Summary
Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.
Abstract
Phagocytose joue un rôle clé dans la défense de l’hôte, ainsi que dans l’entretien et le développement des tissus et implique des réarrangements rapides, médiée par les récepteurs du cytosquelette d’actine pour capturer, enveloppent et engloutir de grosses particules. Bien que les récepteurs phagocytaires, les voies de signalisation en aval et effecteurs, tels que les GTPases Rho, ont été identifiés, le remodelage du cytosquelette dynamique d’événements phagocytaires médiée par les récepteurs spécifiques demeurent incertains. Il y a quatre décennies, deux mécanismes distincts de phagocytose, illustrée par des récepteurs Fcγ (FcγR) - et les récepteurs du complément (CR) - médiée par phagocytose, ont été identifiés à l’aide de la microscopie électronique à balayage. Liaison d’immunoglobuline G (IgG)-particules opsonisées FcγRs déclenche la saillie des extensions de la fine membrane, qui forment au départ une tasse phagocytaire soi-disant autour de la particule avant qu’il devient complètement clos et rentrer dans la cellule. En revanche, les particules de complément opsonized semblent s’enfoncer dans les phagocytes après fixation aux récepteurs de complément. Ces deux modes de phagocytose, formation coupe phagocytaire et naufrage, sont devenus bien établie dans la littérature. Cependant, les distinctions entre ces deux modes sont devenues floues par les rapports que la phagocytose médiée par les récepteurs du complément peut induire diverses saillies de membrane. Avec la disponibilité des techniques d’imagerie de haute résolution, des essais de phagocytose sont nécessaires qui permettent la visualisation en temps réel de 3D (trois dimensions) de récepteurs phagocytaires comment spécifiques médiat l’absorption des particules individuelles. Plus couramment utilisé des approches pour l’étude de la phagocytose, notamment des essais de point final, manquer l’occasion de comprendre ce qui se passe à l’interface des particules et des phagocytes. Nous décrivons ici les dosages phagocytaires, à l’aide de la microscopie confocale disque spinning Time-lapse, qui permettent l’imagerie 3D de simples événements phagocytaires. En outre, nous décrivons les dosages pour sans ambiguïté l’image récepteurs Fcγ - ou compléter la phagocytose médiée par les récepteurs.
Introduction
Vingt ans plus tôt l’observation de Metchnikoff des cellules phagocytaires mésenchyme chez les larves de l’étoile de mer, en 1882 et le développement subséquent de sa théorie de la phagocytose1, Ernest Haeckel décrit, en 1862, l’enlisement des particules de colorants insolubles par le sang cellules de fimbris de Thetis (fimbria Tethys), une espèce de limace de mer prédateur (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria) : Eine Monographie ; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Il a décrit explicitement des saillies de membrane enveloppant les particules qui ont été ensuite repris dans le cytoplasme et accumulés autour du noyau de la cellule. Plus de 100 ans plus tard, une étude pionnière de Kaplan a suggéré qu’il y avait au moins deux mécanismes distincts de phagocytose2. Kaplan a montré au moyen de la microscopie électronique à balayage de cette souris péritonéale macrophages ingéré un globule rouge mouton IgG-opsonized à l’aide des extensions de fine membrane qui a atteint vers le haut et enveloppée hermétiquement la particule, initialement donnant lieu à un coupe-like structure. Phagocytaires coupe formation requise polymérisation de l’actine, puisqu’elle a été abrogée par la toxine fongique cellules perméables cytochalasine B, connu pour bloquer la dynamique de l’actine3. En revanche, les globules rouges de mouton opsonized avec complément semblait s’enfoncer directement dans le macrophage sans la génération des extensions de la membrane, bien que, dans certaines images, volants de membrane peuvent être vu dans le voisinage immédiat des particules naufrage. Contrairement à la formation de coupe phagocytaires, complément médiée par les récepteurs naufrage en a été insenstive à la cytochalasine B traitement2. Dans les expériences décrites par Kaplan, complément opsonisation a été réalisée en incubant des immunoglobulines M (IgM) étiqueté moutons globules rouges avec du sérum de souris complément C5-déficient, qui contourne l’hémolyse par le terminal de complément C5-dépendante compléter le complexe.
Les deux modes de phagocytose, formation coupe phagocytaire et naufrage, identifiés par Kaplan sont devenus les avis établis dans le champ4,5,6,7,8,9 . Cependant, les images à très haute résolution utilisée dans l’étude originale de Kaplan2, comme une étude similaire réalisée par Munthe-Kaas et al. 10, seulement des instantanés des événements phagocytaires. Dans une étude récente, Rougerie et al. 11 a souligné que les différences morphologiques entre FcγR et CR-médiée par phagocytose restent à clarifier et, en outre, membrane volants ont été observés pendant complément médiée par les récepteurs particule absorption2. Imagerie de cellules vivantes des événements phagocytaires uniques allant de capture des particules à l’internalisation, combinée avec génétiquement modifié des souris modèles, pourrait grandement améliorer notre compréhension de comment les phagocytes capturent et ingèrent des particules. Une approche peut consister à utiliser la microscopie à force atomique rapide (AFM) qui permet l’imagerie topographique très haute résolution (10 à 20 nm) des cellules vivantes. Récemment, un rapide du système AFM12 a été développé, qui est adapté pour des surfaces cellulaires d’imagerie rapide avec peu de bruit. Cette technique a l’avantage que paramètres haute résolution, topographiques et mécanique des cellules peuvent être mesurées à de courts intervalles (secondes), contrairement à la microscopie électronique, qui nécessite la fixation et le point critique de séchage de la vie cellules. Une autre approche est la microscopie confocale 3D Time-lapse, laquelle est largement disponible, bien que la phototoxicité et blanchiment sont des facteurs limitants durant les enregistrements. Cette approche est très polyvalente et permet optique découpe avec une résolution spatiale élevée et permet une souplesse extraordinaire au marquage avec un éventail impressionnant de sondes fluorescentes, y compris des protéines fluorescentes codés génétiquement. Nous décrivons ici la phagocytose tests à l’aide de la microscopie confocale disque spinning Time-lapse qui permettent à haute résolution spatio-temporelle d’événements phagocytaires médiée par les récepteurs spécifiques.
Protocol
Les protocoles de suivent les lignes directrices de notre Comité d’éthique de la recherche humaine locale, ainsi que les directives de protection des animaux.
1. isolement des Macrophages péritonéaux de souris résidentes
- Sacrifier la souris (3 à 4 mois d’âge (ou l’autre sexe) ; par exemple La souche C57BL/6) à l’aide d’une surdose de l’isoflurane anesthésique volatil (> 5 % dans l’air) ou le dioxyde de carbone13, suivie par la dislocation cervicale. Induction de l’anesthésie peut être facilement évaluée par perte de réflexes14de redressement, ainsi que par la perte du réflexe de retrait de patte.
- Après avoir nettoyé le ventre de la souris avec 80 % d’éthanol dans l’eau, faire une incision de la peau médiane et exposer la paroi abdominale sous-jacente.
- Placer un cathéter en plastique 24-G dans le peritonium et le lavage de la cavité avec la solution saline tamponnée de Hank glacee 2 x 4.5 mL (HBSS), sans Ca2 + et Mg2 +via une seringue en plastique de 5 mL. Tout en injectant, laissez environ 0,5 mL résiduelle HBSS (5 – 4,5 mL (injecté) = 0,5 mL) dans la seringue dans le cas des tissus est aspiré dans l’extrémité du cathéter et doit être expulsé. Transférer la suspension aspirée dans un tube en polypropylène fond rond 14 mL et centrifuger à 300 x g pendant 6,5 min à température ambiante.
Remarque : L’extrémité du cathéter en plastique est émoussé, qui, comparé à une aiguille, minimise les blessures le contenu abdominal. En général, qui suit en douceur massage abdominale, suspension de cellules péritonéales de 8 mL peut être récupérée dans la cavité péritonéale. - Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules péritonéales dans 1 mL de bicarbonate RPMI 1640 un milieu sans contenant 20 mM Hepes, 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et des antibiotiques, tels que la pénicilline (100 unités/mL) et à la streptomycine (100 µg/mL), établi par diluer 100 x pénicilline/streptomycine au 1/100. Cela donne généralement une concentration d’environ 6 x 106 cellules/mL.
NOTE : Environ 30 % des cellules péritonéales isolés sont des macrophages, tandis que les autres cellules (plus petits) sont des lymphocytes, principalement les lymphocytes B.
2. ensemencement de cellules péritonéales dans canal glisse
-
Après avoir effectué la suspension cellulaire haut et bas pour réduire l’agglutination, pipette 100 µL de la suspension dans le canal prérempli (volume, 100 µL) d’une lame de canal revêtu la fibronectine (un canal de 100 µL a les dimensions (longueur x largeur x hauteur) : 50 x 5 mm 0. 4 mm).
- Pré-remplir la chambre en ajoutant 1 mL additionné de sérum RPMI 1640 (Hepes) médium à l’un des deux réservoirs de la diapositive de canal, inclinaison de la lame et puis aspirer le milieu du barrage en aval (Figure 1).
- Supprimer les indésirables de bulles d’air, ou de longues bandes d’air, dans le chenal en ajoutant 1 à 2 mL de milieu à l’un des deux réservoirs, étroitement appliquant un bouchon du réservoir et ensuite pomper de l’air par pression du pouce rythmique sur la PAC et, le cas échéant, inclinaison de la lame. Après avoir chassé l’air, inclinez la lame avec le réservoir non plafonné (et contenant le support) vers le bas avant de retirer le bouchon pour éviter l’air soit aspiré dans le canal.
- Pré-remplir la chambre en ajoutant 1 mL additionné de sérum RPMI 1640 (Hepes) médium à l’un des deux réservoirs de la diapositive de canal, inclinaison de la lame et puis aspirer le milieu du barrage en aval (Figure 1).
