء البلازما فلورسنت الأحمر البرتقالي، كما نوقش أعلاه. هذه العلامة غشاء البلازما محبتين يتجنب الآثار الخلط المحتملة للتسميات المستندة إلى جسم. الأحمر نيون البشرية خلايا الدم الحمراء، مع أو بدون أوبسونيزيشن، يمكن أن يكون بيبيتيد مباشرة إلى القناة 100 ميليلتر من شريحة القناة وتصويرها الوقت الفاصل بين ثلاثي الأبعاد عن طريق 60 X/1.49 نفط الغمر (أو ما شابه ذلك) عدسة الهدف إجراء استخدام 488 في شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الليزر خطوط ، على التوالي، من الغزل القرص المجهر [كنفوكل] (أو ما شابه). أنه من المغري لتحسين النظام للتصوير عالي الدقة، ولكن الحصول على المتكررة Z-مداخن أكثر من 16 دقيقة أو حتى قد يسبب فوتوبليتشينج كبيرة والضيائيه. لقد اخترنا لاستخدام 2 × 2 binning لتعزيز نسب إشارة إلى الضوضاء جيدة والسماح بإجراء تخفيضات في شدة الإثارة و/أو أوقات التعرض، ولكن على حساب الدقة البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، لتقليل الضيائية، نضيف الكاسح للأنواع الأكسجين التفاعلية إلى المتوسط. في الدراسات المستقبلية، يمكن تعديله فحوصات الصورة البلعمه لخلايا الدم الحمراء البشرية أبوبتوتيك. يمكن استخدام التطبيق من Ca2 + إيونوفوري، مثل A23187، لحمل فوسفاتيديلسيريني تخريج23، "أكل لي" الإشارات والسمات المميزة لأوائل المبرمج24،25.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

منح ها 3271/4-1 وها 3271/4-2 من DFG (Deutsche الأوقيانوغرافية)، ومنحة FF-2016-05 من الخلايا في الحركة (CiM)، DFG EXC 1003 (الكتلة التميز 1003)، أيد هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 G plastic catheter B Braun Mesungen AG, Germany 4254503-01 Used for peritoneal lavage
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14170120 Used for peritoneal lavage
14 mL polypropylene round bottom tubes BD Falcon 352059 Used to collect peritoneal cells
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes Sigma-Aldrich R7388 Basis medium for assays
Heat-inactivated fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10082139 Used as supplement for RPMI 1640 media
100x penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Used as supplement for RPMI 1640 media
Fibronectin-coated µ-Slide I chambers Ibidi, Martinsried, Germany 80102 Channel slides used for assays
µ-Slide (anodized aluminum) rack Ibidi, Martinsried, Germany 80003 Autoclavable stackable rack for channel slides
RPMI 1640 medium containing bicarbonate Sigma-Aldrich R8758 Medium for overnight culture
N-(2-mercaptopropionyl)glycine Sigma-Aldrich M6635 Scavenger of reactive oxygen species
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody Thermo Fisher Scientific MF48020 Mouse macrophage marker and plasma membrane label
CellMask Orange Thermo Fisher Scientific C10045 Red fluorescent plasma membrane stain
Succinimidyl ester of pHrodo Thermo Fisher Scientific P36600 Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo
Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a  Thermo Fisher Scientific MA1-20893 Used to opsonize human red blood cells with IgG
Alexa Fluor 594-conjugated  goat anti-mouse (secondary) IgG antibody Abcam Ab150116 Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG
Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody Hycult Biotech HM1065 Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody Thermo Fisher Scientific A-11006 Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization
Calcein/AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Used to load human red blood cells with Calcein
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system  Perkin Elmer, Rodgau, Germany Spinning disk confocal microscope system
Nikon Eclipse Ti inverse microscope Nikon, Japan Inverted microscope
CSU-X1 spinning disk scanner Yokogawa Electric Corporation, Japan Nipkow spinning disk unit
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera Hamamatsu Photonics Inc., Japan EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system 
488 nm solid state laser, 50 mW Perkin Elmer, Rodgau, Germany Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system
561 nm solid state laser, 50 mW Perkin Elmer, Rodgau, Germany Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature reviews. Molecular cell biology. 4, 897-901 (2003).
  2. Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
  3. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The journal of cell biology. 105, 1473-1478 (1987).
  4. Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
  5. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual review of immunology. 17, 593-623 (1999).
  6. Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
  7. Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
  8. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
  9. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
  10. Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
  11. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
  12. Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
  13. Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
  14. McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
  15. Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
  16. Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
  17. Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
  18. Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
  19. Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
  20. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
  21. Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
  22. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
  23. Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
  24. Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
  25. Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 140، الضامة، البلعمه، خلية يعيش التصوير، والغزل القرص المجهري [كنفوكل]، Fcγ مستقبلات مستقبلات تكملة
الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg,… More

Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (140), e57566, doi:10.3791/57566 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter