Summary
Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.
Abstract
Neurale stamcellen (NSCs) in het volwassen zoogdieren ruggenmerg zijn een relatief mitotically zwakke bevolking van periventricular cellen die kunnen worden bestudeerd in vitro met behulp van de bepaling van de neurosphere. Deze kolonie-vormende assay is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de reactie van NSCs op exogene factoren in een schotel; Dit kan echter ook worden gebruikt om te bestuderen van het effect van in vivo manipulaties met het juiste begrip van de sterke punten en beperkingen van de test. Een manipulatie van het klinische belang is het effect van letsel op de endogene activering van de NSC. Huidige modellen van dwarslaesie bieden een uitdaging om te studeren dit omdat de ernst van de gebruikelijke kneuzingen, compressie en transect modellen leiden tot de vernietiging van de NSC niche op de site van de schade waar de cellen van de stam woont. Hier beschrijven we een minimale schade-model dat gelokaliseerde schade aan het oppervlakkige dorsolateral oppervlak van de thoracale benedenverdieping (T7/8) van het ruggenmerg volwassen muis veroorzaakt. Dit letsel model spaart het centrale kanaal op het niveau van het letsel en vergunningen van de analyse van de NSCs die zich bevinden op het niveau van de laesie op verschillende tijdstippen na letsel. Hier, laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt om de activering van de twee afzonderlijke, lineally-gerelateerde, populaties van NSCs die zich in het ruggenmerg periventricular regio - primitieve en definitieve NSCs bevinden studie (pNSCs en dNSCs, respectievelijk). We laten zien hoe u kunt isoleren en cultuur van deze NSCs uit de regio van de periventricular op het niveau van het letsel en de witte stof letsel site. Onze ruggenmerg na chirurgische ontledingen Toon verhoogde aantallen van pNSC en neurospheres dNSC-afgeleid uit de periventricular regio van gewonde koorden in vergelijking met de besturingselementen, hun activering via letsel te spreken. Bovendien, naar aanleiding van schade, dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site schade — aantonen van het vermogen van NSCs om te migreren van hun periventricular-niche naar plaatsen van verwonding.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel bevat een subpopulatie van zichzelf vernieuwend, multipotente stamcellen die de capaciteit hebben om te leiden naar alle andere volwassen neurale cel typen1,2,3,4. Deze neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in gespecialiseerde niches in de hersenen en het ruggenmerg en kan worden geactiveerd na letsel te vermenigvuldigen, migreren en differentiëren in volwassen neurale cellen. NSCs en hun nageslacht is gebleken om te migreren naar de site van de schade in5,6van de modellen van de corticale schade. In de hersenen, NSCs gebleken voor het migreren van de laterale ventrikels op de site van schade waar ze onderscheiden in astrocyten die aan gliale litteken vorming7 bijdragen. In het ruggenmerg, echter zijn weinig studies gedaan om te vragen als deze dezelfde endogene NSCs kunnen worden aangewend ter bevordering van herstel na dwarslaesie. Inderdaad, er is momenteel een debat over de vraag of de activering van de pool van de cel van de stam in het ruggenmerg een directe fysieke schade van de niche van de periventricular voering van het centrale kanaal8 vereist of als de schade aan de spinal cord parenchym (verlaten van de stam cel niche intact) is voldoende om te activeren van endogene NSCs9.
Een aantal ruggenmerg letsel (SCI) modellen zijn gebruikt om te studeren de pathofysiologie van acute en chronische blessure. Deze modellen zijn ook gebruikt om te testen potentiële therapieën voor de behandeling van SCI via neuroprotectie, Immunomodulatie en ontwikkelende cel transplantatie/vervanging strategieën10,11,13. Huidige modellen bevatten compressie en/of kneuzingen verwondingen, die leiden grootschalige functionele tekorten evenals uitgebreide laesies en cavitations in het snoer14,15 tot. Resulterende gliale littekens kunnen verschillende spinale segmenten samen met de meerderheid van de breedte/omtrek van het ruggenmerg16beslaan. Dus, terwijl deze modellen klinisch relevante zijn, zij zich veroorloven grote uitdagingen aan het bestuderen van de reactie van endogene NSCs na verwonding. Er zijn chemische modellen van schade die kan worden aangepast als u de mildere vormen van schade die het centrale kanaal17kunt sparen. Echter dit soort schade zich richten op de demyelinisatie SCI is gekoppeld en niet klinisch relevante modellen voor de fysieke en/of mechanische schade in verband met traumatische SCI.