- Incuber la lame de canal, ensemencée avec des cellules, dans une chambre humide pendant 2 h à 37 ° C en l’absence de CO2 (CO2 n’est pas requis car le HCO3-système de tampon/co2 est remplacé par Hepes). Les diapositives de canal peuvent être idéalement placés sur une grille, qui détient huit diapositives. En général, 6 – 8 diapositives sont préparées à partir une souris, mais vers le haut à 10 ou plusieurs est possible.
-
Enlever le panier et échanger le milieu RPMI 1640 (Hepes) de chaque diapositive pour le bicarbonate contenant milieu RPMI 1640, additionné de sérum de veau fœtal 10 %, ainsi que la pénicilline/streptomycine.
- Inclinez la lame et aspirer moyen tout d’abord le réservoir inférieur, puis du réservoir supérieur. Ensuite, ajouter 1 mL de ce nouveau média à l’un des réservoirs, incliner le support de diapositive et aspirer du barrage en aval, après qu’il a coulé à travers le canal.
- Après cette étape de lavage (moyenne change), remplissez la glissière de chaîne en ajoutant 1 mL de milieu à l’un des réservoirs.
NOTE : Étapes à l’aide de diapositives de canal de lavage est très simple et efficace en termes de solution exchange et de retirer les cellules non adhérentes. Notez que le milieu RPMI 1640 (bicarbonate de) est normalement pré-incubées avec 5 % CO2 pendant la nuit afin d’assurer l’équilibre thermique et pH.
- Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Réaliser des expériences sur le lendemain.
3. séparation des globules rouges humains
- Jour 2 (second jour d’expériences ; après une nuit d’incubation des macrophages péritonéaux isolés), prélever 1 à 2 mL de sang veineux périphérique provenant d’un donneur sain, dans un tube hépariné. Transférer 1 mL dans un tube de microcentrifuge fond rond 2,0 mL (polypropylène), centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 18 ° C (réglage empirique) et éliminer le surnageant (plasma et couche leuco-plaquettaire).
- Doucement, aspirer 100 µL de globules rouges sédimentent et mélanger ce volume 1:1 avec le milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié (décrit ci-dessous) dans un tube de microtubes de 2,0 mL fond rond. Etiqueter le tube « 1:1 ».
NOTE : Le support de RPMI 1640 (Hepes) utilisé au jour 2 (pour des dosages) après isoler les cellules contient, en plus de 10 % sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur, la pénicilline (100 unités/mL), streptomycine (100 µg/mL) et 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glycine (afin de réduire phototoxicité). Ci-après, ce milieu est dénommé « modifié » milieu RPMI 1640 (Hepes). - Pipetter 4 µL de la suspension de 1:1 dilué érythrocytaires dans 2 mL milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié, éjectant préalablement dans un tube de microtubes de 2,0 mL (répétez cette étape, c'est-à-dire préparer les 2 tubes). Etiqueter chaque tube à essai 4 : « 2000 ». Placer les tubes « 1:1 » et « 4 : 2000 » sur la glace.
4. marquage de la Membrane plasmique de Macrophage
- Supprimer les diapositives canal ensemencée de l’incubateur à CO2 et d’échanger le milieu RPMI 1640 (bicarbonate) de chaque diapositive pour milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Ensuite, placez les cellules dans une chambre humide à 37 ° C en l’absence de CO2.
NOTE : Après une nuit d’incubation et de lavage, la plupart des lymphocytes est retirée de la chaîne. La majorité des cellules adhérentes restants est des macrophages, qui peuvent être identifiés morphologiquement ou par immunofluorescence souillant utilisant des anticorps anti-F4/80. Environ 95 % des macrophages péritonéaux résident de souris sont F4/80 positive. - Diluer fluorescent vert étiqueté anti-souris F4/80 anticorps (conservée à 4 ° C) 01:40 mis à jour le milieu RPMI 1640 (Hepes). Prendre une diapositive, inclinez-le et Pipeter (goutte à goutte) 100 µL du mélange anticorps dans l’ouverture du canal 100 µL de la lame (voir Figure 1). Aspirez le milieu qui se jette dans le réservoir en aval. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C (environnement humidifié, sans CO2). Au cours de la période d’incubation, étiqueter les globules rouges humains (voir la Section 5).
Remarque : Comme nous l’avons ci-dessus, CO2 n’est pas requise depuis le HCO3-système de tampon/co2 est remplacé par Hepes. - Après que 20 min temps d’incubation (au cours de laquelle les globules rouges humains sont colorées et opsonized), lavez la diapositive en ajoutant 1 mL de modification milieu RPMI 1640 (Hepes) à l’un des réservoirs et en aspirant le milieu après qu’il a coulé à travers le canal, facilitée par l’inclinaison de la lame. Ajouter 1 mL de milieu pour le stockage à court terme ou procéder à une expérience (c'est-à-dire, pipetage en particules (opsonisées globules rouges) et d’imagerie de phagocytose par microscopie confocale de Time-lapse tourne disque).
5. marquage de la Membrane plasmique des globules rouges humains
- Commencer le marquage des globules rouges humains immédiatement après l’incubation d’une diapositive des macrophages avec vert fluorescent étiquetés anticorps d’anti-F4/80 (après la Section 4.2). Après avoir mélangé doux, prenez 400 µL de l’un des tubes « 4 : 2000 » (voir la Section 3.3) et dispensent dans un tube de microtubes de 2,0 mL (fond rond). Permettre la suspension se réchauffer à environ 37 ° C (voir le paragraphe ci-dessous). Ajouter teinté de rouge/orange fluorescent membrane plasmique 0,4 µL (aliquots stockés à-20 ° C), mélanger et laisser incuber à 37 ° C pendant 5 min.
Remarque : Un bloc d’aluminium chauffée, placé à l’intérieur de la hotte à flux laminaire, est utile pour réduire au minimum la perte de chaleur tout en préparant des diapositives. Tubes peuvent être placés dans les forages du bloc chauffage et un autre, ou plaque d’aluminium intégrée, chauffée peut servir comme un espace de travail. - Après la période d’incubation de 5 min, préparer la première étape de lavage en ajoutant 1600 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyen (pour remplir le tube de microtubes de 2,0 mL).
- Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 18 ° C (réglage empirique). Une pastille rouge compacte doit être visible sur le mur (p. ex., décentré) au fond du tube. Tourner le tube pour que la pastille est vers le haut et retirez délicatement le surnageant successivement (en deux étapes) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 à 1,5 mL toutes.
- Après avoir aspirer le surnageant, ajouter 2 000 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyen, mix (pour remettre en suspension les cellules) et répétez les étapes ci-dessus d’aspiration de centrifugation puis le surnageant.
- Resuspendre le culot (de membrane plasmique souillé et 2 x lavé des globules rouges) avec 400 µL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modifié. Etiqueter le tube PMS (abréviation de tache de la membrane plasmique).
Remarque : Par ailleurs, le succinimidyl ester d’un dérivé rhodamine sensibles au pH, qui devient plus fortement fluorescent à pH acide, pourrait être utilisé pour étiqueter des globules rouges humains. Dans ce cas, l’intensité de la fluorescence sert en outre comme mesure de la maturation du phagosome après que les particules ont été intériorisés.
6. opsonisation (étiquetage) des globules rouges humains avec souris immunoglobuline G (IgG)
- Ajouter 1 µL souris (IgG2b) monoclonales (clone HIR2) anti-humain CD235a anticorps (1 mg/mL) (conservé à-20 ° C) au tube étiqueté PMS (voir Sections 5.2-5.5), contenant de la membrane plasmique teinté de globules rouges humains suspendus dans 400 µL de milieu. CD235a (également connu comme la glycophorine A) est une sialoglycoprotéine de membranaire spécifique lignée érythroïde.
-
Incuber à 37 ° C pendant 8 min. Note l’opsonisation des globules rouges humains avec agglutination de causes d’IgG (agglutination des cellules). Agglutination peut servir d’un indicateur visuel d’opsonisation, mais il est indésirable pour l’imagerie des effets phagocytaires unique. Pour contourner l’agglutination, à plusieurs reprises mélanger la suspension cellulaire (toutes les 1 min) en utilisant, par exemple, une variable pipette de 20-200 µL volume set à 200 µL.
- Vers la fin de la période d’incubation de 8 min, si désiré, laver la diapositive de macrophage, incubée avec vert fluorescent étiquetés anticorps anti-F4/80, avec 1 mL de milieu RPMI 1640 (Hepes) modification. Veiller à ce que les deux réservoirs de la diapositive de canal sont exempts de moyenne après les étapes de lavage.
7. la phagocytose de la Membrane plasmique d’imagerie souillé et IgG-enduit de globules rouges humains
- Après le 8 min d’incubation avec l’anticorps anti-CD235a (Section 6.2), pipette 100 µL de suspension contenant colorés à la membrane plasmique et IgG-opsonized globules rouges humains dans le canal d’une diapositive contenant des macrophages étiquetés avec vert fluorescent anti-F4 / anticorps 80 (étape 4). Ainsi, rouges fluorescents, IgG-opsonized globules rouges humains sont ajoutés au verts fluorescents phagocytes (macrophages).
- Dès que les globules rouges humains ont été ajoutés, monter la diapositive de canal sur un microscope confocal de tourne disque (avec l’incubateur de stade réglé à 37 ° C) pour l’imagerie, par exemple, via un 60 X / 1,49 lentille d’objectif-immersion dans l’huile. Commencer d’imagerie dès que possible, puisque les particules commencent à s’installer au sein de 1 min.