Om de beperkingen van de huidige modellen van de schade, hebben we een naald nummer minimale SCI model, oorspronkelijk ontwikkeld in de rat9, voor de toepassing in een volwassen muismodel aangepast. Ons model aangepast letsel kunt maken van een consistente laesie van de dorsolateral regio van het ruggenmerg muis en sparen van het centrale kanaal op het niveau van het letsel (s). Het voordeel van dit model is dat het mogelijk de studie van NSC kinetiek maakt na letsel en hun potentiële radiale migratie op de site van letsel. Het gebruik van een muismodel staat ook het gebruik van transgene muizen waarmee lineage opvolging van endogene NSCs en hun nakomelingen na letsel. De eigenschappen van NSCs kunnen verder worden beoordeeld met behulp van een aangepaste vorm van de in vitro neurosphere bepaling die in dit protocol is opgenomen.
De bepaling van de neurosphere is een in vitro kolonievormend test waarmee de isolatie van de NSCs in aanwezigheid van mitogenen. Bij klonen plating dichtheden vermenigvuldigen individuele NSCs om te leiden tot vrij zwevende sferische kolonies van cellen die bestaan uit een kleine populaties van NSCs en een overgrote meerderheid van de progenitoren18,19. In ons protocol, we laten zien van het isolement van twee verschillende, lineally-gerelateerde NSCs uit de streek van de periventricular van het ruggenmerg — onder basislijn voorwaarden en na onze minimale SCI-model. Definitieve neurale stengelgroenten uitdrukkelijke nestin van cellen (dNSCs) en de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) en zijn gegroeid in aanwezigheid van de epidermale groeifactor (EGF), fibroblast groeifactor (FGF) en heparine (samen genoemd EFH)20. Deze dNSCs zijn zeldzaam in het ruggenmerg naïef, die aanleiding geven tot zeer weinig neurospheres in vitro. Echter, laten we zien dat dNSCs worden geactiveerd na minimale SCI, uitbreiding van het aantal neurospheres van de periventricular regio21geïsoleerd. Primitieve neurale stamcellen (pNSCs) zijn voorafgaand aan de dNSCs in de bloedlijn van neurale stamcellen. pNSCs zijn uiterst zeldzaam, express lage niveaus van de pluripotent markering Oct4, en leukemie remmende factor (LiF) responsieve22. pNSCs vormen geen neurospheres wanneer geïsoleerd van het ruggenmerg volwassen muis als gevolg van de aanwezigheid van myeline basic protein (MBP) in primaire culturen; echter pNSC neurospheres kunnen worden geïsoleerd van MBP deficiënte muizen en hun nummers zijn uitgebreide volgende schade — vergelijkbaar met dNSCs21. Tot slot laten we zien dat dNSC afkomstige neurospheres kunnen worden geïsoleerd van de site van letsel bij vroege tijden na minimale SCI. Deze bevindingen tonen aan dat onze schade model en testen de kenmerken van de activering van periventricular NSCs zoals hun vermogen om te vermenigvuldigen en migreren in reactie op schade kunnen beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de Universiteit van Toronto en is in overeenstemming met de "gids voor de zorg en gebruik van proefdieren" (2nd Edition, Canadese Raad op Animal Care, 2017).
1. minimale Spinal Cord Injury chirurgie
Opmerking: Vóór de operatie, zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten en materialen zijn gesteriliseerd door passende methoden (figuur 1A).
- Bouwen een thoracale ondersteuning boog door 4 – 5 pleinen van gaas oprollen en taping ze samen in het midden te verkrijgen van een vaste rol van gaas.
- Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de inductie en initiëren van anesthesie met 5% Isofluraan. Het ontbreken van een teen snuifje reflex voordat u verdergaat, alsook tijdens de gehele procedure bevestigen. Zoals de operatie omhoog van 30 min beslag nemen kan, optimaliseren voor de minimale Isofluraan blootstelling (5 min 5%) en de resterende tijd op 2 – 3%.
- De muis naar een neus kegel gekoppeld aan de verdoving machine op de onderhoudsdosis van 2 – 3% Isofluraan overbrengen. Tondeuses vacht verwijderen uit het dorsum van het dier vanaf halverwege back-up naar de nek/oren bloot een breed rechthoekig gebied van huid voor chirurgie te gebruiken.
- De muis overbrengen in een stereotaxic instrument door het plaatsen van zijn neus in de bijgevoegde neus kegel en het stabiliseren van de schedel met oor bars. Isofluraan op 5% handhaven tijdens de plaatsing van de oor-bars en lagere terug tot 2-3%, zodra de muis is beveiligd in het stereotaxic apparaat.