Remarque : L’utilisation de perles fluorescentes avec un diamètre de 100 nm, nous avons mesuré, par analyse du point spread fonctions, résolutions XY de x = 0,22 µm, y = 0,23 µm (laser à 488 nm) et x = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 laser nm). Toutefois, pour réduire le photoblanchiment et phototoxicité durant l’imagerie 3D accéléré des cellules vivantes, nous compromettre une résolution spatiale utilisant binning 2 x 2. Binning augmente la sensibilité (améliore le rapport signal sur bruit) et la fréquence d’images autorisées, mais au détriment de la résolution spatiale. - Utiliser une mise au point parfaite (ou similaire) système pour empêcher la dérive de mise au point pendant les enregistrements. Après avoir activé le système de mise au point parfaite, utilisez le contrôle de décalage de se concentrer sur les saillies lamellipode macrophage immédiatement au-dessus de la lamelle couvre-objet (voir note ci-dessous) de la glissière de chaîne. Ce niveau de la mise au point correspond à Z = µm 0. obtenir Z-cheminées de µm-1 à + 16 µm à 0,8 µm pas, qui s’élève à 22 Z-tranches. Z-piles peuvent, par exemple, être obtenues à un taux de 1 pile (pour chaque canal) toutes les 15 s pour un total de 16 min.
Remarque : Plus longues périodes d’enregistrement souffrent de pertes de qualité de l’image, principalement en raison de photoblanchiment. Z-piles sont acquis pour chacun des deux canaux : les macrophages sont imagés à l’aide d’un laser à 488 nm (couche verte) et de globules rouges humains sont imagés à l’aide d’un laser à 561 nm (canal rouge). En utilisant cette approche, diverses vues de macrophages ingérant IgG-opsonized globules rouges humains à différents intervalles peuvent être obtenus (par exemple, voir la Figure 2).
Remarque : Les paramètres par défaut du système (avec 2 x 2 binning) sont : canal vert (20,5 % laser (50 mW ; 488 nm) de puissance, sensibilité 101 (, 0 à 255) et temps d’exposition de 200 ms) ; couche rouge (laser de 10,5 % (50 mW ; 561 nm) de puissance, sensibilité 101 (intervalle : 0-255) et temps d’exposition 98 ms).
Remarque : Le bas de la glissière de chaîne est un polymère ayant la même épaisseur comme une lamelle de verre #1.5 et les mêmes propriétés optiques du verre, mais, notamment, le matériau a l’avantage de perméabilité au gaz.
8. imagerie de la phagocytose de la Membrane plasmique coloré et enduit de complément de globules rouges humains
- Complément-opsonize plasma membrane colorés et rouge sang IgG-opsonized cellules de même aux Sections 5 et 6, sauf, au lieu de pipetage 4 µL de la suspension de 1:1 dilué de globules rouges dans un milieu RPMI 1640 (Hepes) 2 mL modifié, tel que décrit à la Section 3.3, distribuer 4 µL dans milieu RPMI 1640 (Hepes) 1 mL modifiée et par conséquent l’étiquette du tube 4:1, 000. Ainsi, les globules rouges humains sont 2 x plus concentré.
- Poursuivez les étapes décrites dans les Sections 4 et 5, mais commencer par le 4:1,000 plutôt que le stock de 4:2,000 dilué de globules rouges humains (4:1, 000 et 4:2,000 référez vous aux dilutions suivantes des initialement 1:1 dilués humains sang globules rouges décrites dans les Sections 3.1 et 3.2).
- Sacrifier une souris nulle C5 (p. ex., B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ ; Laboratoire de Jackson) par inhalation d’isoflurane (> 5 % dans l’air) suivie par décapitation et de recueillir le sang. Habituellement, nous laisser couler environ 0,8 mL de sang dans un tube en plastique à fond rond 14 mL immédiatement après la décapitation et l’inhalation isoflurane.
- Après 1 h, lorsque le sang est entièrement coagulé, transférer le reste de liquide dans un tube de microtubes de 2,0 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Par la suite, soigneusement recueillir le sérum jaunâtre. En général, on retrouve au moins 200 µL C5 de sérum null. Placez le sérum null C5 sur la glace.
- Après que 4 min d’incubation de la membrane plasmique tachée de globules rouges humains avec des IgG, ajouter un autre 1 µL d’anticorps anti-CD235a (ce qui donne 2 x concentré), puis prendre 50 µL de la suspension cellulaire et mélangez-le dans un tube de microcentrifuge distinct 2,0 mL contenant 50 µL C5 null sérum. Continuer à mélanger plusieurs fois (toutes les 1 min) par pipetage de haut en bas, comme dans Section 6.2, pendant 4 min. Ainsi, après cette étape, les globules rouges humains ont été incubées avec l’anticorps anti-CD235a pour un total de 8 min.
Remarque : La période d’incubation de 4 min avec C5 sérum null est suffisante pour activer la cascade du complément classique et opsonize les globules rouges humains avec C3b, qui est dégradé en facteur I iC3b.
9. confirmation des IgG - et C3b-opsonisation de globules rouges humains
-
Confirmer l’opsonisation des globules rouges humains avec des anticorps de souris anti-CD235a IgG (IgG2b ; voir Section 6.1) en incubant les cellules avec les anticorps IgG (secondaire) de chèvre anti-souris conjugués à un fluorophore fluorescent vert ou rouge.
- Ajoutez des anticorps IgG de 1 µL de souris anti-CD235a et 1 µL fluorescent étiquetés anti-souris anticorps secondaire à un 400 µL de la suspension de globules rouges humains et incuber à 37 ° C pendant 8 min. Par la suite, laver deux fois (comme dans Sections 5.2 – 5,5).
- Remettre le culot cellulaire avec 400 µL modifiée RPMI 1640 (Hepes) moyenne et la pipette 100 µL de la suspension dans un canal glisser (voir Figure 1) pour l’imagerie confocal fluorescence.
Remarque : Les cellules seront touffe (agglutinante) après le lavage et la remise en suspension, mais le lavage est nécessaire pour réduire la fluorescence de fond en raison de l’anticorps secondaire indépendant.
-
Confirmer opsonisation de globules rouges humains, préalablement marquées avec souris IgG et incubées en présence de sérum de souris null de C5, avec C3b/iC3b utilisant, par exemple, rat de C3b/iC3b/C3c anticorps anti-souris et un anticorps secondaire, par exemple, anticorps de type IgG de anti-rat chèvre conjugué à un fluorophore fluorescent vert.
- Répétez les étapes décrites dans l’article 8 à l’aide sans coloration des globules rouges humains.
- Ajouter 0,25 µL fluorescent étiqueté de C3b/iC3b/C3c anticorps anti-souris au mélange 100 µL (50 µL marqué IgG humaine globules rouges + 50 µL de sérum de C5 souris null) et incuber à 37 ° C pendant 8 min.
- Laver deux fois, resuspendre le culot dans 100 µL de modification de milieu RPMI 1640 (Hepes) et pipette de la suspension dans un canal glisser (voir Figure 1) pour l’imagerie confocal fluorescence.
Representative Results
Un diagramme schématique de la diapositive de canaux utilisé pour l’imagerie de phagocytose par microscopie confocale spinning Time-lapse est illustré à la Figure 1. Globules rouges humains (hRBCs) sont colorées avec le marqueur de la membrane plasmique fluorescent rouge CellMask Orange, tandis que les macrophages péritonéaux résident isolés de souris (Ms) sont étiquetés avec vert fluorescent Alexa Fluor 488 anti-F4/80 anticorps conjugué ( Figure 2), qui sert comme un marqueur spécifique des macrophages de souris et une étiquette de la membrane plasmique. Globules rouges humains peut être opsonized avec la souris IgG (mIgG) ou d’IgM (mIgM), la souris en incubant les cellules à IgG (ou IgM) anticorps anti-CD235a (CD235a, également connu sous le nom de glycophorine A, est une protéine exprimée spécifiquement sur les globules rouges humains). Time-lapse imagerie 3D des macrophages fluorescents verts, présenté avec rouges fluorescents globules rouges humains permet la visualisation des événements phagocytaire de particule (Figure 2). Une observation attentive des événements phagocytaires unique permet détails de la capture des particules et l’ingestion pour être délimité. Par exemple, la capture d’un mIgG-opsonized humain globule rouge par un filopodium de macrophage, une projection mince, doigt, peut être observée (Figure 3 a; Voir aussi Horsthemke et al. 15). en outre, la compression d’une cellule humaine du sang rouge pendant la formation coupe phagocytaires peut être observée (Figure 3 a). Lors de l’introduction de sérum de souris fraîche, mIgG-opsonized, ou de globules rouges humains, mIgM-opsonized déclenchent la cascade de complément classique, qui aboutit à la formation d’un complexe d’attaque membranaire hémolytique. La cinétique d’hémolyse médiée par le complément peut être mesurée par imagerie de cellules double marquage avec CellMask Orange et calcéine. Vert fluorescent calcéine cytosolique est rapidement libéré par les cellules au cours de l’hémolyse (Figure 3 b).