- Preoperatieve pijnstillende medicijnen intraperitoneally beheren — Meloxicam (2,0 mg/kg). Royaal toepassing oog smering op de ogen open muis ter voorkoming van hoornvlies uitdroging als onder verdoving.
- Plaats de boog van de thoracale steun onder de buik van de muis terwijl strekken uit het lichaam van de muis en de wervelkolom door licht te trekken op basis van de staart. Laboratorium labeling tape kunt de staart en alle uitgebreide ledematen in een positie van de ster-achtige beveiligen. Eenmaal veilig, duwen de thoracale ondersteuning boog rostrally, uit de buik van de muis naar de bovenste thorax — om overeind de thoracale wervelkolom (figuur 1B).
- Bereid een steriele chirurgische veld door de bont-geknipt huidgebied bereid in stap 1.3 met 70% ethanol, gevolgd door Povidon-jodium te ontsmetten. Herhaal dit twee keer. Een steriele chirurgische gordijn zodat een brede steriel veld toepassen.
- Met behulp van een scalpel #10 mes, maken een verticale insnijding evenwijdig aan de lengteas van het dier vanaf halverwege beide schouderbladen de kromming van het thoracale wervelkolom. Intrekken van de huid om te bloot weke delen en de contour van de wervelkolom (Figuur 1 c).
- Het identificeren van de onderrand van de suprascapular vet pad (Dit kadert de T4/5 Vertebrale niveau). Met de dezelfde #10 mes, snijd zorgvuldig maar met kracht, langs beide zijden van de wervel bone T5-T8/9 loskoppelen van de pezen van de rug-spier uit de kolom.
- De tanden van het oprolmechanisme invoegen op de sites van de incisie aan weerszijden van de wervelkolom. De belichting aanpassen door OPROLMECHANISMEN te verheffen voldoende de wervelkolom zonder dat te veel spanning op de ingeklapte spier lagen (Figuur 1 d) uit te vouwen.
- Onder de chirurgische Microscoop, voorzichtig schoon de residuele spier en andere weke overliggende van de wervelkolom om het Vertebrale bot (figuur 1E) bloot te stellen. Het identificeren van de wervels die zal worden verwijderd door het proces van de spinous van de wervels omklemde met een getande Tang en iets omhoog verplaatsen en omlaag.
Opmerking: Dit moet toestaan van identificatie van lat. gewrichten en bloot de kleine openingen (lat. foramen) onder de wervels van belang. - Een hoofd van de gebogen afgestompte schaar invoegen aan weerszijden van de blootgestelde lat. foramen, caudal aan de Vertebrale lamina te worden weggesneden, en snijd de aansluitende lat. gewrichten bilateraal.
- Til de lamina omhoog en afgesneden van de bovenste bevestiging van de lamina te isoleren en te verwijderen van het bot.
Opmerking: Dit zal blootstellen de intact dural OSS met het ruggenmerg (figuur 1F). Kunnen er overmatig bloeden die kan worden gecontroleerd door het plaatsen van 1 x 1 cm gaas op de getroffen gebieden voorgesneden en/of wassen met steriel PBS. - Met de dorsale middellijn ader fungeren als een mijlpaal, plaatst u een 45° gebogen schacht van een 30 G naald tip (met naald schuine kant naar boven) in het dorsolateral oppervlak van het ruggenmerg (ongeveer 1 mm diep) op ongeveer 0,5 mm lateral aan weerszijden van de middellijn.
- Verplaats de naald ~ 2 mm van caudal naar rostraal (parallel aan de middellijn) zodat de gehele lengte van de schuine kant van de naald wordt ingevoegd aan het snoer. Verwijder de naald door het natrekken via het pad van binnenkomst (figuur 1G).
Opmerking: Er mag geen bloeden maar zwelling van de spinale weefsels kan worden gezien op deze stap. - Tot slot de wond Verwijder het oprolmechanisme en suture van de rugspieren aan weerszijden van de schade samen in de schouderstreek met behulp van een 6-0 absorbeerbare hechtdraad. Gebruik een 4-0 steriele zijde hechtdraad vervolgens sluiten de bovenliggende huid.
- Antibiotische zalf toepassen op de bovenkant van de oppervlakkige sutured huid ter voorkoming van postoperatieve infectie met behulp van het puntje van een wattenstaafje. Post-operatieve pijnstiller van 0,1 mg/kg van buprenorfine subcutaan samen met vloeistoffen (1 mL van de oplossing lactated Ringer's) beheren.