Figure 1 : manipulation des diapositives de canal revêtu la fibronectine. Diapositive de canal (A) A se compose de deux réservoirs reliés par un canal avec les dimensions 50 x 5 mm 0,4 mm canal diapositives sont préremplis initialement en appliquant 1-2 mL de milieu à l’un des deux réservoirs et en inclinant la diapositive. Caps (B) peuvent être placés dans les réservoirs avant l’incubation. Les bouchons peuvent être utilisées pour pomper de bulles d’air indésirables avant le semis du canal avec les cellules. Canal de 100 µL (C) l’air exempt de bulles peut être comblé par pipetage directement moyen dans la bouche d’un canal. Cette étape est utilisée, par exemple, aux macrophages de graines dans une diapositive ou d’ajouter gfluorophore (vert fluo)-anticorps anti-F4/80 conjugué, qui sert une étiquette de membrane, mais aussi un marqueur de macrophages de souris. (D) après que pipetage des particules, comme opsonisées globules rouges humains, dans un canal ensemencé avec fluorescent teinté de macrophages, la lame peut être placée sur la scène d’un microscope inversé et la microscopie confocale spinning Time-lapse disque peut être effectué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : imagerie 3D Time-lapse de phagocytose. (A) schéma montrant l’opsonisation de membrane plasmique colorée (rouge fluorescent) globules rouges humains (hRBCs) avec des anticorps de souris (m) anti-CD235a immunoglobuline G (mIgG) et la présentation des hRBCs marqués de macrophages de souris (Ms), étiqueté (vert fluorescent) avec vert fluorescent anticorps conjugué fluorophore anti-F4/80. (B) Images de Time-lapse (vues XZ), obtenues en faisant tourner la microscopie confocale disque, montrant la formation coupe phagocytaire et ingestion de mIgG-opsonized hRBCs. Echelle = 10 µm. (C) reconstructions 3D montrant des macrophages ingérant mIgG-opsonized hRBCs. Vues XZ correspondantes (pour 3 de la h) apparaissent en représentent des espacements B. grille 5,07 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Capture d’une particule par une filopodium. Images de Time-lapse, obtenue en faisant tourner la microscopie confocale disque, montrant un macrophage souris capture une immunoglobuline souris G (mIgG)-opsonisées humaine de globules rouges (GRH) via un filopodium (flèches dans le panneau du haut), une projection de doigt. Notez que les globules rouges perd sa crenations tôt au cours de la formation de coupe phagocytaire. De plus, la coupe phagocytaire semble se faufiler le globule rouge enveloppé (indiqué par des flèches dans le panneau inférieur). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
La grande majorité des dosages de phagocytose, surtout les point final et les essais de haut débit, ne fournit pas de visualisation de comment les particules sont effectivement capturés, enveloppés et ingérés. Pionnier dans l’étude de Munthe-Kaas et al. 10 et Kaplan2 dans les années 1970 ont suggéré que remarquablement différentes réorganisations du cytosquelette sont impliquées dans la phagocytose des IgG-opsonized contre les particules complément-opsonized (mouton culots globulaires). Nous décrivons ici les dosages de phagocytose tourne disque microscopie confocale permettant l’imagerie à haute résolution et en temps réel des événements phagocytaires uniques. Notre phagocyte modèle est la les macrophages péritonéaux résident de souris, qui peuvent être isolés avec manipulation minimale, et nous utilisons fraîchement isolées des globules rouges humains sous forme de particules. Toutefois, les dosages de phagocytose pourraient être appliqués aux autres phagocytes, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris ou neutrophiles, lignées cellulaires de souris macrophage, macrophages dérivés de monocytes humains ou neutrophiles du sang périphérique humain. Dans le cas des phagocytes humains ou neutrophiles souris, alternative anticorps fluorescent marqués serait nécessaire, comme anti-CD14 fluorescent étiquetés anticorps (monocytes/macrophages humains)16 ou des anticorps anti-Gr-1 (Ly - 6 G) (souris neutrophiles).
Unopsonized globules rouges humains, comme les globules rouges de mouton utilisée traditionnellement, sont inertes en ce sens que ces cellules sont pas (ou, du moins, très rarement) ingérés par les macrophages péritonéaux de souris. Ce qui assure, à la différence de billes de polystyrène, activité faible bruit de fond. Globules rouges humains peut être commodément opsonized avec immunoglobulines à l’aide de la souris IgG ou IgM anticorps monoclonaux contre CD235a (glycophorine A), un marqueur spécifique des érythrocytes humains (globules rouges) et de précurseurs érythroïdes17, 18. anti-souris fluorescent étiquetés IgG ou IgM Anticorps secondaires peuvent être appliquées dans des dosages parallèles, pour confirmer l’opsonisation. Les classes d’anticorps IgG et IgM sont hémagglutinines, substances (anticorps) qui causent des globules rouges à agglutiner. Pour éviter l’agglutination, on mélange par intermittence la suspension cellulaire au cours de la période d’incubation de 8 min avec anticorps anti-CD235a, et puis nous ajoutons la suspension mixte directement à une diapositive contenant des macrophages canal (enduit de la fibronectine diapositive) sans un pas de lavage . Pas de lavage impliquent de sédimentation des globules rouges par centrifugation, ce qui encourage vivement l’agglutination. Avant opsonisants globules rouges humains, nous étiquetons la membrane plasmique avec sonde fluorescente orange/rouge lipophile. Cette sonde est brillamment fluorescente au début des enregistrements Time-lapse, mais le signal disparaît peu à peu, probablement en grande partie en raison de photoblanchiment19. En outre, les macrophages et le revêtement de la fibronectine de la diapositive peuvent devenir faiblement orange/rouge fluorescent durant les enregistrements. Ce problème est probablement dû à un lavage insuffisant de globules rouges humains après marquage. Au lieu d’utiliser un marqueur de la membrane de plasma fluorescent lipophiles, globules rouges humains pourrait être étiquetés avec un dérivé rhodamine sensibles au pH à l’aide de son amine réactive succinimidyl ester15,20. Cela a l’avantage de permettre la visualisation de la maturation du phagosome puisque l’intensité de la fluorescence augmente avec la diminution de pH15,20, mais cette approche présente l’inconvénient que les préparatifs de réactif ester sont actuellement cher et instable après reconstitution en milieu aqueux.
IgG-opsonized globules rouges humains sont ingérés par l’intermédiaire de FcγRs, qui peut être confirmé à l’aide des macrophages péritonéaux isolé de NOTAM21 ou Fcer1g- / - (Fcer1g) souris. Les macrophages NOTAM lier IgG-opsonized globules rouges humains, mais n’ont pas ITAM (motif de l’activation basée sur tyrosine immunoreceptor) - mediated signaling nécessaire pour induire la phagocytose, tandis que les macrophages knockout Fcer1g n’expriment pas de surface FcγRs. IgG - ou IgM-opsonized globules rouges humains peuvent en outre être opsonized avec C3b (qui est clivé en iC3b) en incubant les cellules avec du sérum fraîchement isolé par un complément C5 null de souris (sérum sauvage provoque une hémolyse). Les opsonines IgG et IgM activent la cascade du complément classique, qui conduit à la formation des pores (complexe d’attaque membranaire) et la lyse cellulaire. Dans les souris dépourvues de complément C5, la cascade du complément procède pour compléter le clivage de C3, mais C5 convertase manque le substrat nécessaire pour catalyser la voie terminale. Nous avons développé des tests simples pour mesurer la cinétique de la cascade du complément. En bref, des globules rouges humains peuvent être conjointement étiquetées avec un rouge fluorescent, marqueur de la membrane plasmique et vert fluorescent, cytosolique fluorophore. Lors de la formation de l’attaque de membrane complexe, formé de composants complément C5-C9, le fluorophore cytosolique est rapidement (en secondes) perdu du cytosol. Visualisation de la fonction d’effecteur (cytolyse) de la cascade de complément a indiqué que les temps d’incubation de 4 min suffit pour C3b/iC3b opsonisation de globules rouges humains. Dans des essais parallèles, C3b/iC3b revêtement de globules rouges humains peut être facilement évaluée après avoir appliqué un mélange de C3b anti-souris et fluorescent étiquetée anticorps secondaires. Dans ce cas, un lavage est nécessaire pour éliminer les anticorps fluorescents non fixés. Bien que l’étape de lavage implique des cellules sedimentaion par centrifugation, ce qui favorise l’agglutination, opsonisation réussie peut être facilement évaluée par microscopie confocale. Phagocytose médiée par les récepteurs de complément peut être photographiée par chaque application IgG- / iC3b-opsonized de sang rouge humain cellules NOTAM ou Fcer1g- / - macrophages ou en introduisant des IgM- / iC3b-opsonized de sang rouge humain cellules aux macrophages sauvage. IgM-opsonized des cellules de sang ne sont pas reconnus par l’ITAM contenant FcγRs (FcγRI, FcγRIII et FcγRIV) requis pour la phagocytose de particules IgG-opsonized22.
Pour image phagocytaire des événements, la membrane plasmique des macrophages peuvent être étiquetés avec anticorps anti-F4/80 conjugué fluorophore fluorescent vert, qui sert également de marqueur spécifique des macrophages de souris. Globules rouges humains puissent être rendus rouge fluorescent par incubation avec un marqueur rouge/orange fluorescent plasmalemme, tel que discuté ci-dessus. Ce marqueur de la membrane plasmique lipophiles évite les effets confondants potentiels d’étiquettes à base d’anticorps. Rouges fluorescents globules rouges humains, avec ou sans l’opsonisation, peuvent être distribués directement dans le canal 100 µL d’une lame de canal et imagés Time-lapse 3D via un 60 X / 1,49 huile d’immersion (ou similaire) objectif effectuée à l’aide de la 488 nm et les 561 nm laser lignes , respectivement, d’un microscope confocal (ou similaire) à disque filature. Il est tentant pour optimiser le système d’imagerie à haute résolution, mais l’acquisition de répétées Z-piles de plus de 16 minutes ou phototoxicité et photoblanchiment considérable pourrait causer. Nous avons choisi d’utiliser 2 x 2 binning pour promouvoir les bons rapports signal-bruit et permettent des réductions dans l’intensité d’excitation et/ou des durées d’exposition, mais au détriment de la résolution optique. En outre, pour réduire la phototoxicité, nous ajoutons un charognard des espèces réactives de l’oxygène dans le milieu. Dans de futures études, les essais pourraient être modifiées pour l’image de la phagocytose des érythrocytes humains apoptotic. Application d’un ionophore2 + Ca, comme A23187, peut être utilisée pour induire la phosphatidylsérine externalisation23, un « mangez-moi » signal et caractéristique du début l’apoptose24,25.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions HA 3271/4-1 et HA 3271/4-2 de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) et la subvention FF-2016-05 de EXC 1003 (Cluster d’Excellence 1003), cellules en mouvement (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
- Tauber, A. I.
- Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
- Cooper, J. A.
- Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
- Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
- Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
- Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
- McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079 (2013).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016 (2016).
- Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
- Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
- Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
- Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
- Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
- Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708 (2017).
- Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).