- Uitschakelen van de Isofluraan vaporizer en zuurstof. Verwijder de muis uit de stereotaxic apparaat en de plaats in een schone kooi met geen beddengoed.
- Plaats de muis in de kooi ongeveer 30 cm afstand van een warmte lamp voor herstel van anesthesie en monitor gedrag na wakker. De muis moet binnen 5-10 minuten wakker en hebben de hind-limb functie met mogelijke parese en/of zwakte van de staart bij het ontwaken.
- Monitor muisgedrag in de komende paar dagen en bieden goede post-operatieve zorg en pijnstillers (d.w.z., mash, lactated Ringer's oplossing vloeistof subcutane, 0,1 mg/kg buprenorfine 2 x dagelijks subcutaan voor 2-3 dagen, en het juiste gewicht controle ) conform lokale dier faciliteit verordeningen en op individuele basis als terugwinning kan variëren.
2. Neurosphere Assay dissectie
Opmerking: Volg juiste steriele weefselkweek procedures in.
- Enzymatische oplossing voorbereiding
- Voeg 32 mL van Earle's Balanced Salt oplossing (EBSS) toe aan de albumine ovomucoid remmer met glazen fles en zachtjes vortex tot het is opgelost.
- Voeg 5 mL EBSS tot een geportioneerde papaïne glazen ampul en plaats in een waterbad 37 ° C te ontbinden. De oplossing wordt duidelijk (oplossing 1).
- Neem 500 µL EBSS en toevoegen aan de geportioneerde DNase dat ik glazen flesje om te verkrijgen van een concentratie van 1 mg/mL (oplossing 2). Meng heel zachtjes door het kantelen van de flacon heen en weer en voeg 250 µL van dit mengsel op oplossing 1.
Opmerking: Alle oplossingen gemaakt (oplossing 1 en 2) zijn genoeg voor de verwerking van twee stukken van het weefsel. Als de verwerking meer stukken van weefsel, geschikt voor met meer oplossing prep.
- Weefsel voorbereiding en dissectie
- Plaats een laboratorium doekje gedrenkt in Isofluraan in de kooi van de muis en laat 2-3 min voor dampen naar volledig anesthetize muis. Volgende knock-out, verwijder de muis uit de kooi en bevestigen het ontbreken van een teen-snuifje reflex.
- Uitvoeren van cervicale dislocatie met een stomp metalen voorwerp (d.w.z., metalen kooi kaart) om te euthanaseren van het dier. Spray de euthanized dier uit zijn nek naar middenachter royaal met 70% ethanol.
- Aan de basis van de schedel, kunt schaar afgesneden het hoofd en gooi deze weg in een bio-zak. Maak een middellijn incisie in de huid langs de gehele lengte van de rug bloot de spier en vertebrale bot contour (figuur 2A).
- Til de mediale aspect van elke schouderblad (dwz., schouderblad — geïdentificeerd door de overliggende vet pad) en het gebruik van schaar te knippen weg weke delen (tussen scapulae en wervels). Aparte volledig om de onderliggende wervelkolom bloot te stellen.
- Na de kromming van de wervelkolom, hetzelfde paar van schaar invoegen de bovenste borstwervels diafragma en isoleren van de wervelkolom door het weg snijden bijgevoegde ribben, spieren en inwendige organen (figuur 2B).
- Schaar in de caudal Vertebrale foramen/opening invoegen en snijd de lat. gewrichten aan beide zijden van de laminae (dorsale oppervlak). Letten vooral geen schade toebrengen aan het intact snoer. Herhaal dit proces tot het gewenste niveau en/of lengte van het snoer is blootgesteld.
- Zorgvuldig gesneden de spinal nerve(s) uitbreiding lateraal van de koord voordat u overdraagt van het ruggenmerg weefsel in een petrischaal met regelmatige kunstmatige cerebrospinale vloeistof. Houd het monster op ijs (figuur 2C).
- Onder een Microscoop dissectie, snijd het ruggenmerg weefsel tot ~ 2 mm rostraal en caudal naar de site van de schade. Twee paren van pincet gebruiken om te voorzichtig het scheiden van het snoer in 2 helften lengterichting langs de dorsale en ventrale kloven (figuur 2C').
- Met microscissors, knip de gewonde dorsolateral witte stof. Plaats het stuk in een conische tube van 15 mL.
- Holding een helft van het ruggenmerg naar beneden met een tang, plagen en verwijderen van witte stof met behulp van een ander paar fijne pincet langs de omvang van de rostrocaudal van het ruggenmerg te isoleren van de gewenste periventricular-regio. Herhaal voor de andere helft van het ruggenmerg.
- Leg stukjes van periventricular weefsel in een aparte 15 mL conische buizen. Gebruik microscissors en zachtjes gehakt van het weefsel tegen de muren van de conische buisjes.
Opmerking: Weefsel dissociatie wijzigingen zijn van papaïne dissociatie systeem Protocol23 en procedures24van de voorbereiding van de eerder beschreven weefsel. - 2,5 mL nieuwe oplossing 1 (step 2.1.3) toevoegen aan het monster weefsel en plaats op een rocker bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Zachtjes triturate het weefsel in de oplossing met een 1.000 µL pipette uiteinde. Centrifugeer het bewolkt celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
- Oplossing 3 bereiden met 2,7 mL Earle's Balanced zoutoplossing, 300 µL van ovomucoid remmer oplossing (stap 2.1.1) en 150 µL van de DNase ik oplossing (stap 2.1.3).
- Verwijder het supernatant van stap (stap 2.2.13) en resuspendeer in 1,5 mL oplossing 3 in de vorige stap (stap 2.2.14).
- Deze nieuwe celsuspensie (stap 2.2.15) op de top van 5 mL van ovoimucoid remmer oplossing (stap 2.1.1) in een nieuwe conische tube van 15 mL maken een discontinue dichtheid verloop laag. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
- Verwijder supernatant en resuspendeer in 2 mL zuiver neurobasal media. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min op RT.
- Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 mL van neurobasal media. Het filteren van de opschorting met een 20 µm cel zeef gevolgd door 4 mL van media voor een totaal volume van 5 mL.
- Beplating
- Bereiden van voedingsbodems voor groei van de neurosphere door neurobasal media met epidermale groeifactor (20 ng/mL) aan te vullen / fibroblast groei factor (20 ng/mL) / heparine (2 µg/mL) [voor definitieve NSCs] of leukemina remmende factor (10 ng/mL) [voor primitieve NSCs]. Voeg 10 mL van beide media in een maatkolf van 25 mL weefselkweek.
- Een hemocytometer en de Trypan blauwe kleurstof gebruiken voor het berekenen van het aantal cellen in suspensie (stap 2.2.18) €25. Zodra berekend, cellen aan weefselkweek kolven bereid in (stap 2.3.1) toevoegen aan een klonale dichtheid van 10 cellen/µL en plaats weefselkweek kolf met toegevoegde cellen in de incubator gedurende 24 uur (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO2).
Opmerking: Een voorbeeld van het tellen techniek is als volgt: Neem 10 µL van de celsuspensie en meng met 10 µL van Trypan blauwe kleurstof. Voeg 10 µL van dit mengsel in een hemocytometer. Onder een 10 X lichte Microscoop, tellen het aantal levende cellen en alle cellen geteld onder 4 van de 4 x 4 kwadranten optellen. Gebruik de formule: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] te geven van de omvang van de celsuspensie te worden verguld in elke maatkolf van 25 mL weefselkweek om klonen dichtheid (10 cellen/µL). - Na 24u, zachtjes swirl van de kolf en giet inhoud in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min op RT.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1-2 mL verse neurobasal media.
- Herhaal stap 2.3.2 te tellen van het aantal cellen in de cellen van de opschorting en plaat bij klonen dichtheid in een 24-well weefselkweek plaat met 500 µL van hun respectieve mitogeen aangevuld media (EFH voor definitieve NSC groei) en LIF voor primitieve NSC groei.
Opmerking: Gebruik de aangepaste formule (5000 / [X cellen/4) x 2 x 10 x 1.000) voor het berekenen van het volume van de celsuspensie te worden verguld in elk putje met 500 µL van media. - Plaats de platen met cellen in de incubator (37 ° C, luchtvochtigheid van 95%, 5% CO2) groeien voor 7 dagen.
- Tellen
- Na 7 dagen in de cultuur, het verwijderen van platen en bekijken onder een lichte Microscoop. Kwantificeren van neurospheres door het tellen van de sferische kolonies die > 80 µm in diameter dNSCs culturen en > 50 µm diameter voor pNSCs culturen.
Opmerking: Indien gewenst, neurospheres kan verder gepasseerd26 of gedifferentieerd. Als cellen niet langer nodig zijn, beschikken over door de versnelde waterstofperoxide toe te voegen aan de putjes (ca. 1 mL) voor 20 min, zodat de kleur van het medium omslaat naar geel. Vervolgens Gooi.
- Na 7 dagen in de cultuur, het verwijderen van platen en bekijken onder een lichte Microscoop. Kwantificeren van neurospheres door het tellen van de sferische kolonies die > 80 µm in diameter dNSCs culturen en > 50 µm diameter voor pNSCs culturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de chirurgie, moeten de muizen ervaring minimale motor tekorten, die kunnen bestaan uit staart en mogelijk hind-limb parese gedurende maximaal 24 uur. Na deze tijd, moeten de muizen ervaring geen hind-limb verlamming en/of parese en minimale veranderingen in gang.
Figuur 3 toont representatieve resultaten van de neurosphere-bepaling 5 dagen na de minimale dwarslaesie. De absolute aantallen dNSC afkomstige neurospheres (gegroeid in EFH) groter is dan het aantal pNSC-afgeleide neurospheres (gegroeid in LIF) na blessure (figuur 3A en 3B, respectievelijk). Beelden met een hogere macht van een definitieve neurosphere (Figuur 3 c) en een primitieve neurosphere (figuur 3D) onthullen verschillen in het uiterlijk van deze verschillende kolonies met de definitieve neurospheres worden grotere diameter (≥80 µm) en meestal hebben een grote donkere centrum. Primitieve neurospheres zijn kleiner in grootte (≥50 µm) en de cellen zijn meer strak verpakt. Representatieve aantallen neurospheres die voortvloeien uit verschillende delen van de gewonde koord worden gezien in de 3E figuur (definitives) en 3F (primitieven). 3E figuur toont aan dat minimaal SCI een aanzienlijke stijging in neurospheres gegroeid van het centrale kanaal op het niveau van de schade veroorzaakt in vergelijking met een relatief bescheiden verhoging op de rostraal niet-verwonde snoer.
Interessant, kunnen de definitieve neurospheres van de site van laesie, een regio die geen neurosphere vormende cellen in laminectomie alleen muizen worden gegenereerd. Figuur 3F toont een vergelijkbare toename van de pNSCs na letsel met uitzondering van pNSC neurospheres op de site van de laesie. Vandaar, zijn alleen dNSCs kunnen migreren naar de site van letsel over deze tijd cursus na verwonding.
Figuur 1: chirurgische Procedure. (A) de indeling van alles nodig, genummerd voor verwijzing. (B) een beeld van de muis in een stereotaxic apparaat met een rechtgebogen lichaam, rug en ledematen verspreid en geplakt samen met thoracale ondersteuning boog Geplaatst onder. (C) A foto van de muis met een verticale huid incisie bloot de gespierde laag en de contour van de wervelkolom. (D) een foto van het lichaam van de muis na gespierd insnijdingen en blootstelling en isolatie van de wervelkolom met oprolmechanismen. Opmerking strak spier lagen met een gebrek aan scheuren. (E) A foto van de wervelkolom van de geïsoleerde muis met spier lagen verwijderd, tonen de benige oppervlak van de staartwervels (3 segmenten). Hieruit blijkt ook het spinous-proces en eventueel het lat. gewricht en lamina van middelste wervel worden verwijderd. (F) A foto van de zichtbare ruggenmerg na laminectomie. Het label is de dorsale middellijn ader. (G) A foto van de muis met bilaterale naald nummer verwondingen aan weerszijden van de dorsale middellijn ader. Er is een close-up invoegen van de 45° gebogen schacht van 30 G naald. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: ruggenmerg dissectie. (A) A foto van de onthoofde muis met de middellijn huid incisie bloot de rug spier en de Vertebrale bot contour-(B) een foto van de geïsoleerde wervelkolom, tonen rostraal en caudal oriëntatie. De tweede foto toont de isolatie van het snoer en de derde toont het geïsoleerde ruggenmerg in een petrischaal. (C) A grafische weergave van de fijne dissectie van het ruggenmerg, waar verschillende segmenten (periventricular, schade gebied) worden verwijderd en gescheiden voor kweken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger resultaten van neurosphere assay na minimale dwarslaesie. (A) het aantal dNSC-afgeleide neurospheres (gegroeid in EFH) gekweekt van de gewonde ruggenmerg is groter dan (B) het aantal pNSC-afgeleide neurospheres (geteeld in LIF) bij het uitplaten aan gelijke dichtheid. (C, D) Beelden met een hogere macht van de "typische" neurospheres (C) dNSC culturen en (D) pNSC culturen. (E) minimaal naald tract letsel resulteert in een aanzienlijke stijging van het aantal dNSC-afgeleide neurospheres van het centrale kanaal op het niveau van schade evenals het centrale kanaal rostraal van de schade, en van de schade-site. (F) pNSC afkomstige neurospheres kan niet kan worden geïsoleerd uit het ongedeerd snoer echter geïsoleerd na verwonding van het centrale kanaal (op het niveau van het letsel en van de rostraal centrale kanaal). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de chirurgische ingreep zijn er een paar kritische stappen waar de onderzoeker moet bijzondere aandacht besteden aan het verkrijgen van optimale resultaten en minimaliseren van de variabiliteit tussen de dieren. Wees voorzichtig met het geïnhaleerde anesthesie (Isofluraan) tijdens de operatie als de verdoving is aangetoond te hebben op neuroprotectieve effecten met langdurige blootstelling27. Dienovereenkomstig, bij de studie van het regeneratieve vermogen van het ruggenmerg na letsel, inspannen voor het uitvoeren van de operatie zo snel en efficiënt mogelijk om te voorkomen dat storende variabelen. Behoud van de dezelfde Isofluraan belichtingstijd per muis vermindert variabiliteit. Het ademhalingstarief van de muis moeten worden gecontroleerd tijdens de operatie en moet niet te langzaam (minder dan 1 adem elke 2-3-s) of zwaar moeizame (d.w.z., hijgend). De onderhoudsdosis van anesthesie kan ter voorkoming van overlijden ten gevolge van langdurige narcose met de opmerking van muizen die de lagere dosering ontvangen van 2 – 3% worden verlaagd.
Tijdens de operatie, neem extra verzorging bij het uitvoeren van gespierde insnijdingen aan weerszijden van de wervelkolom. Ervoor zorgen dat de bezuinigingen diep zijn, en het blad is mediaal schuin zodat de rand van het blad tegen de benige wervels tijdens gespierde insnijding ligt. Als het blad is schuin naar buiten, is er de mogelijkheid van excessief bloeden van vasculaire bezuinigingen. De onderzoeker moet ook extra aandacht besteden bij het uitvoeren van de laminectomie Voorkom diepe vissen van de schaar die schade zal toebrengen aan het ruggenmerg, waardoor ongewenste weefselschade en functionele tekorten. Het juiste besturingselement voor deze experimenten is een groep van "alleen laminectomie" (geen schade), waardoor een vergelijking van de activering van het NSCs toegeschreven aan de naald nummer schade in tegenstelling tot die, die uit de laminectomie alleen voortvloeien kan. We hebben aangetoond dat laminectomie alleen kan resulteren in een kleine, zij het niet significant toename NSC activering zoals geopenbaard door een toename van de neurosphere nummers uit de regio van de periventricular op het niveau van de laesie21. Laminectomie alleen veroorzaakt geen verhogingen in neurosphere nummers uit de periventricular regio rostraal of caudal aan de laminectomie en geen neurospheres zijn te vinden in culturen van witte stof geïsoleerd op het niveau van de laminectomie. Bovendien, bij het uitvoeren van de laminectomie, verzorgen de dorsale lamina verwijderen in een stuk dat brede blootstelling van het snoer. Dit zal (1) voldoende toegang tot de minimale naald spoor letsel van het dorsolateral ruggenmerg uitvoeren, en (2) voorkomen dat segmenten van bot worden achtergelaten en secundaire schade na sluiting en na herstel bewegingen van de muis. Als de hele lamina wordt niet beschouwd als een stuk, of segmenten van scherpe bot uitsteekt aan weerszijden van de laminectomie in acht worden genomen, gebruikt u instrumenten (zoals getande pincet en gebogen schaar) te verwijderen van deze fragmenten voorafgaand aan hechten.
De onderzoeker moet uiterst voorzichtig zijn bij de toepassing van hechtingen aan de gespierde laag tijdens de chirurgische sluiting. Een hechtdraad (dubbel-gevlochten) moet caudal tot het niveau van laminectomie/letsel worden geplaatst, zodat de hechtdraad op de top van het intact Vertebrale bot ligt. Dit is ter voorkoming van secundaire schade die uit de gespierde hechtdraad zijn in contact met het blootgestelde snoer voortvloeien kan wanneer de muis na herstel beweegt. Bovendien, de gespierde hechtdraad caudal tot de laminectomie/schade fungeert als een mijlpaal voor waar de SCI is uitgevoerd toen het ruggenmerg p.a. isoleren. Let erop als ontrafeling van het gewonde ruggenmerg gebied om te voorkomen dat de structuur van de benadeelde regio in gevaar te brengen, zodat het herkenbaar tijdens fijne dissectie onder de Microscoop ontleden blijft kan. Met betrekking tot de bepaling van de neurosphere is het belangrijk om uit te voeren van de mechanische verpulvering cel pellets voorzichtig om te voorkomen dat de productie van luchtbellen die celdood verhogen kunnen. pNSC-afgeleide neurospheres zijn nog gevoeliger aan vuil zwaar, groei omstandigheden — buitensporige verpulvering en langdurige blootstelling in enzymatische oplossingen — ten opzichte van dNSC culturen. pNSC afgeleid bollen zijn compacter en kleiner dan dNSCs. Gezien de zeldzaamheid van pNSCs, is het raadzaam ten minste 240.000 cellen per monster te isoleren.
De minimale SCI-model is ideaal voor het bestuderen van de cellulaire gebeurtenissen na schade (zoals activering van endogene NSCs), maar dit wordt niet toegestaan de studie van functionele beperkingen. Zoals eerder opgemerkt, muizen die van de schade van de track naald herstellen ervaar geen opmerkelijke gedrags tekorten die nog bestaan en als zodanig de muizen kunnen niet worden geëvalueerd voor de effectiviteit van therapeutische interventies ter verbetering van de functionele resultaten. Een belangrijk aspect van regeneratieve geneeskunde is dat een behandeling weefselherstel (die kan worden geëvalueerd aan de hand van dit model, in combinatie met de neurosphere assay, lineage tracering en immunohistochemistry/immunofluorescentie) niet alleen moet bevorderen maar relevante functionele verbetering met behulp van gedragsmatige paradigma's, indien van toepassing moet ook worden aangetoond. Een aantal gedrags taken gebruikt voor het testen van functionele uitkomsten in thoracale modellen van letsel, zoals de schuld van de voet-test en de Basso, Beattie, Breshnan (BBB) Open veld motorische schaal28, zijn niet gevoelig genoeg om te detecteren meetbare tekorten in onze minimale SCI model. Om te overwinnen deze tekortkoming, die men kan maken gebruik van meer gevoelige digitale scoren systemen (b.v., CatWalk) die meerdere parameters van grove en fijne motoriek van hind-limb parameters waaronder gait analyses, die de minimale detecteren kunnen maatregelen tekorten als gevolg van de minimale schade model29.
Deze methode kan ook worden aangepast om de studie van endogene activering van NSC als een mogelijke therapie in modellen van cervicale ruggenmerg letsel. Cervicale SCI is het meest klinisch relevante model en wij stellen voor dat dit model van de schade aan hogere Vertebrale segmenten aan te passen geven in of inzicht zou er zijn regionale verschillen in de reactie van NSCs en hun nakomelingen (kinetiek, migratie, differentiatie) en of de laesie zou resulteren in meer diepgaande en meetbare functionele tekorten. De momenteel gebruikte lymfkliertest cervicale letsel modellen (zoals transect, clip compressie en/of kneuzingen) vereisen intensieve post-operatieve zorg, met inbegrip van de noodzaak om handmatig uiten blazen en de ademhaling van de muis voortdurend te controleren. Aanpassing van het model van de minimale schade aan het cervicale ruggenmerg kan verminderen het sterftecijfer, de morbiditeit en de postoperatieve zorg geassocieerd met andere cervicale SCI-modellen, evenals toestaan een te onderzoeken van de effectiviteit van drugs/kleine moleculen en/of revalidatie resultaten op neurale herstel. Onze schade-model kan ook worden aangepast naar het maken van een minimale schade in verschillende delen van het koord (dat wil zeggen, dorsal of laterale kolommen) en/of grotere letsels met diepere penetratie en/of het gebruik van grotere formaat naalden (kleinere spoorbreedte). Hierdoor kan de onderzoeker controle/manipuleren het type en de grootte van de laesie en dus het evalueren van cellulaire en functionele/gedrags herstel dienovereenkomstig.
Het model van de minimale schade in muizen staat het gebruik van transgene diermodellen. De Muismodellen inschakelen labeling van endogene stamcellen en/of progenitoren voorafgaand aan de schade. Hierdoor kan de onderzoeker het lot van deze vooraf gelabelde cellen na letsel bijhouden en evalueren van neurale voorloper celproliferatie, migratie en differentiatie na letsel — potentieel bijdragen tot neurale reparatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door de Stichting Krembil (exploitatiesubsidie CMM). WX was de ontvanger van het Carlton Marguerite Smith student award. NL ontving een Graduate beurs van Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
